張一琦，陳 欣，聶志妍，鄭永貴，蘇佳純

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染最常見的病原菌之一，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛應用，我國碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的檢出率逐年增加[1]，且其感染已經(jīng)對臨床構(gòu)成嚴重威脅。多黏菌素類抗生素（包括黏菌素、多黏菌素B）是一類從多黏芽孢桿菌培養(yǎng)液中提取得到的多肽類抗生素，對多數(shù)革蘭陰性菌有抗菌作用，其耐藥菌檢出率較低，但目前有研究表明對多黏菌素的耐藥率有增加趨勢[2-3]。作為抗擊多重耐藥革蘭陰性菌的“最后一道防線”，如何減少其耐藥的發(fā)生就顯得尤為重要。有文獻報道，黏菌素在臨床使用中可使CRKP出現(xiàn)染色體突變，從而介導對黏菌素耐藥[4]。本研究通過體外黏菌素的選擇性壓力作用，獲取對黏菌素的耐藥突變株，并通過全基因組二代測序分析，研究其耐藥的形成機制，為臨床科學合理使用黏菌素、減少黏菌素耐藥CRKP的傳播和蔓延提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853，以及CRKP臨床分離株（CRKP 12-130），均為復旦大學附屬華山醫(yī)院抗生素研究所凍存菌株。

1.1.2 儀器與試劑 細菌比濁儀（法國生物梅里埃公司）、ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Mueller Hinton（MH）瓊脂和營養(yǎng)瓊脂為英國OXIOD公司商品、陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯（CAMHB）為美國BD公司商品，黏菌素標準品購自中國食品藥品鑒定研究院。

1.2 方法

1.2.1 黏菌素自發(fā)耐藥突變菌株的選擇 將臨床分離菌CRKP 12-130復蘇后，取單個菌落接種到新平板上分區(qū)劃線，從中挑取單個菌落接種至 5 mL MH肉湯培養(yǎng)37℃過夜，次日對菌液采用平板菌落計數(shù)法計算100 μL菌液所含菌落的數(shù)量作為初始菌落數(shù)。同時取100 μL CRKP 12-130菌液涂布于分別含2、4、8、16、32倍MIC黏菌素的MH瓊脂平板，連續(xù)5 d觀察不同黏菌素濃度的MH瓊脂平板上CRKP 12-130菌株的生長情況。對不同黏菌素濃度平板上長出的菌落進行計數(shù)、編號，隨機取50個菌落，并將其接種至不含黏菌素的新鮮MH瓊脂平板，連續(xù)傳代10次。

按美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法進行藥敏測定及結(jié)果判讀（MIC≥4 mg/L判定為對黏菌素耐藥）[5]。通過計數(shù)細菌的初始總菌落數(shù)，以及黏菌素不同抗生素濃度下選擇獲得的耐藥菌落數(shù)計算突變頻率，計算公式為：突變頻率=篩選平板上總菌落數(shù)×耐藥率/初始菌落數(shù)。

1.2.2 突變株細菌基因組DNA提取和測序 隨機取不同黏菌素MIC的CRKP 12-130耐藥突變株40株，以及CRKP 12-130原始株，采用由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302），按照說明書操作步驟，提取細菌基因組DNA；將基因組DNA采用Illumina二代測序平臺進行測序，測序數(shù)據(jù)拼接后與黏菌素敏感肺炎克雷伯菌HS11286參考序列（GenBank序列號：NC_016845.1）進行比對，分析其耐藥相關(guān)突變情況。

