顧建鋒，邵寶林，方亦午，馬欣欣,3，李星月，鄭經(jīng)武

（1.寧波海關(guān)技術(shù)中心/寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 寧波 315100；2.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川 成都 610041；3.中盛產(chǎn)品檢測(cè)有限公司，浙江 寧波 315100；4.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066；5.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310012）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是世界上第三大、我國(guó)第四大糧食作物，是集糧食、蔬菜、飼料和工業(yè)原料于一身的優(yōu)勢(shì)作物。中國(guó)是世界馬鈴薯生產(chǎn)種植大國(guó)，四川種植面積則居我國(guó)首位，約73 萬(wàn)hm2。2012 年至今，四川省馬鈴薯種植面積和總產(chǎn)連續(xù)全國(guó)第一，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已經(jīng)逐漸成為四川省農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收的一大支柱產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)，四川省將馬鈴薯產(chǎn)業(yè)列為四川省特色優(yōu)勢(shì)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，大力推進(jìn)馬鈴薯主糧化開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略，依靠得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢(shì)和健全的良種繁育體系，極大地推動(dòng)了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。但在加強(qiáng)育種和外來(lái)品種引進(jìn)力度的同時(shí)，馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)的傳入擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)也在加大。馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)研究對(duì)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)主要包括馬鈴薯金線蟲(chóng)（Globodera rostochiensisSkarbilovich，1959）[1]和馬鈴薯白線蟲(chóng)（Globodera pallidaBehrans,1975）[2]，是嚴(yán)重威脅馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的重要病原線蟲(chóng)，危害非常嚴(yán)重，是國(guó)際公認(rèn)的最重要檢疫性有害生物，也是我國(guó)重要的進(jìn)境植物檢疫性有害生物，2020 年被列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名錄》。據(jù)國(guó)外報(bào)道，馬鈴薯金線蟲(chóng)一般會(huì)造成馬鈴薯減產(chǎn)20%，在熱帶地區(qū)，危害嚴(yán)重時(shí)造成產(chǎn)量損失80%～90%，甚至絕收[3]。為防止其傳入，長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)一直禁止馬鈴薯種薯的商業(yè)引進(jìn)，目前尚未批準(zhǔn)任何食用馬鈴薯的輸入?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2021 年6 月，筆者在四川省越西縣發(fā)現(xiàn)馬鈴薯田塊部分植株較矮，葉片黃化，長(zhǎng)勢(shì)較差，挖取植株根部，發(fā)現(xiàn)根系上有淡黃色至金黃色的球形孢囊，疑似馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)侵染。目前我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)，因此亟需對(duì)該病原進(jìn)行鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行分離和形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定，以期明確病原線蟲(chóng)種類，為進(jìn)一步開(kāi)展馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)、鑒定和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自越西縣竹阿覺(jué)鎮(zhèn)古二鄉(xiāng)馬鈴薯種植田塊（102°41′37.3″E；28°25′46.8″N；海拔2 315.1 m），種植的馬鈴薯為青薯9 號(hào)種，采集時(shí)間為馬鈴薯花期。針對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)不良、矮化的田塊，多點(diǎn)采集根圍土壤混合樣品各約500 g，同時(shí)將馬鈴薯苗連根拔起，觀察并采集少許根系。

1.2 線蟲(chóng)分離

土壤中的二齡幼蟲(chóng)采用改良漏斗法（寧波市鎮(zhèn)海百川生物科技有限公司）進(jìn)行線蟲(chóng)分離。稱取土壤100 g，用雙層紗布包裹，置于加有適量水的漏斗中（水量以剛蓋沒(méi)土壤為宜），25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，用表面皿接取5～10 mL 線蟲(chóng)分離液，在Zeiss Stemi 305 解剖鏡下觀察是否有線蟲(chóng)。

土壤中的孢囊采用簡(jiǎn)易漂浮法分離。稱取風(fēng)干土壤100 g，置于2 000 mL 的三角瓶中，加水至水深5 cm 左右后充分搖晃，隨后邊加水邊攪動(dòng)，直至水面至瓶口處，靜置片刻。將瓶口的漂浮物通過(guò)20 目和100 目濾，將100 目篩上的收集物輕輕倒入有濾紙的漏斗中過(guò)濾。過(guò)濾完畢后取濾紙?jiān)诮馄淑R下觀察孢囊并計(jì)數(shù)。

