◎ 王孟華，張國龍，金 鑫，蔡衛(wèi)國，竇 天，申志鵬，郭江紅，文 覓

（宜昌三峽普諾丁生物制藥有限公司，湖北 宜昌 443000）

玉米漿（Corn Steep Liquor，CSL）是玉米通過濕法工藝生產(chǎn)淀粉過程中得到的副產(chǎn)物，其含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、半乳糖、蛋白質(zhì)、磷和各種氨基酸如谷氨酸、組氨酸、精氨酸等[1-2]。玉米漿主要用作水溶性植物蛋白及水溶性維生素、纖維飼料以及發(fā)酵氮源等[3]。在氨基酸發(fā)酵中，玉米漿成本低廉且可以提供氮源和生長因子，因此常被用作酵母粉、豆粕水解液等氮源的替代物，以達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目的[4-6]。玉米漿中各類元素的種類及含量對(duì)異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要影響，而其中的磷元素能夠控制菌體DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，也能夠控制菌體中的糖代謝、細(xì)胞的呼吸作用，因此具有較高的研究價(jià)值[7-8]。 基于此，本文主要針對(duì)玉米漿中磷元素的含量對(duì)異亮氨酸發(fā)酵效率的影響展開研究。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）保藏號(hào)為M2019695。

培養(yǎng)基組成為口服葡萄糖14.0%、硫酸銨3.5%、玉米漿2.0%（河南鑫洋實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司）、磷酸二氫鉀（0%～0.4%）、硫酸鎂0.05%、碳酸鈣3.5%和菲?。?%～0.5%），調(diào)節(jié)pH值為7.0±0.1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測定方法

使用HPLC檢測異亮氨酸發(fā)酵液的含量。對(duì)5個(gè)批次玉米漿中溶磷和總磷含量的測定均采用釩鉬磷酸比色法[9-10]。

1.2.2 色譜條件

緩沖液：0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉，用磷酸調(diào)pH至 2.8；流動(dòng)相：乙腈和緩沖液（2∶98）；檢測波長： UV 210 nm；色譜柱：C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL[11]。

1.2.3 樣品處理

按配方將物料裝入三角瓶中，于0.04～0.06 MPa、 110～114 ℃濕熱滅菌10～15 min，稍冷后放入無菌室備用。按無菌操作要求，用接種鏟挑取新鮮斜面上的適量菌種，接入制備好的培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)，（30±2）℃恒溫條件下培養(yǎng)64～80 h后進(jìn)行產(chǎn)酸測定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)批次玉米漿磷含量及對(duì)產(chǎn)酸的影響

對(duì)5個(gè)批次的玉米漿樣品進(jìn)行了溶磷（無機(jī)磷）以及總磷含量的測定，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 5個(gè)批次的玉米漿樣品中溶磷和總磷的含量均不一致，其中樣本3的總磷和溶磷含量最低，溶磷和有機(jī)磷之比也最低，為0.75；樣本1的總磷和溶磷含量最高，溶磷和有機(jī)磷之比也最高，為2.77。

表1 不同批次玉米漿溶磷及總磷含量表

采用5個(gè)玉米漿樣品進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，搖瓶編號(hào)1～5分別添加不同的玉米漿樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，檢測15個(gè)異亮氨酸發(fā)酵的搖瓶清液中異亮氨酸含量，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣本3的產(chǎn)酸最高，為2.90 g/100 mL，樣本1的產(chǎn)酸最低，為1.88 g/100 mL。

為了進(jìn)一步探究玉米漿中磷元素含量對(duì)產(chǎn)酸的影響，本研究結(jié)合表1和表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步分析，分析結(jié)果顯示，當(dāng)樣本中的溶磷∶有機(jī)磷的值降低時(shí)，異亮氨酸的產(chǎn)率隨之升高，說明玉米漿中溶磷∶有機(jī)磷與異亮氨酸的產(chǎn)量成負(fù)相關(guān)。

表2 不同批次的玉米漿發(fā)酵產(chǎn)酸表（單位：g/100 mL）

2.2 不同含量的無機(jī)磷對(duì)產(chǎn)酸的影響

由于5個(gè)不同批次的玉米漿樣本中可能還存在其他影響產(chǎn)酸的因素，因此為了減少影響因素并進(jìn)一步探究無機(jī)磷對(duì)異亮氨酸產(chǎn)率的影響，設(shè)計(jì)了不同濃度無機(jī)磷（磷酸二氫鉀）添加實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中選取產(chǎn)酸最高的樣本3作為玉米漿來源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示：當(dāng)無機(jī)磷添加量為0（無機(jī)磷∶玉米漿干基）時(shí)，異亮氨酸的產(chǎn)率最高，為3.012 g/100 mL；當(dāng)無機(jī)磷添加量達(dá)到0.40%時(shí)異亮氨酸的產(chǎn)率最低，為1.872 g/100 mL。 并且隨著無機(jī)磷的添加，玉米漿中總磷∶玉米漿干基的比例逐漸上升，異亮氨酸的產(chǎn)率逐漸降低，成負(fù)相關(guān)。其中，當(dāng)總無機(jī)磷∶總有機(jī)磷在77%以下時(shí)，異亮氨酸的產(chǎn)率較高。

