龍小琴，聶 聰，何基澤，田 野，李昕燃，皮鑫瑤，王萬軍，朱乾坤

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031）

0 引言

【研究意義】鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，富含多種活性成分，具有益胃生津、提高免疫力等功效，同時也可用于口干煩躁、病后虛熱以及消化不良等癥狀的治療[1]。鐵皮石斛含有很多復(fù)雜的化學(xué)成分，包括生物堿、多糖、黃酮、石斛酚類化合物等[2]。鐵皮石斛活性成分之一的黃酮類化合物由黃酮醇、黃烷醇、查爾酮以及花青素等不同的亞類組成[3]。一般情況下，黃酮類化合物以糖苷形式存在，具有抗菌、抗炎、抗氧化和防止血糖病等作用[4]。石斛酚在自然界中廣泛存在且數(shù)目眾多，因其結(jié)構(gòu)中包含大量的羥基所以具有抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等作用[5]。石斛酚作為木質(zhì)素的前體，與黃酮類化合物合成路徑一致，都是通過苯丙烷途徑合成[6]。羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl transferase，HCT）是?；o酶A 依賴的?；D(zhuǎn)移酶，為植物?；讣易宄蓡T之一，該家族將酰基輔酶A 作為?；w，催化底物形成酯類或氨?；衔?。HCT 就是以對香豆酰輔酶A 為?；w，將對香豆酰?；D(zhuǎn)移到?；荏w莽草酸上，形成對香豆酰莽草酸[7]，隨后再經(jīng)過下游途徑合成黃酮類化合物和石斛酚?！厩叭搜芯窟M展】 目前羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶的研究在多個物種中被報道。Peng 等[8]分析了茄子表達序列標簽（EST）的數(shù)據(jù)庫，從Eggplant 和Solanum richardii中分離并鑒定出了精胺羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Sperminehydroxycin namoyl transferase，SpmHCT）；張靜茹等[9]證實了金銀花羥基肉桂酰輔酶A奎寧羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶（Quinatehydroxycinnamoyl transferase，HQT）能夠在金銀花綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）的合成中起到正向調(diào)控作用。同樣在紅三葉草中也鑒定出了TpHCT1、TpHCT2，并且證實TpHCT1 參與合成木質(zhì)素的前體——石斛酚，同時還發(fā)現(xiàn)TpHCT2 是一種能夠參與咖啡酰蘋果酸合成的新型轉(zhuǎn)移酶[10]，隨后又通過動力學(xué)分析證明了TpHCT2 在羥基肉桂酰蘋果酸合成途徑中起關(guān)鍵作用[11]；劉菲等[12]發(fā)現(xiàn)核黃素處理煙草懸浮細胞后，其苯丙烷途徑中HCT 上游基因苯胺解氨酶（PAL）和HCT 下游基因過氧化物酶（POD）的活性明顯上升，并且在代謝產(chǎn)物中酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的積累顯著增加。在擬南芥中，HCT沉默植株表現(xiàn)出植株矮小且發(fā)育不良的表型，其木質(zhì)素含量大幅減小，但是類黃酮的含量積累增加，表明HCT 在這兩種化合物的合成上起重要作用[13]。近年來，研究者一共從石斛屬眾多種類中分離得到89 種黃酮成分，呂朝耕在鐵皮石斛中發(fā)現(xiàn)10 種黃酮成分[14]；林江波等[15]利用高通量測序技術(shù)分析了鐵皮石斛黃酮代謝途徑的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)在鐵皮石斛中有48 個與黃酮化合物代謝相關(guān)的Unigenes，還有14 個與該過程相關(guān)的酶；黃彪等[16]利用超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法對鐵皮石斛中18 種酚類物質(zhì)進行測定，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛莖、葉、花中酚類物質(zhì)含量存在差異?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于鐵皮石斛中黃酮類化合物和酚類物質(zhì)的研究報道較少，現(xiàn)有報道也大多集中在黃酮化合物以及酚類物質(zhì)成分檢測及功能研究，而對其合成途徑以及該途徑中關(guān)鍵酶的研究較少。HCT 是在苯丙烷代謝途徑合成黃酮化合物以及酚類物質(zhì)如木質(zhì)素中發(fā)揮重要作用的酶，但目前對于HCT 的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文擬對鐵皮石斛全基因組中DoHCT基因家族進行生物學(xué)信息鑒定，并通過研究該家族基因在鐵皮石斛中的表達情況來探討HCT 的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為實驗室盆栽鐵皮石斛（D.officinale）以及1/2 MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的鐵皮石斛幼苗。

