張立群 肖堯 周曉陽 許曉東 蔡劍平
人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是人類基因組中最為復(fù)雜的遺傳多態(tài)基因,它位于人類第6號(hào)染色體短臂21區(qū)(6p21.3)。HLA是免疫識(shí)別和免疫監(jiān)視的重要效應(yīng)分子,是器官移植成功率的關(guān)鍵影響因素之一[1],HLA-A、B和DRB1三位點(diǎn)基因配型是器官移植中供者篩選的主要依據(jù)[1-2]。為給臨床移植提供可靠的配型數(shù)據(jù),HLA基因分型質(zhì)量受到了國內(nèi)外專家的高度重視,國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心組織的能力驗(yàn)證活動(dòng)是提高實(shí)驗(yàn)室HLA基因分型質(zhì)量的重要措施[3]。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心已開展了十幾年的HLA基因分型的能力驗(yàn)證工作[4],隨著HLA分型技術(shù)的不斷發(fā)展,本文對(duì)2017~2020年HLA基因分型PT項(xiàng)目的回報(bào)結(jié)果進(jìn)行了總結(jié),對(duì)產(chǎn)生的錯(cuò)誤以及導(dǎo)致錯(cuò)誤的原因進(jìn)行了分析,為HLA基因分型實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量提升提供數(shù)據(jù)支持。
1 材料
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及DNA質(zhì)控品的制備:培養(yǎng)人永生化HLA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株,長到合適密度后提取基因組DNA,測(cè)濃度并將最終濃度調(diào)整為80~120 ng/μL,純度(A260/A280)控制在1.80~1.95之間。按中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)(China National Accreditation Service for Conformity Assessment, 簡稱CNAS)文件CNAS-GL03《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》的要求[5],每個(gè)樣品編號(hào)隨機(jī)抽取10個(gè)樣品,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試濃度2次,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì),F(xiàn)α<0.05確認(rèn)質(zhì)控品均勻性符合要求;完成制備的樣本分別在室溫和4℃下進(jìn)行6個(gè)月的穩(wěn)定性檢驗(yàn),電泳法確認(rèn)其完整性,HLA分型檢測(cè)確認(rèn)基因型無改變以滿足穩(wěn)定性要求。
1.2 質(zhì)控品HLA型別的設(shè)計(jì)及確認(rèn)原則:以中國人群常見及確認(rèn)等位基因頻率為依據(jù),根據(jù)中國版CWD表確定需要開發(fā)的HLA基因型別。每個(gè)樣本的靶值采用2家以上廠商試劑3種以上檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn),必要時(shí)在PT活動(dòng)中根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室回報(bào)結(jié)果進(jìn)行修正。臨床樣本一般為抗凝全血,本質(zhì)控品為提取好的基因組DNA,基質(zhì)為TE緩沖液,參與實(shí)驗(yàn)室將質(zhì)控品視作提取好的DNA樣品直接使用。
2 方法
2.1 分發(fā)質(zhì)控品:HLA質(zhì)控品發(fā)放頻率為1次/年,發(fā)放數(shù)量為6支/次。
2.2 檢測(cè)位點(diǎn)和檢測(cè)時(shí)限要求:本PT項(xiàng)目的檢測(cè)位點(diǎn)為HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)(均為低分辨基因分型),要求實(shí)驗(yàn)室在收到質(zhì)控品后1周內(nèi)回報(bào)分型檢測(cè)數(shù)據(jù)(每個(gè)位點(diǎn)含兩個(gè)等位基因)。
