王英浩，滿家銀，張?zhí)蚁?，練春蘭

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)森林共生生物學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002；3.東京大學(xué)亞洲自然環(huán)境科學(xué)中心，日本 東京 188-0002）

0 引言

【研究意義】正紅菇（Russula griseocarnosa）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），紅菇目（Russulales），紅菇科（Russulaceae），紅菇屬（RussulaPers.），又名灰肉紅菇、大紅菌、紅錐菌、真紅菇，是一種野生的可食用的珍貴外生菌根真菌，一年出菇2 茬，一般發(fā)生在每年農(nóng)歷4 月中旬至5 月中旬和農(nóng)歷8 月中旬至9 月中旬，出菇地點(diǎn)相對(duì)固定，俗稱“菇位”[1]。由于正紅菇對(duì)其生長環(huán)境條件要求極為苛刻，目前尚無法進(jìn)行人工培育[2]。土壤中的微生物可以調(diào)控外生菌根及其子實(shí)體的形成[3-6]，能促進(jìn)外生菌根形成的微生物被稱為菌根促生菌（Mycorrhization helper bacteria，MHB）[7]，這些微生物對(duì)菌根的形成具有重要的影響，尤其是在促進(jìn)菌根真菌菌絲生長和提高菌根侵染率等方面[8-10]。正紅菇菌根根際是正紅菇菌根形成以及正紅菇子實(shí)體分化和生長的重要場(chǎng)所。研究正紅菇菌根根際土壤細(xì)菌多樣性對(duì)篩選正紅菇菌絲體生長和子實(shí)體形成分化的菌根促生菌具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，學(xué)者對(duì)正紅菇的研究主要集中在林分組成和土壤理化性質(zhì)等對(duì)紅菇生長的影響等方面[11-13]，正紅菇菌根根際土壤微生物的研究主要是利用變性梯度凝膠電泳分析[14,15]和通過高通量測(cè)序[16]的方法來開展的。有研究表明，通過高通量測(cè)序顯示出高豐度的細(xì)菌與可培養(yǎng)的方法獲得的細(xì)菌存在顯著的差異，并且可培養(yǎng)的方法可以獲得一些高通量測(cè)序顯示的較低豐度的細(xì)菌[17]。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)正紅菇菌根根際微生物分離培養(yǎng)是篩選正紅菇菌根輔助細(xì)菌的關(guān)鍵一步，目前采用分離培養(yǎng)的方法對(duì)正紅菇菌根根際土壤細(xì)菌的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以正紅菇菇位土壤為研究對(duì)象，通過純培養(yǎng)與16S rRNA 基因序列相結(jié)合的方法對(duì)正紅菇菇位土壤內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，分析正紅菇菇位細(xì)菌群落組成與多樣性，及該群落中物種間的網(wǎng)絡(luò)相互作用，為篩選促進(jìn)正紅菇菌絲體生長和子實(shí)體形成分化的菌根促生菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

于2020 年9 月在福建省三明市砂蕉村臺(tái)江國有林場(chǎng)正紅菇試驗(yàn)地采集土壤樣品，在野外發(fā)現(xiàn)正紅菇子實(shí)體后，采集其子實(shí)體并在原位插上標(biāo)牌以定位，在定位的正紅菇位點(diǎn)采集正紅菇菇位土壤6 份。先用滅菌的鑷子撥開表面的腐殖質(zhì)，用直徑8 mm的打孔器收集正紅菇子實(shí)體正下方0～5 cm 土壤，每份樣品采集5 個(gè)樣品混合作為一份樣品，放進(jìn)無菌的50 mL 的離心管內(nèi)，迅速放入保溫箱內(nèi)，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。

1.2 土壤微生物的分離純化

本試驗(yàn)采用LB 培養(yǎng)基和ISP2培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)[18]。分離培養(yǎng)步驟：稱取土壤樣品10 g，置于盛有90 mL 無菌水的三角瓶中，200 r·min-1振蕩20 min。取土壤懸浮液1 mL 置于9 mL PBS 緩沖液中，逐級(jí)稀釋至10-6倍，分別取10-3、10-4和10-5含量的土壤懸浮液均勻涂布于LB 培養(yǎng)基和ISP2培養(yǎng)基，每個(gè)梯度重復(fù)3 次，涂板均勻后將培養(yǎng)平板倒置于37 ℃恒溫下培養(yǎng)，期間觀察記錄可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落特征并計(jì)數(shù)，同時(shí)從平板上挑取不同培養(yǎng)性狀的單菌落，繼續(xù)在對(duì)應(yīng)平板上劃線純化，直至獲得純培養(yǎng)細(xì)菌菌株。用滅菌的牙簽輕輕挑取單菌落，接種在裝有對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基的離心管中，置于搖床內(nèi)30 ℃，200 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)，最后用30%的甘油將細(xì)菌保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 可培養(yǎng)微生物的分子鑒定

