劉琦，張海洋，李雪晗，劉振，孫建安，毛相朝，2*

（1.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003）

磷脂（phospholipids，PLs）是生物體中生物膜的主要組成部分，可分為鞘磷脂、溶血磷脂和甘油磷脂[1]，甘油磷脂又可根據(jù)磷酸基團(tuán)極性頭基的不同，分為磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）等。迄今為止，PLs因其重要的營養(yǎng)和生物功能，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域[2-3]。

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是一類可以水解甘油磷脂的酶的總稱。這一類酶既可以催化PC水解為磷脂酸（phosphatidic acid，PA），也可以催化PC轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)得到新型磷脂[4]。PLD催化的磷脂?；粨Q反應(yīng)，可以將自然界中含量十分豐富的卵磷脂催化合成具有多功能性且純度高的稀有磷脂。PLD廣泛存在于微生物、哺乳動物和植物中[5]，與動植物來源的PLD相比，微生物來源的PLD催化性能高、純化工藝簡單、穩(wěn)定性強(qiáng)。目前已有大量微生物能夠異源表達(dá)PLD，如鏈霉菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌等[6-7]。其中，大腸桿菌仍然是磷脂酶異源表達(dá)的主要宿主，在所有宿主中約為86%[8]。

枯草芽孢桿菌是一種重要的原核表達(dá)宿主，其培養(yǎng)簡單快速，具有非致病性，被美國食品和藥品管理局認(rèn)定為安全菌株[9]。除此之外，它還具有一套完整高效的異源蛋白分泌表達(dá)體系，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)各種酶制劑。本課題組前期研究獲得了DNA改組后的重組酶PLDR34[10]，與親本酶相比，重組酶PLDR43的反應(yīng)速度和反應(yīng)效率均有大幅度提升，并通過Zhang等[11]的方法，利用PLDR43構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌。在此基礎(chǔ)上，本研究通過在轉(zhuǎn)錄水平比較不同啟動子的效果進(jìn)行工程菌改造，然后對工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對表達(dá)的PLD進(jìn)行轉(zhuǎn)磷脂酰活性檢測，為PLD的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞：北京天根生化科技公司；pMA5質(zhì)粒、枯草芽孢桿菌WB800：中國海洋大學(xué)海洋食品酶學(xué)與生化工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

核酸染料Redsafe：韓國iNtRON公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉：英國Oxiod公司；硫酸卡那霉素、Taq酶mix試劑盒：上海生工生物工程有限公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化科技有限公司；磷酸二氫鉀、甘油、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸銨（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽堿氧化酶（50 U）、過氧化物酶（100 U）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

Terrifie-Broth（TB）液體培養(yǎng)基：蛋白胨 12 g/L、酵母粉 24 g/L、甘油 4 mL/L、K2HPO40.72 mol/L、KH2PO40.17 mol/L，115℃滅菌30 min后備用。

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L，高壓滅菌條件相同。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～2.0%瓊脂粉，高壓滅菌條件相同。

1.1.4 儀器與設(shè)備

GI80TW型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司；HH-3A型水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；TGL16型離心機(jī)：長沙英泰儀器有限公司；WD-9405B型水平搖床、DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；MULTISKAN FC型酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；Mastercycler nexus型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：德國艾本德股份公司；SPX型生化培養(yǎng)箱：新江南儀器有限公司；LC-20AT型高效液相色譜儀、ELSD-16型蒸發(fā)光散射探測器：日本島津公司；F6/10型手持式高速勻漿機(jī)：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

以pMA5為模板，擴(kuò)增質(zhì)粒骨架，再利用SnapGene軟件進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增含有啟動子PHpaII、Pylb(F4)[12]、P2069m[13]、P43的 sfGFP-PLDR34目的基因。將基因片段和質(zhì)粒骨架的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物用無縫拼接試劑盒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并測序。然后將構(gòu)建成功的質(zhì)粒，通過Spizizen化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中表達(dá)。