1.2 鐵皮石斛HCT 基因家族的全基因組分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載鐵皮石斛HCT 家族的基因組數(shù)據(jù)，獲得該家族成員的基因信息，下載其氨基酸序列并在Expasy ProtParam（https://www.expasy.org/resources/protpar）中獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸長度、等電點和相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)。利用Cell-PLoc2.0 進行蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）。

1.3 鐵皮石斛HCT 家族的系統(tǒng)進化樹分析

下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）、鐵皮石斛（D.officinale）、大豆（Glycine max）、小麥（Triticum dicoccoides）和水稻（Oryza sativa）5 個物種相關(guān)蛋白序列并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，在Clustal W 中進行序列比對，利用MEGA 7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 鐵皮石斛HCT 家族的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析

通 過PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）網(wǎng)站分析HCT 家族的二級結(jié)構(gòu)，輸入相應(yīng)氨基酸序列，其余參數(shù)默認，得到蛋白的二級結(jié)構(gòu)圖。蛋白三級結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在線網(wǎng)站預(yù)測，輸入DoHCT 家族成員氨基酸序列，其他參數(shù)為默認，選擇GMQE 較高的Templates 進行建模，將建好的預(yù)測蛋白模型文件在PyMOL 軟件進行可視化分析。

1.5 鐵皮石斛HCT 家族蛋白保守基序分析

將在NCBI 網(wǎng)站下載的HCT 家族蛋白序列在Clustal W 上進行比對，并通過ESPript3 進行可視化分析。HCT 家族保守基序和保守結(jié)構(gòu)域通過The MEME Suite（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）獲得，同時結(jié)合MEGA 7 構(gòu)建的進化樹在TBtools 工具中得到其保守基序分布圖。

1.6 鐵皮石斛HCT 家族差異表達分析

1.6.1 模擬脅迫處理 選用實驗室鐵皮石斛試管幼苗，分別用含5 μmol·L-1ABA、100 mmol·L-1NaCl、10 % PEG 以及40 ℃（高溫，HT）、4 ℃（低溫，LT）的1/2 MS 培養(yǎng)基模擬脅迫處理6 h，取出幼苗，吸干溶液，每管分裝0.2 g 于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 鐵皮石斛RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄 利用擎科生物科技有限公司（中國成都）的RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒分別提取脅迫處理后鐵皮石斛試管幼苗的RNA 和盆栽鐵皮石斛的根、莖、葉RNA，瓊脂凝膠電泳鑒定后用酶標儀測試濃度，并用ddH2O 水將RNA 濃度調(diào)至統(tǒng)一，再通過寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA 于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 RT-PCR 通過逆轉(zhuǎn)錄PCR 分析DoHCT家族在不同脅迫處理下以及根、莖、葉組織中的表達情況，利用GraphPad Prism 進行差異表達繪圖以及顯著性分析，HCT家族引物設(shè)計如表1 所示，EF1-α 為內(nèi)參基因[17]。差異表達分析的數(shù)值為各HCT基因灰度值與內(nèi)參基因的灰度值相對比值，具體計算方法為：基因表達水平=（基因灰度值-空白灰度值）/（內(nèi)參灰度值-內(nèi)參空白灰度值），基因相對表達水平=基因表達水平/對照表達水平。RT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL 體系，所用的2×TSINGKETMMaster Mix 為擎科生物科技有限公司（中國成都）TSE001。反應(yīng)體系各試劑含量為2×TSINGKETM Master Mix 10 μL；0.1×cDNA 5 μL；Forward primer 0.5 μL；Reverse primer 0.5 μL；ddH2O 4 μL。PCR 反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；25 ℃延伸10 min。