1.2.3mgrB基因PCR檢測 根據(jù)二代測序分析結(jié)果，利用mgrB基因兩翼序列（KPHS-33450和KPHS-33620）進行聚合酶鏈反應（PCR）引物設(shè)計（見圖1），引物序列為mgrB-yz1-Fs：ata agc cac gct taa cca atc g與mgrB-yz1-Rs：cgc ctg aca tta acg cct tcg，PCR產(chǎn)物151 bp，以TaKaRa DL2000為DNA marker時mgrB基因缺失菌株的PCR產(chǎn)物會在100 bp與250 bp間出現(xiàn)條帶；而無mgrB基因缺失的菌株由于兩引物間超過15 kb，72℃延伸30 s擴增條件下將不會獲得PCR產(chǎn)物。采用煮沸法制備細菌DNA模板。PCR反應體系總體積50 μL，包括DNA模板3 μL，相應上、下游引物各2 μL（10 μmol/L），PCR反應試劑Mix 25 μL，ddH2O 18 μL。PCR擴增條件94℃預變性5 min；94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸30 s；共循環(huán)35次；72℃延伸5 min。

采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后經(jīng)SYBR GreenⅠ染色30 min后在ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，分析菌株中mgrB基因發(fā)生變異的情況，如在100 bp與250 bp間出現(xiàn)PCR產(chǎn)物條帶，表明受試菌株存在mgrB基因完全缺失。

2 結(jié)果

2.1 CRKP 12-130對黏菌素的耐藥突變頻率

通過平板菌落計數(shù)法計算出100 μL CRKP 12-130過夜培養(yǎng)菌液的初始菌落數(shù)為5.3×107CFU/mL。 涂布于含2倍MIC（0.5 mg/L）、4倍MIC（1 mg/L）、8倍MIC（2 mg/L）、16倍MIC（4 mg/L）、32倍MIC（8 mg/L）黏菌素藥物濃度的MH瓊脂平板，5 d后菌落計數(shù)結(jié)果顯示2倍MIC平板上生長400個、4倍MIC平板上生長193個、8倍MIC平板上生長300個、16倍MIC平板上生長270個、32倍MIC平板上生長206個。

采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定黏菌素對細菌的MIC，黏菌素對質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853的MIC分別為 0.25 mg/L和0.5 mg/L，均在質(zhì)控范圍內(nèi)；250株待測菌中，230株（92.0%）顯示對黏菌素耐藥。從含2倍、4倍、8倍、16倍、32倍MIC黏菌素的選擇平板上獲得細菌耐藥的占比分別是66%、94%、100%、100%、100%；根據(jù)耐藥突變菌落數(shù)和初始菌落數(shù)計算CKRP對黏菌素的耐藥突變頻率。見表1。

表1 不同黏菌素濃度平板上獲得250株肺炎克雷伯菌菌株的藥敏結(jié)果及耐藥突變頻率Table 1 Mutation frequency of colistin resistance and susceptibility of 250 strains of Klebsiella pneumoniae obtained on selective plate containing different concentrations of colistin

2.2 黏菌素耐藥相關(guān)基因檢測

本研究挑選了40株不同黏菌素耐藥水平的CRKP進行全基因組二代測序，結(jié)果顯示，15株菌株存在mgrB基因缺失，同時伴隨mgrB基因兩側(cè)KPHS-33560和KPHS-33580序 列（GenBank序列號：NC_016845.1）的缺失。2株菌株存在mgrB基因位置相同的部分缺失突變。2株菌株的mgrB基因中出現(xiàn)了堿基的替換突變（G82C），并導致變異（Gly28Cys）。這些菌株的MIC值在16～128 mg/L，表現(xiàn)出高水平耐藥。測序菌株的phoP、pmrA、pmrB基因均為野生型，未發(fā)生突變，見表2。

表2 黏菌素耐藥突變菌株的全基因組二代測序分析結(jié)果Table 2 Genomic variation of colistin-resistant mutants by whole-genome second-generation sequencing analysis

通過PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，在230株從2倍、4倍、8倍、16倍和32倍MIC黏菌素選擇平板上獲得的黏菌素耐藥CRKP菌株中分別有18株、21株、22株、15株、23株，在100 bp與250 bp間存在PCR產(chǎn)物條帶，共計99株mgrB基因完全缺失菌株。