把構(gòu)建好的4種工程菌（pMA5-PHpaII-sfGFP-PLDR34、pMA5-Pylb(F4)-sfGFP-PLDR34、pMA5-P2069m-sfGFP-PLDR34、pMA5-P43-sfGFP-PLDR34）在 50 mL LB 搖瓶發(fā)酵，12 h后測定酶活和菌濃度，選擇酶活最高的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.2.2 酶活及菌體濃度測定

取卵磷脂0.1 g，加入1 mL乙醚配制成100 mg/mL的溶液，加入9mL超純水，在勻漿機(jī)作用下形成乳濁液。取100 μL乳濁液置于1.5 mL離心管中，加入0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）10 μL、0.1 mol/L 氯化鈣溶液5 μL、15 μL 7.5% Triton X-100 和粗酶液 100 μL。立即置于37℃水浴中反應(yīng)20 min。加入含50 mmoL乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）20 μL，置沸水浴中5min終止反應(yīng)，冷卻至室溫25℃。加入1.0 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）200 μL（其中含有 100 U/mL 膽堿氧化酶、200U/mL過氧化酶、4-氨基安替比林200mg/mL、苯酚 50 mg/mL、Triton X-100 2 g/mL），置于 37℃水浴中3h。反應(yīng)后的混合液于12000r/min條件下離心2min，取上清于500 nm處測定吸光度[14]。

PLD酶活定義為在25℃、pH7.4條件下，以PC為底物，每分鐘水解釋放1 μmol膽堿所需要的酶量為一個酶活單位（U）。

菌體濃度的測定方法為取發(fā)酵液200 μL稀釋到合適的倍數(shù)后置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在波長600 nm處測定吸光度，記為OD600。

1.2.3 活化培養(yǎng)

取甘油管保存的重組枯草芽孢桿菌（WB800/pMA5-sfGFP-PLDR34），在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，在37℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行菌株活化后，挑LB固體培養(yǎng)基上的單一菌落于50 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h后即為種子液。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

通過前期研究，選擇碳源（無甘油的TB培養(yǎng)基為對照、葡萄糖、檸檬酸、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、甘油）、氮源[無蛋白胨和酵母粉的TB培養(yǎng)基為對照、硫酸銨、酵母粉+硫酸銨（質(zhì)量比2∶1）、硝酸銨、酵母粉、牛肉膏+硫酸銨（質(zhì)量比2∶1）、玉米漿干粉、豆粕粉、蛋白胨]、發(fā)酵時間（12、24、36、48 h）、發(fā)酵溫度（25、30、35、37、40 ℃）、接種量（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/dL）作為影響枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的主要因素。以TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，200 r/min、37℃培養(yǎng)12 h，通過單因素試驗(yàn)選擇Plackett-Burman試驗(yàn)的影響因素與水平。

1.2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，每個因素取高（1）低（-1）各兩個水平。綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以酶活為響應(yīng)值，從各個試驗(yàn)的最大響應(yīng)值前后選擇高低水平，設(shè)計(jì)N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)。探究各因素對枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的影響，分析試驗(yàn)結(jié)果中各因素的效應(yīng)值、方差及貢獻(xiàn)率，從中選擇出對酶活影響最顯著的3個因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)中的拐點(diǎn)為中心點(diǎn)，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選取對酶活影響最顯著的3個因素為試驗(yàn)因素，以PLD水解活力為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而確定最優(yōu)的試驗(yàn)條件，以獲得產(chǎn)PLD最高的培養(yǎng)基。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.2.7 磷脂酶D的轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)

將pMA5-PHpaII-sfGFP-PLDR34工程菌進(jìn)行500 mL LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵，離心后取上清凍干3 d為酶粉。采用雙相反應(yīng)體系合成磷脂酰葡萄糖苷（PtdGlc）、PS、PI、PG，將 50 mmol/L CaCl2和 1 mol/L 葡萄糖、L-絲氨酸、肌醇、甘油分別溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0），加0.5 U PLD 酶粉，于 40℃水浴振蕩反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后取上清進(jìn)行液相檢測。