表1 鐵皮石斛DoHCT 家族PCR 引物Table 1 RT-PCR primers for DoHCT family of D.officinale

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛HCT 家族蛋白理化性質(zhì)分析

通過BLAST 檢索發(fā)現(xiàn)，HCT基因家族一共有8 名成員，分別將其命名為DoHCT1（LOC110107 310）、DoHCT2（LOC110113109）、DoHCT3（LOC110 093424）、DoHCT4（LOC110093422）、DoHCT5（LOC 110093394）、DoHCT6（LOC110114390）、DoHCT7（LOC110092996）和DoHCT8（LOC110095902）。Expasy ProtParam 分析結(jié)果表明：鐵皮石斛HCT基因家族的8 個HCT 蛋白序列的氨基酸長度在426～454 aa，其中氨基酸序列長度最短的為DoHCT2（426 aa），最長的為DoHCT3（455 aa）；相對分子質(zhì)量在46.80（DoHCT2）～49.29（DoHCT8）kDa，除DoHCT2 等電點（7.24）和DoHCT6 等電點（7.56）大于7 外，其余蛋白等電點均介于 5.64（DoHCT5）～6.47（DoHCT7）；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)顯示除DoHCT2（36.51）和DoHCT7（33.62）不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余DoHCTs 不穩(wěn)定系數(shù)在47.99（DoHCT8）～57.93（DoHCT4），表明其為不穩(wěn)定蛋白；DoHCTs 脂溶指數(shù)在83.38～94.52；親水指數(shù)顯示DoHCT4、DoHCT6 和DoHCT7 為疏水性蛋白（親水指數(shù)＞0），其余DoHCTs 為親水性蛋白（親水指數(shù)＜0）（表2）；另外，通過對HCT 家族蛋白質(zhì)的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，該家族8 個成員均位于細胞質(zhì)中。

表2 鐵皮石斛DoHCT 家族成員基因組信息和蛋白特征Table 2 Genomic information and protein characteristics of DoHCTs of D.officinale

2.2 鐵皮石斛HCT 家族系統(tǒng)進化樹分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中分別獲得1 個擬南芥（A.thaliana）HCT 蛋白序列、8 個大豆（G.max）HCT蛋白序列、3 個小麥（T.dicoccoides）HCT 蛋白序列、8 個水稻（O.sativa）HCT蛋白序列以及鐵皮石斛（D.officinale）的8 個HCT 蛋白序列，利用MEGA7軟件對這5 個物種進行系統(tǒng)發(fā)育分析。如圖1 所示，28 個蛋白分為5 組，其中Group Ⅰ包含9 個基因，約占進化樹基因總數(shù)的32%；Group Ⅱ和Group Ⅳ分別含有6 個基因，約占進化樹基因總數(shù)的21%；GroupⅢ和Group Ⅴ分別含有3 個和4 個基因，約占進化樹基因總數(shù)的10%和14%。鐵皮石斛HCT 家族成員分布在Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ和Group V 中，其中DoHCT1 和DoHCT2 在Group Ⅰ中，與單子葉植物小麥的TdHCT 以及雙子葉植物擬南芥AtHCT 親緣關(guān)系較近；DoHCT3、4 和5 在Group Ⅱ中，DoHCT6在Group Ⅲ中，均與單子葉植物水稻的OsHCT 的親緣關(guān)系較近；DoHCT7、8 分布在Group Ⅴ中，與單子葉植物小麥TdHCT 和水稻OsHCT 親緣關(guān)系較接近；而Group Ⅳ中均為大豆GmHCT，與鐵皮石斛的親緣關(guān)系較遠。

圖1 鐵皮石斛DoHCT 家族系統(tǒng)進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis on DoHCT family of D.officinale

2.3 DoHCT 家族保守基序分析

利用ClustalW 以及ESPript3 工具得到DoHCT 1～8 的蛋白多序列比對圖（圖2），結(jié)果表明DoHCT1～6 蛋白序列相似性較高，DoHCT7 和DoHCT8 蛋白序列相似，但與DoHCT 1～6 蛋白序列相似性較弱。

