韓振興，劉丹丹，王夢夢，余晨銳，胡紫薇，黃志陽，聶光軍

(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

菌落的總數(shù)指標在醫(yī)學(xué)藥物、生物制品、食品安全等很多方面被用來判斷被細菌污染的程度和衛(wèi)生質(zhì)量。菌落數(shù)的測定方法很多，Howard[1]于1881年首次將瓊脂平板培養(yǎng)法用于微生物的檢測，如今瓊脂平板培養(yǎng)法仍然是國標標準規(guī)定的微生物檢測方法之一。該方法通過觀察肉眼可見的單細胞菌落，人工計數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出樣品中的菌落總數(shù)。雖然成本低、操作簡單，但工作量大、用時長、分析誤差大、效率低，致使實時監(jiān)測結(jié)果滯后[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，全自動菌落計數(shù)儀已應(yīng)用于各領(lǐng)域，郭佳等[3]提出Microbio 全自動菌落計數(shù)與普通平板計數(shù)法在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。Smith等[4]應(yīng)用成像站進行快速菌落計數(shù)。梁春梅等[5]將全自動菌落計數(shù)儀應(yīng)用于乳品檢測，自動菌落計數(shù)儀與目測法無顯著性差異，但是樣品顏色及顆粒大小對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。近幾年，利用聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)[6]測定細胞生成物來測定菌落總數(shù)和利用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)[7]方法測定抗體含量來測定菌落數(shù)，PCR和ELISA方法準確度高，操作簡便，但儀器復(fù)雜、耗時長、成本較高，不適用于快速、批量檢測。

納豆芽孢桿菌合成的蛋白酶可降解酪蛋白,在其平板上形成透明圈，酶活力大小與透明圈大小呈線性關(guān)系。因此，通過觀察透明圈與菌落面積的比例(圈徑比)即可對菌落進行快速篩選[8]。本方法應(yīng)用MATLAB處理微生物菌落數(shù)字圖片，進而開發(fā)計數(shù)與篩選程序，實現(xiàn)微生物菌落的快速計數(shù)與篩選。主要研究：在計數(shù)方面，初步研究了照片采集、菌種濃度和不同培養(yǎng)時間對計數(shù)準確性的影響；在篩選方面，基于菌落與透明圈部分像素點數(shù)目的比值來計算圈徑比的菌株篩選準確率。本方法有望提升菌落計數(shù)與篩選的方便性、經(jīng)濟性和實用性。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與儀器

試劑與材料：納豆枯草芽孢桿菌(實驗室保藏)，牛肉浸膏、葡萄糖、瓊脂、氯化鈉、蛋白胨和干酪素(均購自國藥集團)。儀器：PH104A恒溫培養(yǎng)箱、OPPO手機相機、SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋、TA-214電子天平、HP GT5820打印機和打孔器。

1.2 菌種培養(yǎng)

從50 mL培養(yǎng)基中取2.5 mL(即5%的接種量)納豆芽孢桿菌于種子培養(yǎng)基(牛肉浸膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、氯化鈉 5 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0)中活化，將培養(yǎng)基放入37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)14 h。將菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀釋后，分別吸取100 μL稀釋后菌液涂布于固體培養(yǎng)基(牛肉浸膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、氯化鈉 5 g/L、瓊脂糖15 g/L、pH 7.0)中，37 ℃培養(yǎng)18 h(空白對照為無菌水)。再選用合適濃度的活化菌液分別涂布于打孔和未打孔的酪蛋白平板(脫脂奶粉50 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0)中，37 ℃培養(yǎng)18 h，拍照留存。

1.3 圖像采集

采集方式：拍照。將待計數(shù)的培養(yǎng)平板放置于避光紙箱內(nèi)，打開箱底的燈補光，將手機置于培養(yǎng)基正上方合適的位置，對菌落進行拍照[9]。

1.4 圖像處理

(1)二值化。相對于灰度化的圖片，二值化圖像是沒有色度梯度的圖片，便于菌落鑒別與計數(shù)。因此，本方法首先將灰度化照片二值化。應(yīng)用MATLAB將上述菌群照片轉(zhuǎn)化成只有0和1兩個元素的矩陣的二值圖像，并對二值圖像中0元素和1元素的總數(shù)以及矩陣中元素的分布進行統(tǒng)計及分析。對菌落計數(shù)的培養(yǎng)基圖片進行處理，菌落為白色，其他部分為黑色。將產(chǎn)透明圈的培養(yǎng)基其圈徑比的計數(shù)方式分為打孔組和未打孔組，對于打孔組將孔徑邊緣處理為白色，孔徑和透明圈處理為黑色，未打孔組透明圈處理為黑色，其他部分為白色。