用解剖刀切破較新鮮的孢囊，可見(jiàn)其中有大量蟲(chóng)卵。用移液器將適量蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)移到載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕用手指按壓，部分蟲(chóng)卵破碎，游離出來(lái)的線蟲(chóng)即為孢囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)（J2）。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.1 孢囊陰門錐制作 將孢囊轉(zhuǎn)移到塑料培養(yǎng)皿上的水滴中，于解剖鏡下用解剖刀切下孢囊的后端（即頸部的對(duì)面一側(cè)）部分，用竹針或0 號(hào)狼毛筆輕輕剔除陰門錐內(nèi)的黏附物和卵，用解剖刀適當(dāng)修整陰門錐的邊緣。然后取一片干凈的載玻片，在中間加一小滴甘油，在解剖鏡下用挑針將上述修整好的陰門錐移至甘油滴的中央，用挑針往下壓，使其外表面向上。在甘油滴兩邊對(duì)稱放置兩塊小蠟塊，加蓋玻片，于64 ℃的加熱板上加熱，待蠟塊融化后自然冷卻，用中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 顯微鏡觀察攝影及測(cè)量 用Zeiss Imager Z1 顯微鏡和Axioscop MRm 數(shù)碼相機(jī)對(duì)J2、孢囊、陰門錐的整體形態(tài)和內(nèi)部特征進(jìn)行觀察、攝影和測(cè)量。

1.4 根系內(nèi)部線蟲(chóng)染色

馬鈴薯花期采集植株根系，采用幼苗根系次氯酸鈉——酸性品紅整體染色[4-5]。觀察根系內(nèi)部孢囊線蟲(chóng)的侵染情況。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 孢囊和幼蟲(chóng)DNA 的提取 取分離得到的3 個(gè)孢囊和6 條二齡幼蟲(chóng)，參照王江嶺等[6]的方法分別提取DNA，于-20 ℃保存待用。

1.5.2 種特異性PCR 鑒定 使用ITS5 和PITSr3 引物[7]對(duì)獲取的DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)同時(shí)設(shè)置一組陰性對(duì)照及一組空白對(duì)照，陰性對(duì)照的DNA 模板為大豆孢囊線蟲(chóng)。反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后將產(chǎn)物在添加Gelred 染料的1×TAE溶液制成1%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL100 bp（TaKaRa）為Marker，用紫外凝膠成像儀觀察并照相，以確認(rèn)擴(kuò)增是否有效。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與Marker進(jìn)行比較。剩余擴(kuò)增產(chǎn)物送杭州擎科生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序。

1.5.3 線蟲(chóng)核糖體基因擴(kuò)增和測(cè)序分析 分別取單個(gè)孢囊和2 條二齡幼蟲(chóng)的DNA 模板，采用核糖體rDNA 部分18S 基因擴(kuò)增引物：988（5′-CTCAAAGA TTAAGCCATGC-3′）和 1912（5′-TTTACGGTCAG AACTAGGG-3′）；1813（5′-CTGCGTGAGAGGTG AAAT-3′）和2646（5′-GCTACCTTGTTACGACTTT T-3′）[8]，核糖體rDNA 28S 基因D2～D3 區(qū)擴(kuò)增引物391A（5′-AGCGGAGGAAAAGAAACTAA -3′）和501（5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′）[9]，核糖體rDNAITS區(qū)擴(kuò)增引物TW81（5′-GTTTC CGTAGGTGAACCTGC-3′）和AB28（5′-ATATGC TTAAGTTCAGCGGGT-3′）[10]，進(jìn)行上述基因PCR擴(kuò)增。上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，PCR 擴(kuò)增程序參照各引物所在文獻(xiàn)[8-10]。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物在添加Gelred 染料的1×TAE 溶液制成1%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL100 bp（TaKaRa）為Marker，用紫外凝膠成像儀觀察并照相，以確認(rèn)擴(kuò)增是否有效。18S 基因和28S 基因D2～D3 區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物由杭州擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，ITS序列直接測(cè)序不能獲得有效序列，由上述公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