細(xì)菌的DNA 提取采用菌落PCR 的方法。具體方法如下：（1）用經(jīng)滅菌的牙簽挑取純菌落于PCR 管中，加入20 μL ddH2O，置于PCR 儀中，98 ℃加熱10 min。經(jīng)過離心的上清液即為細(xì)菌DNA。（2）將所提取的DNA 進(jìn)行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增所用引物[19-20]：16S 27F:5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′和16S 1492R:5′-TACGGYTACCTTGTT ACGACTT-3′。PCR 擴(kuò)增所用反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，PCR Mix 12 μL，用ddH2O 補(bǔ)足至25 μL 反應(yīng)體系。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；保溫：4 ℃。將經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在1 500 bp 附近有明顯條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果與NCBI 網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast 比對(duì)，選取相似度大于97%且相似度最高菌株的16S rRNA 序列，將比對(duì)到同一序列的細(xì)菌菌株劃分到一個(gè)操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）。運(yùn)用MEGA 5 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)序列的同源程度初步確定待鑒定的菌株在分類學(xué)上的地位。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法采用Neighborjoining，自展數(shù)（Bootstrap）為1 000，選定2 條Aquifex pyrophilus序列[21]為外群。

根據(jù)鑒定結(jié)果，計(jì)算正紅菇菇位土壤微生物的相對(duì)分離率[22]（指分離到的某種細(xì)菌占分離到細(xì)菌總株數(shù)的百分率，用來衡量某種細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)度）與正紅菇菇位土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性[23]。多樣性指數(shù)計(jì)算公式：

式中，S表示正紅菇菇位土壤細(xì)菌的種類數(shù)，N表示正紅菇菇位土壤細(xì)菌的總株數(shù)，Pi表示某種細(xì)菌的相對(duì)分離率。

細(xì)菌群落間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化與網(wǎng)絡(luò)的嵌套結(jié)構(gòu)（Nestedness metric based on overlap and decreasing fill，NODF）、物種依賴度（Species strength）、有效合作值（Effective partners）和親密度（Closeness）等網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)均使用R 語言（4.1.2）的Bipartite包[24]進(jìn)行分析和計(jì)算，并通過與零模型相比較以確定正紅菇菇位細(xì)菌群落的組裝是否為一個(gè)隨機(jī)過程[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的組成

采用稀釋平板分離法，利用LB 和ISP2兩種培養(yǎng)基從6 份正紅菇菇位土壤樣品中一共分離到128 株細(xì)菌。對(duì)分離到的細(xì)菌提取總DNA，使用引物27F 和1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后送公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，共鑒定到34 個(gè)OTUs，隸屬于3 門16 屬，其具體信息如表1 所示。以34 個(gè)OUTs 的16S rRNA 序列及其參考序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1 所示。正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌主要分為3 個(gè)大類：第一大類為厚壁菌門（Firmicutes），包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、類芽孢桿菌屬（Paeinibacillus）等；第二大類為變形菌門（Proteobacteria），包括伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、副伯克霍爾德氏菌屬（Paraburkholderia）、沙雷氏菌屬（Serratia）等；第三大類為放線菌門（Actinobacteria），主要是鏈霉菌屬（Streptomyces.）的細(xì)菌。

圖1 基于正紅菇菇位土壤中34 個(gè)OUTs 細(xì)菌的16S rRNA 序列及其參考序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of 34 OUTs isolated from rhizosphere soils of R.griseocarnosa and reference

表1 正紅菇菇位土壤中分離出的34 個(gè)OUTs 細(xì)菌的16S rRNA 基因序列比對(duì)結(jié)果Table 1 16S rRNA gene sequences of 34 OUTs microbes isolated from R.griseocarnosa rhizosphere soil