1.2.8 轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)的測定

轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)生成的磷脂酰化合物，以及反應(yīng)體系中的PC由蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）高效液相色譜進(jìn)行檢測[15]。

式中：A為合成磷脂?；衔锏姆迕娣e；PA為磷脂酸峰面積；PC卵磷脂峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建

將構(gòu)建成功且無突變的重組質(zhì)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800中，然后接入到LB液體培養(yǎng)基表達(dá)，檢測不同啟動子對枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的表達(dá)效果，不同啟動子的工程菌OD600及PLD的水解活力如圖1所示。

圖1 4種啟動子產(chǎn)酶活測定Fig.1 Determination of enzyme production activity of four kinds of promoters

由圖 1 可知，B.subtilis來源的 PHpaII、Pylb(F4)、P43型啟動子中，酶活分別為 0.35、0.13、0.19 U/mL，說明 pMA5載體本身啟動子PHpaII的表達(dá)水平要遠(yuǎn)高于組成型啟動子P43和Pylb(F4)。短小芽孢桿菌（B.pumilus）來源的P2069m型啟動子的酶活為0.28 U/mL，略低于PHpaII型啟動子。B.pumilus與B.subtilis的遺傳背景相似，因此P2069m可以在B.subtilis中異源表達(dá)并且表達(dá)水平高于Pylb(F4)、P43型啟動子。為了更加高效地制備PLD，選擇酶活最高的工程菌WB800/pMA5-PHpaII-sfGFP-PLDR34進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源對重組菌和PLD酶活的影響

碳源對微生物的生長代謝至關(guān)重要，主要為細(xì)胞提供碳架及其生命活動所需要的能源[16-17]，不同微生物對碳源的利用程度都不一樣，因此需要找到一種最適合重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的碳源。不同種類的碳源對產(chǎn)PLD影響如圖2所示。

圖2 碳源種類對PLD酶活的影響Fig.2 Effects of carbon sources on PLD enzyme activity

由圖2可知，當(dāng)以甘油作為碳源時，酶活最高，并且此時菌體濃度也最高，可能是由于甘油的分子量較小，易于被菌株直接利用，直接參與多條代謝途徑。因此，甘油有利于菌體生長代謝，促進(jìn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD。

不同質(zhì)量濃度甘油對枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的影響如圖3所示。

圖3 甘油質(zhì)量濃度對PLD酶活的影響Fig.3 Effect of glycerol concentration on PLD enzyme activity

由圖3可知，在甘油質(zhì)量濃度為2.0 g/dL時，酶活達(dá)到最大值。隨著甘油質(zhì)量濃度的增加，酶活迅速降低，分析是由于過高的甘油濃度導(dǎo)致發(fā)酵液的黏度增大，溶氧降低，影響到枯草芽孢桿菌的生長代謝。因此甘油質(zhì)量濃度選擇2.0 g/dL為最佳濃度，并且選擇濃度1.6 g/dL為最低水平，2.4 g/dL為最高水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.2.2 氮源對重組菌和PLD酶活的影響

氮源主要用于微生物合成氨基酸等細(xì)胞物質(zhì)和含氮化合物[18]。不同種類的氮源對產(chǎn)PLD影響如圖4所示。

圖4 氮源種類對PLD酶活的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on PLD enzyme activity

由圖4可知，氮源對酶活的影響較大，當(dāng)酵母粉和硫酸銨作為復(fù)合氮源時，酶活最高，并且比各自作為唯一氮源的酶活和菌體濃度高?？赡苁怯捎诮湍阜蹫榭莶菅挎邨U菌提供一定的有機(jī)氮源、微量元素、維生素及氨基酸等。在硫酸銨和酵母粉的共同作用下能夠更好促進(jìn)枯草芽孢桿菌的生長，因此選擇酵母粉和硫酸銨作為最佳氮源，進(jìn)行最優(yōu)質(zhì)量濃度的研究。