使用ChormasPro 軟件對(duì)測(cè)序得到的雙向峰圖文件進(jìn)行拼接，剔除測(cè)序結(jié)果兩端多余堿基后，得到用于后續(xù)比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析的序列。登陸NCBI 網(wǎng)站中的BLAST（Basic local alignment search tool）頁(yè)面（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)。在GenBank 中下載已登錄的各近似種（球孢囊線蟲(chóng)屬）的部分序列，在Clustal[11]的默認(rèn)設(shè)置下進(jìn)行序列比對(duì)，并在MEGA 軟件下使用p-distance 設(shè)置對(duì)所得序列及其近似類群進(jìn)行兩兩序列相似度計(jì)算（Pairwise Distance）。

通過(guò)jModeltest 軟件[12]，以甜菜孢囊線蟲(chóng)（Heterodera schachtiiMW834323）和大豆孢囊線蟲(chóng)（Heterodera glycinesEF611124）為外群，對(duì)得到的序列比對(duì)文件在赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行核苷酸替換模型的評(píng)估，得到相應(yīng)的支持模型。使用MrBayes 3.2.3 軟件[13]對(duì)得到的序列比對(duì)文件進(jìn)行貝葉斯法系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，根據(jù)所獲得的核苷酸替換模型，參照Ronquist等[13]的說(shuō)明對(duì)程序做出設(shè)定。在4 條馬爾科夫鏈（Markov Chain）下獨(dú)立進(jìn)行3 條熱鏈和1 條冷鏈的5× 107次運(yùn)行，每1 000 次運(yùn)行進(jìn)行一次抽樣，剔除前25%可能未處于穩(wěn)態(tài)時(shí)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用多數(shù)一致（50%）原則，用MCMC（Markov Chain Monte Carlo）方法評(píng)估所獲得貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的后驗(yàn)概率值[14]，在TreeGraph 2 軟件中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行查看和編輯[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

采樣田塊馬鈴薯植株較矮，葉片黃化，長(zhǎng)勢(shì)較差。拔起植株可看到部分根系上有淡黃色至金黃色的球形顆粒，為球孢囊屬線蟲(chóng)的雌蟲(chóng)或孢囊（圖1）。其數(shù)量較大，肉眼可見(jiàn)，多的有數(shù)百粒以上。

圖1 四川越西馬鈴薯金線蟲(chóng)根部雌蟲(chóng)和孢囊Fig. 1 Cyst and female adult of G.rostochiensis on potato roots from Yuexi,Sichuan

2.2 形態(tài)特征描述

100 g 風(fēng)干土壤用漂浮法分離獲得孢囊100 多個(gè)，用改良漏斗法分離獲得大量孢囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)，但未發(fā)現(xiàn)雄蟲(chóng)。

雌蟲(chóng)：蟲(chóng)體近球形，具突出的頸部。白色至淡黃色。頭部具有融合的唇和1 或2 個(gè)明顯的唇片。頸部環(huán)紋不規(guī)則，大多數(shù)體壁變成網(wǎng)紋型脊，頭骨架發(fā)育弱?？卺樺F部約占口針長(zhǎng)的50%，與桿部區(qū)別明顯，口針基部球向后傾斜，口針從頭架延伸到口針長(zhǎng)約75%處。中食道球大，幾乎球形，瓣門呈新月形。排泄孔明顯，位于頸基部。雙卵巢充滿整個(gè)體腔。陰門橫裂，周圍角質(zhì)層輕微環(huán)形凹陷，形成陰門膜孔。陰門位于兩個(gè)細(xì)的唇突狀新月形區(qū)域之間。肛門與陰門膜孔間角質(zhì)層約有12 個(gè)平行的脊，少數(shù)交叉相連。

孢囊（圖2）：孢囊球形或近球形，頸部突出，尾部圓滑，無(wú)任何突起的圓錐體狀結(jié)構(gòu)。其色澤金黃或黑褐色。表皮層具有“Z”字形的脊?fàn)罴y。陰門錐為單環(huán)膜孔型，無(wú)陰門橋、下橋和其他內(nèi)腺突，無(wú)泡狀突。卵存在于孢囊中，不形成卵囊。新鮮孢囊的陰門區(qū)完整，但較老的孢囊標(biāo)本部分或全部陰門膜孔丟失。肛門明顯，不形成膜孔，有時(shí)可見(jiàn)“V”形結(jié)構(gòu)。