利用MEME 得到鐵皮石斛HCT 保守結(jié)構(gòu)基序及分布圖（圖3）。結(jié)果顯示，DoHCT1、DoHCT3～5 包含完整的10 個Motif，DoHCT2/6 都含有9 個Motif，不同的是DoHCT2 缺少Motif 9，而DoHCT6則缺少Motif 8。DoHCT7/8 所含有的Motif 較少，其中DoHCT7 缺少Motif 2、Motif 8～10，而DoHCT8只含有Motif 1～4。值得注意的是DoHCT7/8 的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示其屬于轉(zhuǎn)移酶超家族，除了DoHCT7的Motif7 沒有在保守結(jié)構(gòu)域里面，其余Motif 都在轉(zhuǎn)移酶超家族的保守結(jié)構(gòu)域里；而DoHCT1～6 保守結(jié)構(gòu)域分析顯示其屬于PLN02481 超家族，在這個保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)同樣包含除了Motif7 的所有Motif。DoHCT7/8的保守結(jié)構(gòu)域相似且與DoHCT1～6 保守結(jié)構(gòu)域有一定差異，這和多重蛋白序列比對（圖2）的分析結(jié)果一致。

圖2 鐵皮石斛DoHCT 1～8 多重蛋白序列比對Fig. 2 Sequence alignment of multiple proteins of D.officinale DoHCT1-8

圖3 鐵皮石斛DoHCT 保守基序及分布圖Fig. 3 Distribution of DoHCT conserved motifs of D.officinale

通過NCBI 網(wǎng)站下載鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)，通過TBtools 軟件對其進行分析得到鐵皮石斛HCT基因結(jié)構(gòu)（圖4）。結(jié)果顯示DoHCT2/4 兩個CDS 之間距離較長，內(nèi)含子占比大，其余DoHCTs內(nèi)含子占比較小。DoHCT1～8 都只含有兩個外顯子，其中DoHCT6 的CDS 序列長度在其本身基因結(jié)構(gòu)長度占比最大，而DoHCT3 擁有較長的UTR 序列。

圖4 鐵皮石斛DoHCT 基因結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of D.officinale DoHCT

2.4 DoHCT 家族蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA 網(wǎng)站輸入DoHCT 家族蛋白名稱和氨基酸序列，其他參數(shù)為默認參數(shù)，得到DoHCT 家族蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖5），DoHCT 家族各蛋白二級結(jié)構(gòu)信息如表3 所示：其中α 螺旋和無規(guī)則卷曲在DoHCT 家族蛋白二級結(jié)構(gòu)中占比較大，β 折疊與β 轉(zhuǎn)角占比較小。DoHCT 家族蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，DoHCT1～8 的模板覆蓋率分別為67.37%、65.26%、42.79%、40.48%、40.43%、38.65%、42.92%和24.82%。其中覆蓋率最大為DoHCT1（67.37%）、覆蓋率最小的為DoHCT8（24.82%）（圖6）。

表3 鐵皮石斛DoHCTs 蛋白二級結(jié)構(gòu)信息Table 3 Information on secondary structure of D.officinale DoHCTs protein

圖5 DoHCTs 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 5 Predicted DoHCTs protein secondary structure

圖6 鐵皮石斛DoHCTs 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 6 Predicted 3-D structure of D.officinale DoHCTs protein

2.5 DoHCT 基因家族差異表達情況分析

2.5.1DoHCT基因家族在根、莖、葉中的表達分析DoHCT家族成員中除DoHCT7 在鐵皮石斛根、莖、葉中未檢測到表達之外（圖7），其余成員在鐵皮石斛的根、莖、葉中均有表達。與根的相對表達相比，DoHCT1、4 在莖和葉中表達量較低，而DoHCT3、5、6 在莖和葉中表達量較高；DoHCT8則是在莖中表達量高、葉中表達量低；DoHCT2 在根莖葉中的表達水平無明顯差異。

圖7 DoHCTs 在根莖葉中的相對表達水平Fig. 7 Relative expressions of DoHCTs in roots,stems,and leaves