不同酵母粉和硫酸銨的質(zhì)量濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的影響，結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 酵母粉質(zhì)量濃度對PLD酶活的影響Fig.5 Effect of yeast powder concentration on PLD enzyme activity

圖6 硫酸銨質(zhì)量濃度對PLD酶活的影響Fig.6 Effect of mass concentration of ammonium sulfate on PLD enzyme activity

由圖5、圖6可知，當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為2.0 g/dL、硫酸銨質(zhì)量濃度為0.8 g/dL時，酶活最高。因此將硫酸銨的質(zhì)量濃度為0.7 g/dL、酵母粉質(zhì)量濃度為1.8 g/dL作為最低水平，硫酸銨的質(zhì)量濃度為0.9 g/dL、酵母粉質(zhì)量濃度為2.2 g/dL作為最高水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.2.3 發(fā)酵溫度對重組菌和PLD酶活的影響

氧氣在培養(yǎng)基中的溶解度和傳播速率受到溫度的影響，進(jìn)而影響菌體生長和產(chǎn)酶的合成。隨著溫度的逐漸升高，酶促反應(yīng)速率增大，細(xì)胞代謝增強(qiáng)，但是溫度進(jìn)一步升高后，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)，核酸等）發(fā)生變性，細(xì)胞受到影響甚至死亡。發(fā)酵溫度對產(chǎn)PLD菌株的影響如圖7所示。

圖7 發(fā)酵溫度對PLD酶活的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on PLD enzyme activity

由圖7可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在25℃～30℃時，酶活維持在較低水平，當(dāng)溫度達(dá)到35℃以后酶活迅速增加，最終在37℃達(dá)到最大值。37℃以后，酶活開始下降，因此選擇37℃為最佳發(fā)酵溫度，并且選擇35℃為發(fā)酵溫度最低水平，39℃為最高水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.2.4 發(fā)酵時間對重組菌和PLD酶活的影響

發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌的生長和產(chǎn)PLD都有很大影響，發(fā)酵時間過短，菌體生長不充分從而導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低；發(fā)酵時間過長導(dǎo)致發(fā)酵副產(chǎn)物增多。發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌的影響如圖8所示。

圖8 發(fā)酵時間對PLD酶活的影響Fig.8 Effect of fermentation time on PLD enzyme activity

由圖8可知，在0～12 h，酶活迅速增加，12 h后，酶活緩慢降低，最終酶活在12 h達(dá)到最大值。因此選擇12 h為最佳發(fā)酵時間，并且作為Plackett-Burman試驗(yàn)的中心點(diǎn)，并且選擇10 h為發(fā)酵時間最低水平，14 h為發(fā)酵時間最高水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.2.5 接種量對重組菌和PLD酶活的影響

接種量能夠影響發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌的生長繁殖速度，但是較大的接種量會導(dǎo)致發(fā)酵過程中菌株繁殖過多，溶氧不足，產(chǎn)PLD的速度變慢。接種量對產(chǎn)PLD菌株的影響如圖9所示。

圖9 接種量對PLD酶活的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on PLD enzyme activity

由圖9可知，接種量對酶活影響不明顯，接種量在1.0 mL/dL～2.5 mL/dL時，酶活緩慢提升，當(dāng)接種量大于2.5 mL/dL時，酶活和菌體濃度緩慢降低。根據(jù)酶活大小，選擇2.5 mL/dL接種量為最佳接種量，并且選擇2.0 mL/dL接種量最低水平，3.0 mL/dL為最高水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)，篩選出接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）、酵母粉質(zhì)量濃度（D）、甘油質(zhì)量濃度（E）、硫酸銨質(zhì)量濃度（F）為枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的最關(guān)鍵因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示，各因素效應(yīng)分析和方差分析如表3所示。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Plackett-Burman design with experimental results