圖2 四川越西馬鈴薯金線蟲(chóng)孢囊及陰門錐Fig. 2 Cyst and cyst vulval basin of G.rostochiensis from Yuexi,Sichuan

二齡幼蟲(chóng)（圖3）：分離得到各種線蟲(chóng)的混合物。根據(jù)口針強(qiáng)壯、長(zhǎng)約20 μm、基部球顯著膨大且為幼蟲(chóng)的特點(diǎn)，容易將孢囊屬線蟲(chóng)與其他各種線蟲(chóng)區(qū)分。共計(jì)分離到孢囊屬線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)約500 條，蠕蟲(chóng)形，角質(zhì)層環(huán)紋規(guī)則，側(cè)區(qū)4 條側(cè)線。熱殺死后蟲(chóng)體通常略腹彎，體長(zhǎng)405～444 μm。頭部圓形，輕微縊縮，4～6 個(gè)環(huán)紋?？卺槒?qiáng)壯，長(zhǎng)19.4～21.9 μm，口針基部球近圓形，略向后傾斜，前面較平，口針錐部約占口針長(zhǎng)的50%。食道腺向后延伸至約35%體長(zhǎng)處。排泄孔位于近尾部約20%體長(zhǎng)處。半月體明顯，2 個(gè)體環(huán)長(zhǎng)，位于排泄孔前1 個(gè)體環(huán)處。尾部漸變細(xì)，末端細(xì)圓，透明尾約占尾長(zhǎng)的1/2。

圖3 四川越西馬鈴薯金線蟲(chóng)卵和二齡幼蟲(chóng)Fig. 3 Eggs and J2s of G.rostochiensis from Yuexi population

2.3 二齡幼蟲(chóng)（J2）和孢囊形態(tài)測(cè)量值

對(duì)四川越西群體20 條J2 和15 個(gè)孢囊進(jìn)行測(cè)計(jì)，并與國(guó)外馬鈴薯金線蟲(chóng)參考文獻(xiàn)的資料進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 四川越西群體孢囊線蟲(chóng)樣品與國(guó)外馬鈴薯金線蟲(chóng)測(cè)計(jì)值比較Table 1 Morphometrics of cyst and J2 of Yuexi and foreign G.rostochiensis

四川越西群體的孢囊呈球形、金黃色，陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)15～24 個(gè)，Granek 比值為2.7～4.7，二齡幼蟲(chóng)口針長(zhǎng)度19.4～21.9 μm，口針基部球近圓形、略向后傾斜、前面較平，DGO 距離3.0～5.2 μm，透明尾長(zhǎng)17.7～25.0 μm。上述特征或測(cè)計(jì)值均與馬鈴薯金線蟲(chóng)相符。

2.4 根系內(nèi)部線蟲(chóng)染色結(jié)果

經(jīng)根系透明染色后，可觀察到根內(nèi)有大量線蟲(chóng)寄生，呈粉紅色（圖4），其體長(zhǎng)約400 μm，體寬略短于20 μm，和表2 中的測(cè)計(jì)值相符。進(jìn)一步形態(tài)特征觀察表明其與上述孢囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)一致，因此該種線蟲(chóng)能入侵馬鈴薯根系內(nèi)部。

圖4 馬鈴薯根系內(nèi)染色后的二齡幼蟲(chóng)Fig. 4 Stained J2s on potato roots

2.5 線蟲(chóng)的分子生物學(xué)鑒定

2.5.1 特異性引物擴(kuò)增 特異性引物擴(kuò)增后，所測(cè)試的3 個(gè)孢囊和4 條二齡幼蟲(chóng)均得到了430 bp 左右的明亮條帶（圖5），和預(yù)期的434 bp 馬鈴薯金線蟲(chóng)種特異條帶大小相一致。進(jìn)一步測(cè)序后得到的序列長(zhǎng)度均為434 bp，blast 比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，和Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的馬鈴薯金線蟲(chóng)序列相似度為100%。

圖5 四川越西馬鈴薯金線蟲(chóng)樣品特異PCR 電泳圖Fig. 5 Specific PCR electrophoresis of G.rostochiensis from Yuexi population