3 討論

本研究將臨床分離的CRKP通過微量肉湯稀釋法測定其MIC，并通過含不同黏菌素濃度選擇、計算CRKP菌株的突變株和突變頻率，發(fā)現(xiàn)含8倍MIC（2 mg/L）黏菌素選擇濃度中突變頻率最高，為5.66×10-6，含16倍MIC（4 mg/L）和2倍MIC （0.5 mg/L）黏菌素選擇濃度中突變頻率次之，分別為5.09×10-6和4.98×10-6，含32倍MIC（5 mg/L）和4倍MIC（1 mg/L）黏菌素選擇濃度中突變頻率略低，分別為3.88×10-6和3.42×10-6。綜上，表明肺炎克雷伯菌臨床分離株在黏菌素暴露后易發(fā)生耐藥相關(guān)突變，臨床使用黏菌素進行肺炎克雷伯菌感染的治療中有很大概率選擇出耐藥突變菌株，不同濃度黏菌素的選擇壓力下均可選擇出耐藥突變株，提示在黏菌素單藥治療期間需謹防耐藥突變株出現(xiàn)。

我們在獲得的黏菌素耐藥株中挑選了40株，其MIC范圍為4～128 mg/L，借助全基因組二代測序并結(jié)合生物學信息分析，發(fā)現(xiàn)此次耐黏菌素突變株中mgrB基因的缺失是最常見的突變。之前的研究顯示，mgrB基因?qū)hoPQ雙組分系統(tǒng)起著負反饋調(diào)節(jié)的作用[6]。當mgrB基因發(fā)生插入失活而無法正確表達時，PhoPQ雙組分系統(tǒng)將過度表達，進而激活pmrHFIJKLM操縱子[7]。pmrHFIJKLM操縱子的產(chǎn)物能夠合成4-氨基阿拉伯糖（L-Ara4N），通過在脂質(zhì)A上添加正電荷，降低其與黏菌素的親和力，而導致耐藥[8]。同時，我們根據(jù)mgrB基因缺失耐藥株兩端存留序列設(shè)計引物，進行PCR擴增并電泳分析，結(jié)果顯示有99株菌株在100 bp與250 bp間出現(xiàn)PCR產(chǎn)物條帶，為mgrB基因缺失的菌株。上述結(jié)果可推測，本組資料顯示的mgrB基因突變可能在多黏菌素耐藥性產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用。

PhoP是PhoPQ雙組分系統(tǒng)的組成部分，與pmrA和pmrB編碼的pmrAB雙組分系統(tǒng)共同調(diào)控L-Ara4N的合成和pmrHFIJKLM操縱子表達[9]。 有研究人員觀察到肺炎克雷伯菌中phoP基因上單個氨基酸Asp191Tyr的改變將致使phoP基因非正常表達，進而導致耐藥[7]。pmrA和pmrB基因的突變可能會引起pmrAB系統(tǒng)的激活，使pmrC和pmrHFIJKLM操縱子上移，促使陽離子基團添加到細菌脂多糖的脂質(zhì)A上，進而形成對多黏菌素的耐藥性[10]。本研究挑選不同黏菌素耐藥水平的突變株進行耐藥相關(guān)基因序列分析，結(jié)果顯示phoP、pmrA、pmrB基因均為野生型，未發(fā)生突變，相較mgrB基因，phoPQ、pmrAB雙組分系統(tǒng)在黏菌素選擇壓力下有更好的穩(wěn)定性。

綜上，CRKP菌株暴露于不同濃度黏菌素時，可快速選擇出突變耐藥株，推測臨床使用黏菌素治療CRKP感染時，細菌染色體可能發(fā)生變異，進而導致耐藥及治療失?。籱grB基因突變是導致CRKP對黏菌素耐藥的主要機制，在使用黏菌素過程中應關(guān)注此類現(xiàn)象的發(fā)生，加強防范。此外，由于本研究測試菌株少，實驗未進行多次重復等不足，后續(xù)將納入更多臨床分離株，開展進一步研究，明確此類耐藥形成現(xiàn)象是否具有普遍性，為防控提供參考依據(jù)。