(2)去噪點。噪點即圖像噪聲，在光信號變換時易分布不均，在噪音傳播時會產(chǎn)生誤差[10]，圖像信號在生成、傳播以及記錄時都會被其干擾，給畫面分析造成難度。為使畫質(zhì)更加清晰，需消除圖片中的噪點，并且對畫面變形的地方進行處理[11]。傳統(tǒng)的圖像去噪點方法大體分為兩類：空間域濾波和頻域濾波。常用的空間域濾波方法有均值濾波、中值濾波等。本實驗采用中值濾波的方式對圖像進行降噪處理。

(3)菌落計數(shù)程序設(shè)計。菌落計數(shù)源代碼如圖1所示。在圖1子程序模板[12]的基礎(chǔ)上，更改讀取照片名稱以及閾值大小。

圖1 菌落計數(shù)源代碼

此程序首先讀取模板圖片“rice.png”，將模板圖片二值化處理后，整體讀取二值圖片，統(tǒng)計元素為1的白色區(qū)域個數(shù)n，定義一個橫向矩陣(n)，把n個白色區(qū)域逐一代入，統(tǒng)計出每一個白色區(qū)域元素的個數(shù)，即區(qū)域(點菌落)大小，去除過小的雜點區(qū)域，自定義過大的黏連區(qū)域后，可統(tǒng)計出平板上的菌落數(shù)。

(4)菌落篩選程序設(shè)計。其中此子程序的一段如圖2所示。實際運行時需要更改讀取的照片名稱以及閾值大小。為了使透明圈圖片為一個界限分明、較為理想的圖片，自定義灰度圖片中灰度值大于100的均等于255，小于100的均等于0。

圖2 子程序一段 圖3 子程序二段

子程序二段如圖3所示。經(jīng)過子程序一段處理后圖片定為tt1，對該圖片進行二值化處理，統(tǒng)計透明圈像素點總數(shù)a，統(tǒng)計菌落像素點總數(shù)b。圈徑比公式：

1.5 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)好的平板取出后，以人工計數(shù)為對照，比較分析本方法的準確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 照片采集對計數(shù)的影響

MATLAB處理菌落計數(shù)照片時，在稀釋度相同的條件下，以不同的光照強度(強光和弱光)拍取圖片，進行菌落計數(shù)及篩選。結(jié)果顯示：強光對圖片的獲取不利，強光拍攝的圖片整體過度曝光，易將細小的菌群忽略；弱光拍攝圖片整體過暗，易把培養(yǎng)基中的氣泡也拍成菌群；在光源均勻的適當高光下，拍出來的圖片利于軟件處理，基于程序算法可以在最大程度上排除干擾。因此，本文后續(xù)在暗盒強光[13]條件下選擇LED燈帶作為照片拍攝的最佳光源。

2.2 菌體培養(yǎng)時間的影響

培養(yǎng)時間對菌落分布影響圖如圖4所示。將1 mL稀釋度為10-6菌液涂布于平板中，分別培養(yǎng)21、24、27、30 h，進行菌落計數(shù)。結(jié)果顯示： 當培養(yǎng)21 h和24 h，平板上菌落較稀疏時，能保持有效的計數(shù)結(jié)果，當培養(yǎng)27 h和30 h，菌體較稠密時，現(xiàn)有的菌落計數(shù)儀難以維持較為精準的結(jié)果，且操作重復(fù)性較低；將培養(yǎng)不同時間后的菌落平板照片，應(yīng)用本方法計數(shù)后，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)時間較短的情況下，算法程序能夠準確無誤地進行計數(shù)，當培養(yǎng)時間過長，平板上的菌落較濃稠時，二值化處理的圖片有部分菌落相粘連，對后面計數(shù)操作帶來一定影響，應(yīng)合理地進行粘連分割。因此，后續(xù)最佳菌落培養(yǎng)時間選擇24 h。

