鈕燕，朱靜，嚴(yán)久瓊

海軍官兵尤其是艦艇部隊(duì)及登陸作戰(zhàn)官兵在發(fā)生開放性外傷的同時(shí)，往往面臨著傷口被海水浸泡的問題。目前開放性外傷治療上最大難題是感染，因?yàn)楹Ｋ写嬖诙喾N致病菌，開放性外傷經(jīng)海水浸泡后細(xì)菌入侵和增殖，往往會(huì)加重感染的嚴(yán)重程度，甚至發(fā)生膿毒血癥［1］。膿毒血癥患者常伴隨著許多代謝改變，包括胰島素抵抗和高血糖等，這些代謝改變會(huì)加劇感染，延緩疾病的恢復(fù)等［2-3］。膿毒血癥作為一種重大疾病，應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖很常見，并且與患者預(yù)后相關(guān)［4-5］。此外，應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等機(jī)制降低心臟功能，而采用胰島素治療降低應(yīng)激性高血糖可以改善心臟功能，但是有研究報(bào)道重癥膿毒血癥患者采用胰島素強(qiáng)化降糖治療會(huì)增加患者低血糖等不良事件的風(fēng)險(xiǎn)［6］。因此，開發(fā)有效降低應(yīng)激性高血糖但又不會(huì)引起低血糖的治療策略對(duì)膿毒血癥患者心臟功能保護(hù)具有重要的意義。

鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑（sodium glucose cotransporter 2 inhibitors，SGLT2i）是首個(gè)有效減少2 型糖尿病患者心力衰竭和心血管死亡的降糖化合物，SGLT2i 被明確用于抑制腎臟中的鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT2）［7］。最近大量研究表明，SGLT2i——恩格列凈（empagliflozin, Empa）對(duì)各種類型的心臟細(xì)胞和心臟功能具有直接作用，Empa在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后能夠維持細(xì)胞活力和腺苷三磷酸（ATP）含量，從而恢復(fù)高血糖和腫瘤壞死因子（TNF）-α 刺激的主動(dòng)脈環(huán)和高血糖內(nèi)皮細(xì)胞的血管反應(yīng)性［8-9］。在離體的小鼠心臟中，Empa 可以誘導(dǎo)血管舒張［10］。在離體心臟的缺血再灌注研究中，Empa 在缺血期間能夠延遲攣縮的發(fā)展，并在缺血后增加線粒體呼吸［11］。由此可見，Empa 對(duì)心臟具有廣泛的保護(hù)作用，但是Empa 通過何種機(jī)制改善細(xì)菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的高血糖和心臟功能障礙尚未明確。

既往研究報(bào)道，心臟中不存在SGLT2 的表達(dá)，提示Empa 改善LPS 誘導(dǎo)的心臟功能障礙并非直接通過作用于SGLT2 而發(fā)揮效應(yīng)［12-13］。LPS 是革蘭氏陰性菌血癥和膿毒血癥引起的許多宿主反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，可誘導(dǎo)許多參與免疫、炎癥和急性期反應(yīng)的基因［14］。這些基因中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）與膿毒血癥和內(nèi)毒素血癥等有害宿主的反應(yīng)有關(guān)。敲除iNOS 的小鼠對(duì)LPS 誘導(dǎo)的低血壓有抵抗力［15］。與iNOS 基因敲除小鼠的數(shù)據(jù)一致，iNOS 抑制劑氨基胍可降低野生型小鼠注射LPS 后的死亡率［16］。本研究旨在探討Empa 通過抑制iNOS 改善LPS 誘導(dǎo)的高血糖和心臟功能障礙。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200～250 g，購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0012］。SD 大鼠飼養(yǎng)在氣溫恒定為25°C 的動(dòng)物房，并以12/12 h 的明暗循環(huán)照明。SD 大鼠可自由獲取標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料以及隨意飲水。本研究方案得到海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均接受了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的評(píng)估和認(rèn)證。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和分組 20 只SD 大鼠隔夜禁食18 h 后，按數(shù)字表法隨機(jī)分為4 組，每組5 只，分別腹腔注射單純生理鹽水（NS）、Empa、LPS、LPS 聯(lián)合Empa（LPS+Empa）。LPS 溶液給藥劑量20 mg/kg，LPS 來源于055：B5 血清型大腸桿菌（Sigma，美國(guó)），0.25 g LPS 溶解于100 ml 生理鹽水中，根據(jù)大鼠體重，按照8 ml/kg 的LPS 溶液腹腔注射［17］；Empa（Sigma）給藥劑量5 mg/kg，0.062 5 g Empa 溶解于100 ml 生理鹽水中，根據(jù)大鼠體重，按照8 ml/kg 的Empa 溶液腹腔注射［18］。