2.3 對(duì)HLA基因分型結(jié)果的評(píng)價(jià):每個(gè)分型實(shí)驗(yàn)室需要返回18個(gè)基因分型數(shù)據(jù)(6支質(zhì)控品,每個(gè)質(zhì)控品3個(gè)位點(diǎn))。將所有實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析比對(duì)并與靶值數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)室對(duì)HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)基因分型檢測(cè)的總正確率和各位點(diǎn)的正確率,對(duì)錯(cuò)誤數(shù)據(jù)的產(chǎn)生原因進(jìn)行分析。
3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)等位基因錯(cuò)誤數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。年度間數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1 參與PT活動(dòng)實(shí)驗(yàn)室數(shù)量的變化 2017年參與本PT項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室為78家,2018年為82家,2019年為80家,2020年增加至96家,提示我國開展HLA低分辨基因分型檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn)室呈逐步增加的趨勢(shì)。
2 分型技術(shù)類別匯總 實(shí)驗(yàn)室采用的分型技術(shù)主要包括序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分型技術(shù)(polymerase chain reaction with sequence specific primers,PCR-SSP)、序列特異性寡核苷酸探針雜交-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分型技術(shù)(polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probe,PCR-SSO)和基于DNA序列的分型技術(shù)(sequencing-based typing,SBT)。2017~2020年采用的分型技術(shù)類別詳見表1。從表中可以看出,PCRSSP仍然是我國大多數(shù)HLA低分辨實(shí)驗(yàn)室采用的分型技術(shù),但PCR-SSO分型技術(shù)顯著增加,DNA測(cè)序技術(shù)占比較小增長率也不明顯。
表1 2017~2020年HLA基因低分辨分型PT活動(dòng)中實(shí)驗(yàn)室采用的技術(shù)類型
3 等位基因的錯(cuò)誤率分析 2017~2020年共收到回報(bào)等位基因數(shù)據(jù)12 096例,各年度的錯(cuò)誤數(shù)量詳見表2。分析發(fā)現(xiàn),2017~2020年各年度之間的數(shù)據(jù)總體錯(cuò)誤率有顯著性差異(Z=113.4,P<0.05)。2019年度錯(cuò)誤率顯著高于2018年,2018年度錯(cuò)誤率顯著高于2017年和2020年,2017年與2020年的錯(cuò)誤率沒有顯著差異。
表2 2017~2020年HLA基因低分辨分型回報(bào)錯(cuò)誤等位基因的統(tǒng)計(jì)[錯(cuò)誤數(shù)據(jù)例數(shù)/數(shù)據(jù)總例數(shù)(%)]
4 HLA低分辨基因分型錯(cuò)誤數(shù)據(jù)分析
4.1 總體情況:在2017年、2018年、2019年和2020年P(guān)T活動(dòng)中,分別有2家、4家、7家和3家實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)HLA分型錯(cuò)誤,占比分別為2.56%(2/78)、4.88%(4/82)、8.75%(7/80)、3.13%(3/96),其中2018年3號(hào)實(shí)驗(yàn)室(來自遼寧)的3個(gè)位點(diǎn)全部錯(cuò)誤(包括錄入錯(cuò)誤與選錯(cuò)位點(diǎn)的錯(cuò)誤),2019年6號(hào)和8號(hào)實(shí)驗(yàn)室(來自遼寧和四川)3個(gè)位點(diǎn)全部錯(cuò)誤且錯(cuò)誤相同(包括錄入錯(cuò)誤與選錯(cuò)位點(diǎn)的錯(cuò)誤),2019年9號(hào)和10號(hào)實(shí)驗(yàn)室(來自北京和江蘇)的DRB1位點(diǎn)全部上報(bào)為C位點(diǎn)且錯(cuò)誤相同,2020年13號(hào)實(shí)驗(yàn)室(來自廣東)的B位點(diǎn)全部錯(cuò)誤(表3)。