2.5.2 鐵皮石斛DoHCT家族脅迫處理表達分析 通過ABA、NaCl、PEG、40 ℃（高溫）和4 ℃（低溫）5 種不同脅迫條件下處理6 h 后的基因表達結(jié)果顯示（圖8）：ABA 處理下，表達顯著下調(diào)的基因有DoHCT3、DoHCT5 和DoHCT6，DoHCT2、7 顯著上調(diào)；在鹽脅迫處理（NaCl）中DoHCT4 表達顯著上調(diào)，DoHCT3、5、8 表達均顯著下調(diào)，其余DoHCTs與對照相比無明顯差異；PEG 處理后，除DoHCT8 表達與對照相比不明顯以及在DoHCT7 中未檢測到其表達以外，其余基因明顯下調(diào)，且DoHCT3下調(diào)最為顯著。值得注意的是DoHCTs在高溫（HT）脅迫下表達均下調(diào)，在DoHCT4、7 中未檢測到其表達；在低溫脅迫（LT）中，DoHCT1、2、8表達顯著上調(diào)，DoHCT4、6表達顯著下調(diào)，而DoHCT3、5、7 的表達與對照相比無明顯差異。

圖8 DoHCTs 在不同脅迫處理下的相對表達水平Fig. 8 Relative expression levels of DoHCTs under different stresses

3 討論與結(jié)論

鐵皮石斛作為我國傳統(tǒng)中藥材，具有較高的藥用價值。它不僅可以入藥，還能加工成保健用品，同時也可用于制作化妝品[18]。鐵皮石斛中黃酮類化合物和石斛酚具有多方面的生物活性?，F(xiàn)有研究表明，黃酮類化合物在抗氧化、抗衰老以及免疫調(diào)節(jié)等方面效果顯著[3,19]。石斛酚也同樣具有多種藥理作用。HCT 作為苯丙烷途徑中合成黃酮和木質(zhì)素兩種物質(zhì)分支點的重要酶，能夠調(diào)控木質(zhì)素與黃酮的含量，研究顯示，沉默擬南芥AtHCT會使得木質(zhì)素減少，黃酮化合物大量積累[6]，這一觀點被Chen 證實，他們通過在煙草和擬南芥中過表達CsHCTs，發(fā)現(xiàn)兩種植物的酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的含量都增加而黃酮含量降低[20]。Sebastien 等[13]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中HCT 沉默株生長表型依賴于苯丙烷途徑中查爾酮合成酶的表達，查爾酮合成酶的表達會使得植物種類黃酮化合物含量增加。

鐵皮石斛多生長在懸崖峭壁，當其遭受到環(huán)境脅迫時，會形成一些次生代謝產(chǎn)物來應(yīng)對脅迫的干擾，比如花青素、黃酮類、酚類、苯丙素等[20]，現(xiàn)研究已證明酚類化合物如木質(zhì)素以及黃酮化合物能夠提高植物的抗性[13]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在NaCl、PEG和LT（低溫）處理下，大部分HCT 基因的表達都下調(diào)，這與Chen 等[20]的結(jié)果一致。而張新業(yè)等[21]發(fā)現(xiàn)菊芋HtHCT同樣能夠響應(yīng)NaCl 和PEG 的脅迫，HtHCT在NaCl 和PEG 的脅迫下其表達量均顯著高于對照，這與本試驗結(jié)果有出入，這可能與不同物種的HCT在面對脅迫時的表達存在差異有關(guān)。ABA 脅迫處理后，DoHCT3、5、6 顯著下調(diào)，DoHCT2、7 顯著上調(diào)，尤其是DoHCT7，其表達量顯著高于野生型，由此我們推測DoHCT7 可能參與了ABA 信號通路，但還有待進一步證實。除了響應(yīng)ABA 外，菘藍IiHCT也能夠響應(yīng)外源茉莉酸甲酯（MeJA），且在 MeJA 的處理下IiHCT的相對表達量顯著升高[22]。組織差異表達分析發(fā)現(xiàn)DoHCTs可以在植物不同組織中表達，DoHCT1、4 在根中表達量較高，與樹莓PoptrHCT1、3、4、5在根中的表達一致[23]，而DoHCT3、5、6 在莖和葉中表達量較高，說明DoHCTs在不同的組織中功能有所差異。綜上，本文通過對鐵皮石斛HCT 家族成員進行分析和鑒定，探討了DoHCTs的生理生化性質(zhì)特點、在不同脅迫處理下以及鐵皮石斛根莖葉中的差異表達情況，證實了其在非生物脅迫應(yīng)答中起作用，為后續(xù)深入研究鐵皮石斛黃酮類化合物和石斛酚的生物合成提供數(shù)據(jù)支持。