1.3 血糖測(cè)量 大鼠分別于腹腔注射后0、60、120、180 和240 min 從尾靜脈獲取血樣，通過Elite血糖儀（Bayer，Elkhart，IN）測(cè)量血糖。

1.4 心臟功能 通過心室內(nèi)插管，測(cè)量SD 大鼠左心室舒張末期壓力（LVEDP）、壓力變化最大上升速率（+dP/dt）和最大下降速率（?dP/dt），由左心室壓力變化來評(píng)估心臟功能［19］。簡(jiǎn)要步驟如下：SD 大鼠腹腔注射造模完成240 min 后，稱重，腹腔注射尿脂800 mg/kg 和α-氯醛糖40 mg/kg 的混合麻醉液，麻醉大鼠。固定動(dòng)物，備皮，在頸部正中切口，逐層暴露頸部肌肉和氣管，鈍性分離氣管，插入氣管插管，固定氣管插管，保持大鼠氣道通暢。鈍性分離大鼠右側(cè)頸部肌肉，暴露頸動(dòng)脈鞘，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入PE 動(dòng)脈插管，通過PowerLab 生物信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄大鼠頸總動(dòng)脈血壓。穩(wěn)定后，繼續(xù)插入動(dòng)脈插管，深度為3.5～4.0 cm，當(dāng)觀察到血壓波形脈壓差增大，表明動(dòng)脈插管已經(jīng)進(jìn)入左心室，等波形穩(wěn)定后，連續(xù)記錄左心室內(nèi)壓力10 min，計(jì)算LVEDP、+dP/dt 和?dP/dt，心功能指標(biāo)記錄結(jié)束后，過量麻醉使大鼠安樂死，取出心臟，清除血液，液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱，待用。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)心臟組織iNOS 蛋白表達(dá) 剪取心尖處100 mg 的心臟組織，液氮處理后研磨組織塊，按照說明書比例，加入RIPA 裂解液（P0013B，碧云天生物科技有限公司），提取大鼠心臟總蛋白，4 ℃靜置10 min 后，3 000 r/min 離心提取上清，離心半徑為5 cm，通過BCA 法測(cè)定上清液的蛋白濃度。按照終濃度為4 μg/μl 加入蛋白變性上樣緩沖液，變性10 min，備用。處理好的心臟蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，通過轉(zhuǎn)膜、封閉和洗膜，加入iNOS 一抗（ab178945，英國(guó)Abcam 公司），一抗孵育濃度為1∶1 000，以GAPDH 作為內(nèi)參，4 ℃孵育一抗，過夜，洗膜后，室溫孵育二抗1.5 h，洗膜后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶，并采用Gel-Pro Analyzer 1 軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.6 Elisa 檢測(cè)心臟組織中一氧化氮（NO）水平如1.5 實(shí)驗(yàn)中提取心臟組織，獲取組織上清液，通過BCA 試劑盒測(cè)定所有樣本上清液的蛋白質(zhì)水平。采用總NO 檢測(cè)試劑盒（碧云天公司，S0023），通過心臟組織中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量來反映心臟樣本中NO 的水平。按照總NO 檢測(cè)試劑盒操作說明書，簡(jiǎn)要步驟如下：配制NADPH、標(biāo)準(zhǔn)品等試劑待用。按說明書加樣順序往96 孔板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品以及實(shí)驗(yàn)所需的試劑進(jìn)行檢測(cè)，加樣結(jié)束后，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm 處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣本硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，最后用硝酸鹽和亞硝酸鹽含量與相應(yīng)樣品蛋白濃度的比值來反映各心臟樣本的NO 水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，呈現(xiàn)正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。各組大鼠處理后不同時(shí)間點(diǎn)血糖水平采用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組心功能、iNOS 蛋白表達(dá)和NO 水平的差異采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，組間差異采用采用Tukey 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 為0.05。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)血糖水平 尾靜脈取血進(jìn)行血糖水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與同時(shí)間點(diǎn)NS 組相比，LPS 組在腹腔注射后60、120 和180 min 血糖水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與LPS 組比較，LPS+Empa 組在60 min 和120 min 血糖水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈血糖水平比較（mmol/L，± s，每組n=5）