2.5.2 核糖體基因DNA 序列分析 對(duì)該四川越西分離得到的線蟲(chóng)群體進(jìn)行核糖體rDNA 18S 區(qū)基因擴(kuò)增測(cè)序，3 個(gè)模板獲得的片段大小均為1 740 bp，GenBank登錄號(hào)為MZ613180。該四川越西群體和其他國(guó)家和地區(qū)所報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)群體18S 基因序列相似度為 99.41%（AY593877 1 696/1 701 bp）～ 99.94%（KJ636271 1 700/1 701 bp），和其他馬鈴薯白線蟲(chóng)的序列相似度為99.53%（Globodera pallidastrain GlobPal10 KJ636269）～99.77%（Globodera pallidaisolate GlobPal3 AY284620），和其他球孢囊屬線蟲(chóng)的序列相似度為99.12%（Globodera achilleaestrain GlobAch2 KJ636274）～100%（Globodera tabacumisolate 1094 FJ040401 1 701/1 701 bp）。因此，核糖體rDNA 18S 區(qū)基因無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分球孢囊屬具體種類，但能明確該群體屬于球孢囊屬。

該群體的核糖體28S 區(qū)基因擴(kuò)增測(cè)序所得片段大小均為953 bp，GenBank 登錄號(hào)為MZ613167。該類群和其他國(guó)家和地區(qū)所報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)群體28S 基因序列相似度為 99.06%（AY592987 947/956 bp）～ 100%（MK311333 953/953 bp），和馬鈴薯白線蟲(chóng)（G.pallida）的28S 序列相似度為97.59%（EU855119 932/955 bp）至 98.89%（LT159821 711/719 bp）；和艾草球孢囊線蟲(chóng)（G.artemisiae）的28S 序列相似度為98.01%（EU855121 937/956 bp）～98.19%（MT233316 702/720 bp）；和煙草球孢囊線蟲(chóng)（G.tabacum）的28S序列相似度為99.40%（GQ294492）。同樣，核糖體rDNA 28S 區(qū)基因無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分球孢囊屬一些種類，但能明確該四川越西群體屬于球孢囊屬。

該群體的核糖體ITS區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序失敗，經(jīng)克隆測(cè)序后，得到2 條序列，長(zhǎng)度分別為1 040 bp 和1 041 bp，GenBank 登錄號(hào)為MZ613152 和MZ613153，兩序列相似度為99.33%（1 035/1 041 bp）。該四川越西群體和其他國(guó)家和地區(qū)所報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)群體ITS基因序列相似度最高，為 97.90%（JF907553 981/1 002 bp）～ 99.90%（GQ294513 1 040/1 041 bp），同時(shí)和其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中的煙草球孢囊線蟲(chóng)的序列相似度為 97.26%（FJ667945 924/950 bp）～ 97.90 %（GQ294525 1 024/1 045 bp），和 馬鈴薯白線蟲(chóng)的序列相似度最高為 96.5%（LT159833）。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖6）上可以看出，該四川越西群體和其他國(guó)家和地區(qū)所報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)群體（源于NCBI 網(wǎng)站）聚類在了具高置信度（后驗(yàn)證概率=100）同一分支，表明該四川越西群體確為馬鈴薯金線蟲(chóng)。

圖6 基于四川越西馬鈴薯金線蟲(chóng)與近似種ITS 區(qū)DNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 6 ITS phylogenetic tree of G.rostochiensis from Yuexi population and similar Globodera species

2.6 鑒定結(jié)論

孢囊屬線蟲(chóng)屬于孢囊線蟲(chóng)亞科，該科常見(jiàn)的有球孢囊線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)Globodera、刻點(diǎn)孢囊線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)Punctodera、仙人掌孢囊線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)Cactodera、孢囊線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)Heterodera[19]?？厅c(diǎn)孢囊線蟲(chóng)屬孢囊呈卵形、肛門區(qū)域形成膜孔；仙人掌孢囊線蟲(chóng)屬孢囊呈檸檬形、有簡(jiǎn)化的陰門錐；孢囊屬線蟲(chóng)呈檸檬形、有突出的陰門錐；而球孢囊屬線蟲(chóng)孢囊呈球形、無(wú)陰門錐、肛門區(qū)不形成膜孔，可與近似屬明顯區(qū)分。該四川越西線蟲(chóng)群體孢囊呈球形、無(wú)陰門錐、肛門區(qū)不形成膜孔，明顯為球孢囊屬線蟲(chóng)。