圖4 培養(yǎng)時間對菌落分布影響圖

2.3 菌種濃度的影響

在相同的培養(yǎng)條件下，分別將10-1、10-3、10-5這3種高中低稀釋度的菌液接種在培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出平板進行計數(shù)統(tǒng)計。在菌液稀釋度為10-3、10-5時，平板上的菌落較為稀疏，人工計數(shù)法可以保證計數(shù)的準確性。在菌液濃度為10-1時，人工計數(shù)法工作量較大，誤差較大，難以保持計數(shù)的準確性。軟件對拍攝清晰、菌落分布均勻、氣泡較少的菌落圖片分析效果非常準確，對于菌落密集及有粘連的平板，為了得到更加精準的結(jié)果，需要進一步對粘連的菌株進行分割。

(1)低濃度(菌液稀釋度為10-5)的影響。菌液稀釋度為10-5時圖片處理結(jié)果如圖5所示。采用人工計數(shù)，菌落數(shù)量為65個；MATLAB處理去除19個區(qū)域值小于500的域，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

表1 MATLAB處理計數(shù)1號統(tǒng)計表

區(qū)域大小范圍/個區(qū)域范圍內(nèi)個數(shù)/個菌落個數(shù)/個6 000～9 0001315 000～19 00025

(2)中等濃度(菌液稀釋度為10-3)的影響。菌液稀釋度為10-3時圖片處理結(jié)果如圖6所示。采用人工計數(shù)，菌落數(shù)量為567個。MATLAB處理去除25個區(qū)域值小于100的域，統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。

表2 MATLAB處理計數(shù)2號統(tǒng)計表

區(qū)域大小范圍/個區(qū)域范圍內(nèi)個數(shù)/個菌落個數(shù)/個1 200～1 500661 500～2 100272 400～2 70029

(3)高濃度(菌液稀釋度為10-1)的影響。菌液稀釋度為10-1時圖片處理結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌落數(shù)量較多且粘連嚴重，人工難以進行計數(shù)。 MATLAB處理去除19個區(qū)域值小于10的域，統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。

由計算結(jié)果可知，在高、中、低3種不同稀釋度情況下，本法得出的結(jié)果與人工計數(shù)相比準確率均在90%以上，表明本方法的有效性。

表3 MATLAB處理計數(shù)3號統(tǒng)計表

區(qū)域大小范圍/個區(qū)域范圍內(nèi)個數(shù)/個菌落個數(shù)/個600～70048800～1 0003101 200～1 3001151 300～1 4002171 600～1 800120

圖5 菌液稀釋度為10-5時圖片處理結(jié)果

圖6 菌液稀釋度為10-3時圖片處理結(jié)果

圖7 菌液稀釋度為10-1時圖片處理結(jié)果

2.4 基于圈徑比的菌株篩選

圖8a為實驗培養(yǎng)平板圖片，該透明圈的大小合適，人工計算圈徑比可操作，將原始圖片處理得到二值化圖片輸入到運行代碼中即測得該透明圈的圈徑比P=1.529 3，人工測得的圈徑比P=1.674 2；精確度=1.529 3/1.674 2×100%=91.34%。

圖8 圖片處理結(jié)果

圖9a為實驗培養(yǎng)平板圖片，該透明圈細小，人眼難以觀察，篩選工作無法進行。在高光下對透明圈進行拍照取圖,二值化圖片后輸入到運行代碼中，可得該透明圈的圈徑比P=6.503 5。由上述結(jié)果可知，本方法與人工計算結(jié)果準確率都在90%以上。表明本方法可以快速有效進行菌落篩選，一定程度上提升菌種篩選的效率。

圖9 圖片處理結(jié)果

3 討論

本文主要以納豆枯草芽孢桿菌作為實驗菌來探究菌落計數(shù)及篩選方法。利用MATLAB處理數(shù)字圖像開發(fā)的菌落計數(shù)及篩選程序，以人工計數(shù)的結(jié)果為對照，比較分析本程序的準確性。在MATLAB軟件主程序的基礎(chǔ)上進行子代碼程序的設(shè)計，初步完成了菌落計數(shù)與篩選，探究了圖像采集、菌種濃度和培養(yǎng)時間對于本方法準確性的影響。未來，可以通過較為復(fù)雜的子程序設(shè)計，實現(xiàn)菌落照片的自動化處理及提高準確性。進一步改進子程序，處理較為復(fù)雜的圖像，針對粘連圖片建立多種應(yīng)答機制，是本方法持續(xù)改進的一個方向。