許春芳，余春平

（武漢能邁科實(shí)業(yè)有限公司，湖北 武漢 430000）

0 引言

肉桂酸又名桂皮酸、3 -苯丙烯酸，是中藥肉桂的有效活性成分。肉桂酸具有良好的抑菌、抗腫瘤、消炎等活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)中[1-2]。肉桂酸幾乎不溶于水，實(shí)際應(yīng)用時(shí)常使用鉀鹽，即肉桂酸鉀。肉桂酸鉀在飼料、水果保鮮、護(hù)膚品等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)給大鼠長(zhǎng)期喂飼肉桂酸鉀，不會(huì)出現(xiàn)肝臟蓄積中毒，也無(wú)胚胎毒性表現(xiàn)[3]。肉桂酸鉀LD50遠(yuǎn)小于苯甲酸鈉，安全性明顯比苯甲酸鈉高[4]。肉桂酸鉀對(duì)細(xì)菌、黑曲霉、青霉、單核細(xì)胞李斯特菌等有較好的抑菌效果[5]。此外，肉桂酸鉀還有較好的抗氧化能力，對(duì)酪氨酸酶有極好的抑制能力，能減少黑色素的生成[6-7]。以大腸桿菌為供試菌種，得出了肉桂酸鉀及其他3 種食品防腐劑對(duì)大腸桿菌的抑菌率，并繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。以期為肉桂酸鉀的防腐應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

大腸桿菌（CMCC（B）44103）；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；75%酒精、95%酒精，武漢興和達(dá)商貿(mào)有限公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司提供；苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉，河南萬(wàn)邦化工科技有限公司提供；肉桂酸鉀，武漢能邁科實(shí)業(yè)有限公司提供。

BBS-DDC 型超凈工作臺(tái)，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DGL-35B 型高壓蒸汽滅菌鍋，上海力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；UV752N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；FA1004 型電子天平，上海力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；DHP-360 型恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；SZ-93 型自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化培養(yǎng)

配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于121 ℃下高溫高壓滅菌15 min。無(wú)菌操作條件下用75% 酒精擦拭大腸桿菌安瓿瓶，打開(kāi)安瓿瓶。吸取0.5 mL 液體培養(yǎng)基到安瓿瓶里，充分溶解后。將菌液全部吸出轉(zhuǎn)入裝有培養(yǎng)基的試管中，混合均勻?qū)⒃嚬芊湃?6 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，于121 ℃下高溫高壓滅菌15 min。無(wú)菌操作下將培養(yǎng)基注入試管中，制成斜面。用接種環(huán)挑取上述步驟培養(yǎng)后的菌液一環(huán)，劃線接種到試管斜面上。將試管放入36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

培養(yǎng)好的一部分試管斜面放入4 ℃冰箱中保存，即為保存菌種。用接種環(huán)挑取菌苔至牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基上，劃線接種。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即為工作菌種。

1.2.2 菌懸液的制備

配制0.85%生理鹽水、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于121 ℃下高溫高壓滅菌15 min。無(wú)菌操作下取適量工作菌種溶解于100 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基數(shù)中，混合均勻，得大腸桿菌菌懸液。

菌懸液的濃度采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算。配制平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，于121 ℃下高溫高壓滅菌15 min。無(wú)菌操作下將上述配制的菌懸液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6CFU/mL，取1×10-4，1×10-5，1×10-6CFU/mL 3 個(gè)濃度的菌懸液及無(wú)菌生理鹽水各1 mL 至培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度2 個(gè)平行，加入15～20 mL 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，冷卻凝固后將培養(yǎng)皿倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。計(jì)算菌懸液的濃度。

1.2.3 防腐劑溶液的配制

用生理鹽水配制40 g/kg 苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、肉桂酸鉀溶液；并將4 種防腐劑用生理鹽水逐級(jí)稀釋至20.0，10.0，5.0，2.5 g/kg。于121 ℃下高溫滅菌15 min，備用。

1.2.4 抑菌活性的測(cè)定

配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、0.85%生理鹽水，于121 ℃下高溫滅菌15 min，備用。在無(wú)菌條件下向含有8.9 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，試驗(yàn)組加入1 mL 防腐劑溶液、0.1 mL 菌懸液；陽(yáng)性對(duì)照組用無(wú)菌水取代防腐劑，陰性對(duì)照組用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基取代菌液（用于調(diào)零）。所有試管中的培養(yǎng)液總體積均為10 mL，使各防腐劑的終質(zhì)量濃度分別為4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 g/kg。將體系充分混勻后于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