表1 各組大鼠腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈血糖水平比較（mmol/L，± s，每組n=5）

注：與NS 組比較aP＜0.05；與LPS 組比較bP＜0.05。NS 為生理鹽水，Empa 為恩格列凈，LPS 為脂多糖

LPS+Empa 組3.6±0.3 5.5±0.4b 5.1±0.3b 4.3±0.5 3.5±0.2時(shí)間0 min 60 min 120 min 180 min 240 min NS 組3.7±0.4 3.6±0.3 4.0±0.5 3.3±0.1 3.7±0.2 Empa 組3.6±0.2 3.4±0.2 3.7±0.3 3.4±0.3 4.3±0.3 LPS 組3.4±0.3 6.3±0.5a 6.9±0.3a 4.5±0.5a 3.5±0.4

2.2 大鼠心功能指標(biāo) 心功能檢測(cè)指標(biāo)顯示，與NS 組相比，LPS 組LVEDP 和?dP/dt 顯著升高，+dP/dt顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與LPS 組比較，LPS+Empa 組LVEDP、+dP/dt 和?dP/dt顯著改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（± s，每組n=5）

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（± s，每組n=5）

注：與NS 組比較aP＜0.05；與LPS 組比較bP＜0.05。+dP/dt 為心室壓力變化最大上升速率，?dP/dt 為心室壓力變化最大下降速率，LVEDP 為左心室舒張末期壓力，NS 為生理鹽水，Empa 為恩格列凈，LPS 為脂多糖

LPS+Empa 組6 519±442b?6 760±631b 10.8±1.6b項(xiàng)目+dP/dt（mmHg/s）?dP/dt（mmHg/s）LVEDP（mmHg）NS 組9 193±720?8 811±906 2.2±1.0 Empa 組8 390±232?8 802±1 003 4.0±0.7 LPS 組4 919±345a?4 942±629a 14.1±1.5a

2.3 大鼠心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO 水平 與NS組相比，LPS 組心臟組織中iNOS 蛋白表達(dá)和NO 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與LPS組比較，LPS+Empa 組心臟組織中iNOS 蛋白表達(dá)和NO水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1 和表3。

表3 各組大鼠心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO 水平比較（± s，每組n=5）

表3 各組大鼠心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO 水平比較（± s，每組n=5）

注：與NS 組比較aP＜0.05；與LPS 組比較bP＜0.05。NS 為生理鹽水，Empa 為恩格列凈，LPS 為脂多糖，iNOS 為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，NO 為一氧化氮

LPS+Empa 組1.35 ± 0.14b 3.92 ± 0.34b項(xiàng)目iNOS 蛋白NO（μmol/g）NS 組1.00 ± 0.21 1.79 ± 0.30 Empa 組0.89 ± 0.12 1.90 ± 0.51 LPS 組1.76 ± 0.14a 5.48 ± 0.75a

圖1 各組大鼠心臟組織中iNOS 蛋白表達(dá)條帶

3 討論

膿毒血癥是宿主對(duì)感染或損傷的全身性有害反應(yīng)，是導(dǎo)致經(jīng)海水浸泡外傷的海軍官兵感染和死亡的主要原因。盡管發(fā)展為膿毒血癥的患者的住院死亡率在膿毒癥生存運(yùn)動(dòng)指南推出后的2 年內(nèi)從37%下降至30.8%，但死亡率仍然很高［20］。2012 年，一項(xiàng)關(guān)于膿毒血癥負(fù)擔(dān)的全球研究估計(jì)，嚴(yán)重膿毒血癥患者的死亡率接近50%［21］。心血管功能異常在膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。大量研究表明，心臟功能障礙是膿毒血癥患者常見的臨床表現(xiàn)，其中大約50%的膿毒血癥患者具有心臟功能障礙的跡象［22-23］。然而，膿毒血癥誘導(dǎo)的心臟功能障礙的確切機(jī)制仍未明確。本研究以LPS 誘導(dǎo)膿毒血癥為模型，發(fā)現(xiàn)SGLT2i——Empa 可顯著改善LPS 誘導(dǎo)的心臟收縮和舒張功能，并伴隨心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO 產(chǎn)生的改善，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