表3 2017年~2020年HLA基因分型檢測(cè)PT活動(dòng)中錯(cuò)誤結(jié)果明細(xì)
4.2 HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)分型錯(cuò)誤類別及來源分析:實(shí)驗(yàn)室分型錯(cuò)誤的類型主要包括技術(shù)錯(cuò)誤和人為錯(cuò)誤,技術(shù)錯(cuò)誤又分為雜合子的判別錯(cuò)誤和純合子的判別錯(cuò)誤,主要來源于對(duì)DNA序列識(shí)別的錯(cuò)誤或擴(kuò)增偏倚;人為錯(cuò)誤主要來源于填報(bào)位點(diǎn)錯(cuò)誤(如把A位點(diǎn)的數(shù)據(jù)填到了B位點(diǎn)等)和輸入錯(cuò)誤(如把結(jié)果編碼和分型結(jié)果進(jìn)行了混淆),詳見表4。實(shí)驗(yàn)室的分型錯(cuò)誤主要為人為錯(cuò)誤,連續(xù)4年來人為輸入錯(cuò)誤共計(jì)28份,填報(bào)位點(diǎn)錯(cuò)誤共計(jì)76份。
表4 2017~2020年HLA基因分型檢測(cè)HLA-A、-B、-DRB1各位點(diǎn)的錯(cuò)誤類型
4.3 檢測(cè)方法的錯(cuò)誤率比較:扣除錄入錯(cuò)誤及位點(diǎn)填報(bào)錯(cuò)誤等人為錯(cuò)誤類型后,將2017~2020年所有分析位點(diǎn)按SSP、SSO、SBT三種檢測(cè)方法的錯(cuò)誤率進(jìn)行比較,分析發(fā)現(xiàn),SSP分型方法的錯(cuò)誤率顯著高于SSO和SBT法(Z=6.22,P=0.045<0.05),詳細(xì)數(shù)據(jù)見表5。
表5 2017~2020年所有位點(diǎn)的分型方法錯(cuò)誤率統(tǒng)計(jì)[錯(cuò)誤例數(shù)/總例數(shù)(錯(cuò)誤率,%)]
能力驗(yàn)證是評(píng)估臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的有效工具,早在20世紀(jì)末國際上就已經(jīng)開展了HLA基因分型的PT活動(dòng)[6-10],2003年我國HLA低分辨分型的PT活動(dòng)開始啟動(dòng),由國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心(原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心)和中國造血干細(xì)胞資料庫管理中心質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)。本項(xiàng)PT活動(dòng)已在醫(yī)療機(jī)構(gòu)及第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)連續(xù)開展了17年,近4年的PT項(xiàng)目整體錯(cuò)誤率為1.05%,稍高于其他國家或地區(qū)[6-10]。近4年出現(xiàn)錄入錯(cuò)誤和填報(bào)位點(diǎn)錯(cuò)誤較多,說明還需要加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及結(jié)果上報(bào)人員的監(jiān)督和管理工作,以降低類似錯(cuò)誤的發(fā)生。
從近4年的統(tǒng)計(jì)分析中可以看出,約70%的實(shí)驗(yàn)室仍采用PCR-SSP法,23例等位基因錯(cuò)誤中有21例是由PCR-SSP法產(chǎn)生,2例由PCR-SSO法產(chǎn)生。下面對(duì)錯(cuò)誤產(chǎn)生的可能原因進(jìn)行分析:
(1)方法學(xué):23例技術(shù)錯(cuò)誤中,共有5例(21.7%)屬于純合子基因分型錯(cuò)誤,其中A位點(diǎn)2例、B位點(diǎn)2例、DRB1位點(diǎn)1例;共有18例(78.3%)屬于雜合子基因分型錯(cuò)誤,其中A位點(diǎn)3例、B位點(diǎn)12例、DRB1位點(diǎn)3例。23例錯(cuò)誤中21例均由PCRSSP技術(shù)產(chǎn)生,SSP方法的錯(cuò)誤率(0.26%)顯著高于SSO法(0.05%)和SBT法(0.00%),這主要是因?yàn)镾SP方法操作繁瑣、擴(kuò)增引物數(shù)量有限所致。下邊主要對(duì)PCR-SSP技術(shù)分型錯(cuò)誤進(jìn)行分析:
①DNA聚合酶:Taq酶加入量不足或質(zhì)量不過關(guān),將導(dǎo)致DNA擴(kuò)增效率下降,出現(xiàn)檢測(cè)偏倚;Taq酶加入量過多,假陽性擴(kuò)增條帶可能出現(xiàn),導(dǎo)致分型錯(cuò)誤[11]。
②電泳時(shí)加樣錯(cuò)誤:上樣孔數(shù)量太多,若加孔錯(cuò)誤將會(huì)導(dǎo)致假陽性或假陰性條帶的出現(xiàn)從而導(dǎo)致分型錯(cuò)誤。
③標(biāo)識(shí)錯(cuò)誤:陽性孔的位置標(biāo)識(shí)錯(cuò)誤,在判讀過程產(chǎn)生混淆。
④引物設(shè)計(jì)缺陷:引物擴(kuò)增位置設(shè)計(jì)不合理,導(dǎo)致擴(kuò)增偏倚。
⑤未及時(shí)更新新基因:如果新等位基因的頻率較高但試劑廠商未定期更新產(chǎn)品設(shè)計(jì),將會(huì)導(dǎo)致漏檢。
(2)試劑原因:近4年的能力驗(yàn)證參與實(shí)驗(yàn)室共采用了10余種不同廠商的PCR-SSP分型試劑,尚未發(fā)現(xiàn)HLA分型錯(cuò)誤結(jié)果與分型試劑間具有明顯的相關(guān)性。
(3)人為錯(cuò)誤:主要是填報(bào)位點(diǎn)錯(cuò)誤和人為錄入錯(cuò)誤。近4年P(guān)T出現(xiàn)的127例錯(cuò)誤數(shù)據(jù)中有104例(81.9%)屬于該類錯(cuò)誤。其中28例為錄入錯(cuò)誤,主要是將結(jié)果編碼和分型數(shù)據(jù)混淆所致;有76例為填報(bào)位點(diǎn)錯(cuò)誤,如A位點(diǎn)填入了B位點(diǎn)基因型,這種低級(jí)錯(cuò)誤應(yīng)杜絕發(fā)生,反映出某些實(shí)驗(yàn)室人員在檢測(cè)或上報(bào)結(jié)果時(shí)存在麻痹大意的情形。
綜上,2017~2020年度HLA分型錯(cuò)誤以HLA填報(bào)位點(diǎn)錯(cuò)誤發(fā)生率最高,錄入錯(cuò)誤次之,分型技術(shù)錯(cuò)誤占比最小。分型技術(shù)錯(cuò)誤中以PCR-SSP方法為主,這與以往的報(bào)道相一致[12]。需要特別注意的是,在該4年度PT活動(dòng)中,6/8號(hào)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)了A、B和DRB1三個(gè)位點(diǎn)全部相同的錯(cuò)誤, 9/10號(hào)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)了DRB1位點(diǎn)完全相同的錯(cuò)誤,這在常規(guī)檢測(cè)過程中幾乎是不可能出現(xiàn)的,需要引起相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的高度警惕。
PT作為質(zhì)量管理的一部分,可輔助HLA分型實(shí)驗(yàn)室鑒別實(shí)驗(yàn)過程及檢測(cè)報(bào)告出具過程中存在的問題和偏差,以便及時(shí)采取糾正措施。能力驗(yàn)證報(bào)告發(fā)布后,各參與實(shí)驗(yàn)室結(jié)合能力驗(yàn)證報(bào)告對(duì)錯(cuò)誤結(jié)果進(jìn)行剖析并對(duì)相關(guān)人員進(jìn)行培訓(xùn)教育,實(shí)驗(yàn)室的HLA分型檢測(cè)水平可獲得顯著提升[13]。由于本項(xiàng)目質(zhì)控品為提取好的人類基因組DNA,無法對(duì)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的DNA提取過程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控,這也是本質(zhì)控品的不足之處。作為能力驗(yàn)證項(xiàng)目的提供者,我們將竭盡所能提供高質(zhì)量的人類基因組質(zhì)控品,按時(shí)發(fā)布每年的能力驗(yàn)證報(bào)告,及時(shí)進(jìn)行學(xué)術(shù)交流和溝通,與各實(shí)驗(yàn)室一道為我國HLA基因分型檢測(cè)水平的提升作出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突