2.2 正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

6 個(gè)正紅菇菇位土壤樣品中的可培養(yǎng)細(xì)菌豐度組成如圖2 所示，樣品1～6 中具有的優(yōu)勢(shì)類群不同，分別是厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）、放線菌門的鏈霉菌屬（Streptomyces.）和變形菌門的伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌（樣品1）；變形菌門的伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）和放線菌門的鏈霉菌屬（Streptomyces.）（樣品2）；變形菌門的伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）和變形菌門的副伯克霍爾德氏菌屬（Paraburkholderia）的細(xì)菌（樣品3）；厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）、變形菌門的藍(lán)黑紫色桿菌屬（Janthinobacterium）和變形菌門的伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌（樣品4）；厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）、變形菌門的伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）和放線菌門的鏈霉菌屬（Streptomyces.）的細(xì)菌（樣品5）；厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）、放線菌門的鏈霉菌屬（Streptomyces.）和變形菌門的伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌（樣品6）。通過對(duì)6 份正紅菇菇位土壤樣品獲得的128 株細(xì)菌隸屬的結(jié)果進(jìn)行分析得知，豐度前3 的屬分別是厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）（占53.13%）、變形菌門的伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）（占20.31%）、放線菌門的鏈霉菌屬（Streptomyces.）（占9.38%）。對(duì)6 個(gè)正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性結(jié)果如表2 所示，各樣品的香農(nóng)指數(shù)在2.94～3.72，辛普森指數(shù)在0.81～0.91，豐富度指數(shù)在3.19～4.41，均勻度指數(shù)在1.22～1.38。

表2 6 個(gè)正紅菇菇位土壤樣品可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of culturable microbes in 6 rhizosphere soil samples from sites of R.griseocarnosa

圖2 不同正紅菇菇位土壤樣品中屬水平可培養(yǎng)細(xì)菌豐度組成Fig. 2 Abundant culturable microbes at genus level in different rhizosphere soils

2.3 正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析

正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌屬水平與采樣品的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明（圖3），分離細(xì)菌中豐度最大的是芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），可在所有采樣品分離到；部分細(xì)菌屬僅在特定的采樣品中分離到，如檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和拉烏爾菌屬（Raoultella）僅在樣品2 中分離到；紅球菌屬（Rhodococcus）和副伯克霍爾德氏菌屬（Paraburkholderia）僅在樣品3 中分離到；擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、藍(lán)黑紫色桿菌屬（Janthinobacterium）和小四孢菌（Microtetraspora）屬僅在樣品4 中分離到；Rummeliibacillus屬僅在樣品5 中分離到；輪枝鏈霉菌屬（Streptoverticillium）僅在樣品6 中分離到。

圖3 正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌(屬水平)在不同采樣品的分布Fig. 3 Distribution of culturable microbes at genus level in rhizosphere soil sampled at R.griseocarnosa sites

分析正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌屬間的相互作用結(jié)果表明（表3），芽孢桿菌屬（Bacillus）的物種依賴程度最高為3.10，其次是伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）為1.21；芽孢桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的有效合作值較其他細(xì)菌屬更高，分別為5.79、4.68、4.00 和4.00；芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的親密度較高，為0.08；對(duì)網(wǎng)絡(luò)中各細(xì)菌的依賴度、有效合作值和親密度分析表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）在細(xì)菌群落中被其他屬的細(xì)菌所依賴程度較高，并可能擁有更多的相互作用。與零模型相比，正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌（屬水平）與采樣品的網(wǎng)絡(luò)嵌套性（NODF=44.66）差異不顯著（P=0.29），即樣品中分離菌株在屬水平的分布具有隨機(jī)嵌套性。

表3 正紅菇菇位土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌屬間的網(wǎng)絡(luò)相互作用Table 3 Network interactions among culturable microbial genera in R.griseocarnosa rhizosphere soil