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)效應(yīng)分析Table 3 Effect analysis of independent variables in Plackett-Burman design

由表3可知，接種量、發(fā)酵溫度的效應(yīng)值為負(fù)，應(yīng)該減小其梯度；酵母粉質(zhì)量濃度、甘油質(zhì)量濃度、硫酸銨質(zhì)量濃度效應(yīng)值為正，應(yīng)該增加其梯度值。但是由于其梯度值過小，所以考慮成本和增加梯度值后的酶活提高幅度，決定維持現(xiàn)有梯度值。根據(jù)貢獻(xiàn)率大小，可知這5個因素對模型影響的大小順序?yàn)榻湍阜圪|(zhì)量濃度>甘油質(zhì)量濃度>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>硫酸銨質(zhì)量濃度>接種量。并且此次試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值為0.007 8達(dá)到了極顯著水平，說明用此模型模擬試驗(yàn)的結(jié)果是可信的。其中酵母粉質(zhì)量濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01），甘油質(zhì)量濃度和發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌產(chǎn)PLD的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05）。故選擇酵母粉質(zhì)量濃度、甘油質(zhì)量濃度和發(fā)酵時間3個關(guān)鍵因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。其余3個因素根據(jù)單因素最優(yōu)結(jié)果選取，即接種量2.5%、發(fā)酵溫度為37℃、硫酸銨質(zhì)量濃度為0.8 g/dL。

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示，回歸模型方差分析如表5所示。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Box-Behnken experiment with experimental results

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of the regression model

續(xù)表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 4 Box-Behnken experiment with experimental results

利用Design-Expert 10.0對表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到了酶活（Y）對發(fā)酵時間（G）、甘油質(zhì)量濃度（H）、酵母粉質(zhì)量濃度（I）的二元多項(xiàng)回歸模型方程為Y=0.81+0.027G-0.036H-0.041I+0.016GH+0.016GI+0.012HI-0.044G2-0.11H2-0.12I2。由方程的F值可知，影響PLD酶活因素的主次順序?yàn)榻湍阜圪|(zhì)量濃度>甘油質(zhì)量濃度>發(fā)酵時間。由表5可知，該回歸模型的P值為0.000 2，小于0.001，說明整體模型對試驗(yàn)結(jié)果具有極顯著的影響，并且有很高的可信度；失擬項(xiàng)的P值為0.153 2，大于0.05，因此失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，能夠接近真實(shí)的響應(yīng)曲面的結(jié)果，模型選擇較合適。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化分析與結(jié)果驗(yàn)證

為了更好地探究3個因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，采用Design-Expert 10.0軟件繪制三維響應(yīng)曲面圖以及相對應(yīng)的等高線圖。等高線圖可以直觀地反映兩因素交互作用的程度，橢圓形和等高線的間距密集表示兩因素作用顯著，圓形和等高線的間距稀疏表示兩因素作用不顯著，各因素相互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖見圖10。

圖10 各因素相互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.10 Contour diagram and response surface diagram of interaction of various factors

如圖10所示，（a）、（b）等高線圖近似為橢圓形但其間距較為稀疏，（c）等高線圖近似為圓形并且間距也稀疏。再結(jié)合方差分析中的結(jié)果GH交互的P值為0.2899，GI交互的P值為0.281 0，HI交互的P值為0.435 6均大于0.05，由此可知三因素兩兩交互雖有一定的規(guī)律但并不顯著。結(jié)合擬合的二元多項(xiàng)回歸方程可知，方程中的二次項(xiàng)系數(shù)全都是負(fù)數(shù)，可以看出該方程的拋物面開口向下，有極大值點(diǎn)存在。利用Design-Expert 10.0進(jìn)行分析計(jì)算，得出PLD產(chǎn)量最高的發(fā)酵條件為發(fā)酵時間12.5 h，甘油質(zhì)量濃度為1.94 g/dL，酵母粉質(zhì)量濃度為1.93 g/dL，此時酶活為0.82 U/mL。在上述條件下，進(jìn)行3次發(fā)酵試驗(yàn)，以此檢驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的可靠性。驗(yàn)證試驗(yàn)中，PLD的平均產(chǎn)量為0.85 U/mL，與預(yù)測值擬合度達(dá)96.34%，說明該優(yōu)化模型可靠。并且比出發(fā)菌株的酶活（0.52 U/mL）提高62.5%。