據(jù)Subbotin 等[19]報(bào)道，球孢囊屬線蟲(chóng)包括10 種線蟲(chóng)。此后，2012 年美國(guó)Idaho 州發(fā)現(xiàn)艾靈頓氏球孢囊線蟲(chóng)G.ellingtonae[20]，2013 年，南非雜草上發(fā)現(xiàn)西開(kāi)普敦球孢囊線蟲(chóng)G.capensi[21]，2017 年南非發(fā)現(xiàn)厄加勒斯球孢囊線蟲(chóng)G.agulhasensis[22]，在南非雜草上又發(fā)現(xiàn)桑德維爾德球孢囊線蟲(chóng)G.sandveldensis[23]。因此，目前已經(jīng)報(bào)道的球孢囊屬線蟲(chóng)共計(jì)14 種[23,24]。據(jù)Subbotin 等[19]的檢索表，G.mali孢囊角質(zhì)層薄、透明；G.zelandica二齡幼蟲(chóng)口針平均長(zhǎng)度≥27 μm；G.leptonepia二齡幼蟲(chóng)口針平均長(zhǎng)度＜19 μm；G.bravoae二齡幼蟲(chóng)透明尾長(zhǎng)＞31 μm 。G.capensis、G.millefolii、G.artemisiae、G.agulhasensis、G.sandveldensis等5 種線蟲(chóng)大多寄生于菊科植物，Granek 比值平均值≤2。因此待測(cè)樣品很容易與上述9 種線蟲(chóng)區(qū)分。四川越西群體與煙草孢囊線蟲(chóng)G.tabacum的區(qū)別是肛門和陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)[18（15～24）個(gè)vs 7（5～15）個(gè)]；和G.ellingtonae的區(qū)別是肛門和陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)[18（15～24）個(gè) vs 13（10～18）個(gè)]；與墨西哥孢囊線蟲(chóng)G.mexicana的區(qū)別是Granek 比值：平均3.7 vs 2.8。

根據(jù)寄主和形態(tài)特征，四川越西孢囊線蟲(chóng)群體容易與其他線蟲(chóng)進(jìn)行區(qū)分，最相似的為馬鈴薯白線蟲(chóng)。與馬鈴薯白線蟲(chóng)的區(qū)別是雌蟲(chóng)和孢囊顏色（雌蟲(chóng)白色逐漸變黃，變成金黃或褐色的孢囊vs 雌蟲(chóng)白色，變成褐色的孢囊），J2 體長(zhǎng)略短（405.0～443.5 μm vs 440～525 μm），J2 口針長(zhǎng)略短[20.2（19.4～21.9）μm vs 23.6（21～26）μm]，J2 尾長(zhǎng)略短[46.8（40.0～51.0）μm vs 51.9（46～52）μm]，J2 口針基部球形態(tài)（近圓形、略向后傾斜、前面較平vs 前表面向前突起），肛門和陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)[18（15～24）個(gè)vs 12.2（8～20）個(gè)]，肛門至膜孔距離（43～76 μm vs 88～102 μm），Granek比值[3.7（2.7～4.7）vs 2.2（1.2～3.6）][3,25]。

該四川越西線蟲(chóng)群體與馬鈴薯金線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)基本一致。特異PCR 方法、核糖體DNA 序列分析，尤其是其ITS基因序列與已經(jīng)登錄的馬鈴薯金線蟲(chóng)十分近似，相似度高達(dá)99.9%，且與馬鈴薯白線蟲(chóng)的相似度最高只有96.5%。因此，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法均支持該線蟲(chóng)為馬鈴薯金線蟲(chóng)。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯金線蟲(chóng)為害隱蔽，潛伏期長(zhǎng)，侵染早期植株沒(méi)有明顯的癥狀，僅通過(guò)田間觀察很難確認(rèn)是否有該線蟲(chóng)為害。嚴(yán)重危害時(shí)，能導(dǎo)致寄主黃化、壞死、萎蔫、矮化甚至死亡，但上述癥狀與缺水缺肥等癥狀很難區(qū)分，常常需要采集土壤和根系樣品，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行孢囊或幼蟲(chóng)的分離鑒定。鏡檢觀察孢囊呈球形、無(wú)陰門錐、肛門區(qū)不形成膜孔，可判斷該線蟲(chóng)屬于球孢囊屬；再根據(jù)二齡幼蟲(chóng)口針基部球近圓形，向后傾斜；口針平均長(zhǎng)＜23 μm；Granek比值≥3，可判斷為馬鈴薯金線蟲(chóng)。