基于動(dòng)物研究，關(guān)于膿毒血癥誘導(dǎo)的心臟功能異常的病理機(jī)制的可能假設(shè)是冠狀動(dòng)脈血流量不足導(dǎo)致的整體心肌缺血［24-25］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，伴有心肌功能障礙的感染性休克患者冠狀動(dòng)脈血流量正?；蛟黾樱?6］，反駁了上述假設(shè)。此外，一些研究表明，由于冠狀動(dòng)脈血流分布明顯不均、內(nèi)皮損傷、血管內(nèi)纖維蛋白沉積和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，膿毒血癥期間伴有心臟微循環(huán)障礙，可能導(dǎo)致局灶性心肌缺血和心功能下降，但沒有心肌缺氧的證據(jù)［27-29］。這些研究結(jié)果表明冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變?cè)谀摱狙Y誘導(dǎo)的心臟功能異常的病理生理學(xué)機(jī)制中不太重要。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)膿毒血癥過程中伴隨著高血糖，而采用Empa 可以改善LPS 誘導(dǎo)的高血糖，顯著改善心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO 產(chǎn)生，這些結(jié)果提示Empa 可以較好地控制LPS 誘導(dǎo)的應(yīng)激性高血糖并改善心臟功能。

在膿毒血癥期間，各種病原體相關(guān)分子模式（PAMP），如LPS 以及內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMP），包括高遷移率族框1（HMGB1）和細(xì)胞外組蛋白；其與免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞上的Toll 樣受體（TLR）相互作用，除TLR3 外，所有TLR 均通過骨髓分化因子88（MyD88）依賴性途徑發(fā)出信號(hào)并激活c-Jun N 末端激酶（JNK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和轉(zhuǎn)錄因子核因子（NF）-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6 和TNF-α［30-31］。這些物質(zhì)被認(rèn)為是心肌抑制因子，包括TNF-α、IL-1、IL-6、補(bǔ)體過敏毒素（C5a）和LPS 等，最終參與了膿毒血癥誘導(dǎo)的心臟功能異常。有研究表明，激活心肌細(xì)胞α1-腎上腺素能受體可抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞TNF-α 的表達(dá)，改善膿毒血癥期間的心功能不全［32］。此外，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)阻斷α2-腎上腺素能受體可以抑制膿毒血癥動(dòng)物的心肌TNF-α、iNOS 表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡和心功能不全［33］。在炎癥反應(yīng)中，iNOS 表達(dá)可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO，因此，本研究檢測(cè)心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO水平，并發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)的膿毒血癥大鼠心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO 水平顯著升高，而Empa 可以改善LPS 誘導(dǎo)的這些改變，并伴隨著心臟功能的改善。但是，本研究存在不足之處是在評(píng)估大鼠心功能時(shí)采用了有創(chuàng)的心內(nèi)導(dǎo)管記錄心室內(nèi)壓力的變化，并未進(jìn)一步開展無創(chuàng)大鼠心臟超聲檢查以及心肌組織病理學(xué)形態(tài)評(píng)估。

膿毒血癥作為一種重大疾病，應(yīng)激誘導(dǎo)的高血糖很常見，并且與患者預(yù)后相關(guān)。本研究采用腹腔注射LPS 誘導(dǎo)膿毒血癥，發(fā)現(xiàn)LPS 可顯著誘導(dǎo)血糖升高，而Empa 可以降低LPS 誘導(dǎo)的高血糖，提示應(yīng)激性高血糖可能與膿毒血癥誘導(dǎo)的心臟功能異常相關(guān)。目前研究認(rèn)為心臟組織中并不存在Empa 直接作用的SGLT2，而大量研究報(bào)道Empa可以改善心衰和糖尿病患者心臟功能［34］，這些結(jié)果表明Empa 可以不直接通過作用于SGLT2 而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)Empa 可以改善LPS 誘導(dǎo)的iNOS 表達(dá)和NO 水平，提示Empa 可能通過iNOS 參與改善膿毒血癥誘導(dǎo)的心臟功能異常。

綜上所述，Empa 可以改善LPS 誘導(dǎo)的心臟功能異常，其機(jī)制可能通過與改善高血糖，降低心臟組織中iNOS 表達(dá)和NO 水平有關(guān)。