2.6 磷脂酶D的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)及產(chǎn)物分析

PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；Y(jié)果見圖11。

圖11 PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；Y(jié)果Fig.11 Transphosphatidylation results of PLD

由圖11可知，在雙相反應(yīng)體系中，以環(huán)戊基甲醚作為有機(jī)相時，PC幾乎完全轉(zhuǎn)化為PS、PtdGlc、PG，轉(zhuǎn)化率分別為94.0%、94.8%、87.1%，水解副產(chǎn)物PA分別為5.65%、2.37%、0.13%，底物PC殘留分別為0.34%、2.83%、12.94%。合成PS反應(yīng)過程中，底物幾乎完全反應(yīng)，并且反應(yīng)的水解副產(chǎn)物含量也較低；合成PtdGlc時，底物雖略有剩余但水解副產(chǎn)物更低，可能是由于絲氨酸的分子量低于葡萄糖的分子量，并且絲氨酸結(jié)構(gòu)較葡萄糖也更簡單，更容易進(jìn)入酶的催化口袋，所以合成PS比PtdGlc底物殘留更少，反應(yīng)更加徹底。合成PS時水相的PLD接觸有機(jī)相的PC的概率更大，當(dāng)合成反應(yīng)基本達(dá)到平衡時，催化其水解生成更多的PA。雖然PG的轉(zhuǎn)化率不高，但是其反應(yīng)的水解副產(chǎn)物含量很低，可能是由于甘油使水相的黏度增大，導(dǎo)致在搖床振蕩過程中水相和有機(jī)相的接觸不充分。除此之外，由于PI的肌醇分子量過大無法直接進(jìn)入PLD的底物結(jié)合口袋[19-20]，導(dǎo)致無法催化PC合成PI。能夠以較高的轉(zhuǎn)化率合成PS、PtdGlc、PG，說明了該條件下制備的PLD在合成小分子底物水平上有較出色的轉(zhuǎn)磷脂酰化活性。

3 結(jié)論

本研究以枯草芽孢桿菌為宿主，PHpaII為啟動子，表達(dá)了一個經(jīng)過DNA改組后的重組酶PLDR34。分別從碳源種類和質(zhì)量濃度、氮源種類和質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量對該菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)接種量為2.5 mL/dL、發(fā)酵溫度為37℃、硫酸銨質(zhì)量濃度為0.8 g/dL、發(fā)酵時間12.5 h、甘油質(zhì)量濃度為1.94 g/dL，酵母粉質(zhì)量濃度為1.93 g/dL，在此發(fā)酵條件下PLD酶活達(dá)到0.85 U/mL。此外，還利用雙相反應(yīng)體系以94.0%、94.8%和87.1%的轉(zhuǎn)化率高效合成了PS、PtdGlc、PG。但是由于肌醇的分子量過大，無法進(jìn)入PLD的催化口袋，導(dǎo)致無法合成PI。本研究以食品安全級表達(dá)菌株枯草芽孢桿菌為宿主，利用啟動子工程和發(fā)酵工程策略，提升PLD的表達(dá)水平，表達(dá)的PLD有良好的轉(zhuǎn)磷脂?；盍?。為酶法合成新型稀有磷脂和功能性磷脂提供了一定的參考，也為PLD的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。