線蟲(chóng)體型微小，鑒定特征十分細(xì)微，形態(tài)學(xué)鑒定需要豐富的經(jīng)驗(yàn)。因此，分子生物學(xué)方法是線蟲(chóng)鑒定的重要輔助手段。根據(jù)EPPO[25]的方法，本研究采用Bulman &Marshall[7]報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)特異性引物ITS5 和PITSr3 對(duì)線蟲(chóng)孢囊或二齡幼蟲(chóng)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳和測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物為434 bp，與報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)特征片段完全一致。同時(shí)，本研究對(duì)四川越西群體核糖體rDNA 18S、rDNA 28S 和ITS基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和分析發(fā)現(xiàn)，該群體18S 和28S 序列與馬鈴薯金線蟲(chóng)和馬鈴薯白線蟲(chóng)的序列相似度均較高，但難以區(qū)分具體種類，僅可以確定該線蟲(chóng)屬于球孢囊屬線蟲(chóng)。核糖體ITS基因序列分析表明，該種線蟲(chóng)和國(guó)外報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)群體ITS基因序列相似度最高，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果也表明該群體和其他國(guó)家和地區(qū)所報(bào)道的馬鈴薯金線蟲(chóng)群體聚類在了具高置信度（后驗(yàn)證概率=100）同一分支，證實(shí)四川越西群體確為馬鈴薯金線蟲(chóng)。因此，ITS基因作為分子靶標(biāo)在球孢囊線蟲(chóng)的種類鑒定中較為有效，推薦用特異性PCR 方法或ITS基因?qū)︸R鈴薯金線蟲(chóng)進(jìn)行分子鑒定。

隨著經(jīng)濟(jì)全球化和國(guó)際貿(mào)易的日趨頻繁，馬鈴薯金線蟲(chóng)已經(jīng)隨馬鈴薯種質(zhì)資源等的私人攜帶、交換或其他根系材料的引種而傳入我國(guó)。李建中等[26]用生態(tài)位模型GARP 和MaxEnt 對(duì)馬鈴薯金線蟲(chóng)和白線蟲(chóng)在我國(guó)的適生區(qū)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，云南東北部、貴州、重慶、四川東部、湖南、湖北南部、山東南部、河南、安徽和江蘇等省市為馬鈴薯金線蟲(chóng)中高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)。由于該線蟲(chóng)在我國(guó)具有適生區(qū)域廣、防控難度大、潛在危害損失高和社會(huì)影響巨大等特點(diǎn)，一旦傳入和定殖擴(kuò)散，根除十分困難。在沒(méi)有寄主作物的情況下，其孢囊能在土壤中存活20 年以上[27]。因此建議在疫情發(fā)生區(qū)域采取嚴(yán)格的應(yīng)急控制措施，力爭(zhēng)消滅，同時(shí)在疫情周圍及高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域設(shè)立監(jiān)測(cè)點(diǎn)，嚴(yán)控疫情點(diǎn)的馬鈴薯和其他根莖類材料的跨區(qū)域調(diào)運(yùn)，嚴(yán)防疫情擴(kuò)散。鑒于馬鈴薯金線蟲(chóng)的為害經(jīng)濟(jì)重要性，需盡快完善馬鈴薯孢囊線蟲(chóng)疫情監(jiān)測(cè)及防控技術(shù)體系，加強(qiáng)馬鈴薯種薯的檢疫監(jiān)督管理，開(kāi)展馬鈴薯金線蟲(chóng)全國(guó)普查，增加馬鈴薯金線蟲(chóng)防控技術(shù)的研發(fā)投入，為我國(guó)馬鈴薯主糧化產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展保駕護(hù)航。