于波長(zhǎng)560 nm 處，用陰性對(duì)照組培養(yǎng)液調(diào)零，檢測(cè)樣品培養(yǎng)液的吸光度，換算抑菌率：

1.2.5 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取若干250 mL 錐形瓶，各加入44 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分別加入1 mL 菌懸液、5 mL 40 g/kg 肉桂酸鉀溶液，分別編號(hào)為0，1.5，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0 h。40 g/kg 苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉操作方法同上。同時(shí)，用無(wú)菌水代替防腐劑做陽(yáng)性對(duì)照，用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基取代菌懸液做陰性對(duì)照（空白調(diào)零）。最終各防腐劑的質(zhì)量濃度均為4 g/kg。將體系充分混合后于37 ℃下振蕩培養(yǎng)，按對(duì)應(yīng)時(shí)間將培養(yǎng)液取出，立刻放入4 ℃冰箱中儲(chǔ)存，待所有培養(yǎng)液培養(yǎng)結(jié)束后一同測(cè)OD 值。

在波長(zhǎng)600 nm 處，用陰性對(duì)照培養(yǎng)液調(diào)零，檢測(cè)培養(yǎng)液的吸光度，對(duì)含不同防腐劑不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)液從0 h 起開(kāi)始測(cè)定，記錄OD600值。

2 結(jié)果與分析

配制的菌懸液經(jīng)平板計(jì)數(shù)法測(cè)得濃度為5×106CFU/mL。

不同濃度肉桂酸鉀對(duì)大腸桿菌抑菌作用見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度肉桂酸鉀對(duì)大腸桿菌抑菌作用

由圖1 可知，質(zhì)量濃度為0.25～4.00 g/kg 時(shí)，4 種防腐劑對(duì)大腸桿菌的抑菌作用隨著濃度的增大抑菌率逐漸增加，表明4 種防腐劑對(duì)大腸桿菌均有一定程度的抑制作用。對(duì)大腸桿菌的抑菌能力大小為肉桂酸鉀＞脫氫乙酸鈉＞山梨酸鉀＞苯甲酸鈉。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 g/kg 時(shí)，4 種防腐劑的抑菌率依次為85.09%±0.79%，78.03%±1.89%，66.39%±2.51%，58.2%±0.58%。結(jié)果表明，肉桂酸鉀對(duì)大腸桿菌的抑菌作用強(qiáng)過(guò)其他3 種防腐劑，是一種潛力較大的抑菌劑。肉桂酸鉀做為肉桂酸的鉀鹽，帶有肉桂香氣，通常被當(dāng)作食品香精香料來(lái)使用。近年來(lái)，肉桂酸鉀的防腐能力被越來(lái)越多的人所了解，在食品、飼料工業(yè)中也多有應(yīng)用，如醬腌菜、飲料、休閑食品等。作為一種新型的香料型防腐劑，肉桂酸鉀用在食品中，既起到調(diào)節(jié)食品氣味的作用，也起到抑菌防腐的功效，即用最少的量就可以滿足多種功效。

繪制大腸桿菌分別在濃度為4 g/kg 肉桂酸鉀，4 g/kg 脫氫乙酸鈉，4 g/kg 山梨酸鉀，4 g/kg 脫氫乙酸鈉作用下10 h 內(nèi)的生長(zhǎng)曲線，并與不加任何防腐劑（即生理鹽水）的生長(zhǎng)曲線比較。

大腸桿菌在4 g/kg 防腐劑作用下的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 大腸桿菌在4 g/kg 防腐劑作用下的生長(zhǎng)曲線

由圖2 可知，大腸桿菌在前2 h 內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，從第2 個(gè)小時(shí)開(kāi)始，生長(zhǎng)速度逐漸加快。與不加任何防腐劑的菌液相比，加4 種防腐劑中的任意一種防腐劑的菌液生長(zhǎng)速度都會(huì)減慢，只是隨著所加防腐劑的不同，減慢的程度不同、到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期的時(shí)間也不同。對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)速度影響大小為肉桂酸鉀＞脫氫乙酸鈉＞山梨酸鉀＞苯甲酸鈉，肉桂酸鉀對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)速度影響最顯著。

3 結(jié)論

通過(guò)檢測(cè)肉桂酸鉀及其他3 種防腐劑對(duì)大腸桿菌的抑菌率、繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，從而確定了4 種防腐劑對(duì)大腸桿菌抑制能力大小為肉桂酸鉀＞脫氫乙酸鈉＞山梨酸鉀＞苯甲酸鈉。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 g/kg 時(shí)，肉桂酸鉀、脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀對(duì)大腸桿菌的抑菌率依次為85.09%±0.79%，78.03%±1.89%，66.39%±2.51%，58.2%±0.58%，肉桂酸鉀對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)速度影響最顯著，強(qiáng)過(guò)其他3 種傳統(tǒng)的食品防腐劑。為肉桂酸鉀的抑菌性能提供試驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)了肉桂酸鉀有較強(qiáng)的抑菌能力，是一種潛力巨大、安全高效的食品防腐劑，可以廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)中。