3 討論

本研究通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法從正紅菇菇位土壤中分離到可培養(yǎng)細(xì)菌128 株，其分別隸屬于3 個(gè)門16 個(gè)屬，可以劃分為34 個(gè)OTUs。豐度排前三的屬中，芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）在6 個(gè)樣品中均可以分離到，鏈霉菌屬（Streptomyces.）僅可以在樣品1、3、5、6 中分離到。近年來，大量研究通過變性梯度凝膠電泳和高通量測(cè)序分析了正紅菇菌根際微生物多樣性。肖冬來等[14]發(fā)現(xiàn)正紅菇菌根根際土壤細(xì)菌主要分為7 個(gè)類群：α-變形菌門（Alphaproteobacteria）、β-變形菌門（Betaproteobacteria）、γ-變形菌門（Gammaproteobacteria）、酸桿菌門（Acidobateria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）及分類地位未知的不可培養(yǎng)細(xì)菌；Yu 等[16]利用16S 擴(kuò)增子測(cè)序?qū)φt菇菌根根際細(xì)菌進(jìn)行了研究，結(jié)果表明正紅菇菌根根際細(xì)菌的多樣性比對(duì)照組更低，伯克霍爾德菌屬-副伯克霍爾德菌屬（Burkholderia-Paraburkholderia）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、堆囊菌屬（Sorangium）、酸桿菌屬（Acidobacterium）、Roseiarcus屬和Singulisphaera屬的細(xì)菌可能對(duì)正紅菇的生長具有一定的促進(jìn)作用。然而以上研究無法獲得正紅菇菌根根際土壤微生物的純培養(yǎng)，難以進(jìn)一步開展土壤微生物與正紅菇關(guān)系的相關(guān)研究。我們通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法對(duì)正紅菇菇位可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了研究，表明其優(yōu)勢(shì)菌屬是芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）。

菌根對(duì)其生長環(huán)境中的微生物存在選擇和調(diào)控的作用，同時(shí)環(huán)境微生物也影響著菌根的形成和生長以及基因的表達(dá)[26-28]。姜華等在6 個(gè)松口蘑菌塘土壤中分離到的最多也是芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌[21]；安忠琦等在金釵石斛根際可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的研究中分離到的最多也是芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌[29]；而萬山平等在攀枝花塊菌-華山松菌根根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性研究中分離到的最多是伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌[30]。同時(shí)，本研究從正紅菇菇位土壤中也分離到了大量芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌。有研究表明，從Tuber borchii中分離到的芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌可以降解幾丁質(zhì)[31]，以此來促進(jìn)Tuber borchii產(chǎn)生孢子和形成子實(shí)體；從Laccaria laccata菌根和根際中分離到的芽孢桿菌可以促進(jìn)外生菌根真菌菌絲的生長以及外生菌根的形成[32,33]；類芽孢桿菌（Paenibacillus）可以利用可溶性代謝物促進(jìn)松茸生長[34]。盛江梅等[35]分到一株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）可以促進(jìn)美味牛肝菌（Boletus edulis）菌絲體的生長并且促進(jìn)其與宿主黑松形成菌根從而促進(jìn)宿主植物生長。然而，芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌與正紅菇菌絲的生長和菌根形成的互作關(guān)系及影響機(jī)理還未見報(bào)道，有待開展進(jìn)一步的研究。

Rivett 等[36]學(xué)者認(rèn)為，細(xì)菌的相對(duì)豐度在一定程度上反映了其在群落中的重要程度，相對(duì)豐度較高的細(xì)菌在群落中的相互作用可能更多。本研究中的芽孢桿菌屬（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）具有相對(duì)較高的豐度同時(shí)也具有較高的相互作用，是正紅菇菇位土壤中細(xì)菌群落的關(guān)鍵類群。但是，F(xiàn)ranck 等[17]的研究中通過高通量測(cè)序方法顯示出具有較高豐度假單胞菌屬的細(xì)菌種，在其傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和高通量測(cè)序的網(wǎng)絡(luò)互作分析中都顯示出較低的相互關(guān)系。因此，判斷細(xì)菌在群落中的重要程度不僅要看其相對(duì)豐度，其在網(wǎng)絡(luò)互作中的相互關(guān)系一樣需要受到關(guān)注。除此之外，通過高通量測(cè)序和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)2 種方法檢測(cè)到的細(xì)菌在群落組成和相對(duì)豐度上存在明顯的差異，在正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌豐度占前5 的細(xì)菌屬中僅伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）是高通量測(cè)序分析結(jié)果中相對(duì)豐度前8 的主要類群之一，且正紅菇菇位土壤可培養(yǎng)細(xì)菌豐度最高的芽孢桿菌屬（Bacillus）在高通量測(cè)序研究中并沒有顯示出較高的豐度[37]。因此將傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合才能更好地研究正紅菇菌根根際中的細(xì)菌多樣性。