表3 玉米漿中添加無機(jī)磷后的發(fā)酵產(chǎn)酸表

2.3 不同含量的有機(jī)磷對(duì)產(chǎn)酸的影響

為了進(jìn)一步探究有機(jī)磷的含量對(duì)異亮氨酸產(chǎn)率的影響，設(shè)計(jì)了不同濃度的有機(jī)磷（菲?。┨砑訉?shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示當(dāng)玉米漿中有機(jī)磷的添加量在0%～0.2%（有機(jī)磷∶玉米漿干基）時(shí)，異亮氨酸的產(chǎn)酸量逐漸上升，且添加量在0.2%時(shí)產(chǎn)酸達(dá)到峰值， 2.951 g/100 mL；當(dāng)進(jìn)一步增大有機(jī)磷的添加量，異亮氨酸的產(chǎn)率則逐漸降低。因此在玉米漿中添加少量的無機(jī)磷能夠在一定程度上促進(jìn)異亮氨酸的產(chǎn)酸量，并且添加0.2%的有機(jī)磷，即總無機(jī)磷∶總有機(jī)磷為66.71%時(shí)是最佳的有機(jī)磷添加量。

表4 玉米漿中添加有機(jī)磷的發(fā)酵產(chǎn)酸表

3 討論

磷是微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所必需的成分。賈志偉[7]研究了磷配比對(duì)抗生素發(fā)酵的影響，顯示出配比的重要性。劉鵬等[13]在對(duì)紅霉素發(fā)酵工藝的研究中發(fā)現(xiàn)磷元素能夠影響菌絲生長，進(jìn)而影響發(fā)酵效價(jià)。通過對(duì)不同玉米漿批次自身含有的磷元素的測定（表1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同批次的玉米漿中磷元素的含量也不一致，這可能是受到原料玉米的質(zhì)量、生長環(huán)境等因素的影響。在不同批次玉米漿對(duì)異亮氨酸產(chǎn)酸量的影響實(shí)驗(yàn)中（表2）發(fā)現(xiàn)當(dāng)玉米漿中的溶磷∶有機(jī)磷的值降低時(shí)，異亮氨酸的產(chǎn)率隨之升高，說明玉米漿中溶磷∶有機(jī)磷與異亮氨酸的產(chǎn)量成負(fù)相關(guān)。其中樣本3的溶磷∶有機(jī)磷最低，其產(chǎn)酸也最高。因此，在玉米漿的采購過程中，可以將磷元素含量作為玉米漿質(zhì)量的重要考察指標(biāo)，選擇發(fā)酵用玉米漿中磷含量以2%～3%（干基）較好，其中含有的溶磷∶有機(jī)磷的比值較低更適合用于異亮氨酸的發(fā)酵。

無機(jī)磷源主要是磷酸鹽的化合物，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等。因此，研究中以磷酸二氫鉀作為原料進(jìn)行了玉米漿中無機(jī)磷的添加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表3）隨著無機(jī)磷的添加，玉米漿中總磷∶干基的比例逐漸上升，異亮氨酸的產(chǎn)率逐漸降低，二者成負(fù)相關(guān)。其中，當(dāng)總無機(jī)磷∶總有機(jī)磷在77%以下時(shí)，異亮氨酸的產(chǎn)率較高。因此，在異亮氨酸的發(fā)酵過程中，當(dāng)玉米漿自身含有的無機(jī)磷元素較高時(shí)，可以減少甚至不添加無機(jī)磷，將總無機(jī)磷∶總有機(jī)磷的值維持在77%以下時(shí)有利于異亮氨酸的發(fā)酵與產(chǎn)率。

玉米漿中的有機(jī)磷是以菲?。ㄖ菜徕}鎂或植酸鈣）的形式存在，有的玉米淀粉廠先從玉米漿中提出菲汀后再用菲汀濾液蒸發(fā)濃縮制成玉米漿，實(shí)際上是去除了有機(jī)磷，不利于發(fā)酵。因此，在發(fā)酵過程中可以適當(dāng)添加一定的有機(jī)磷元素，促進(jìn)發(fā)酵的產(chǎn)率。有機(jī)磷添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表4），在玉米漿中添加少量的無機(jī)磷能夠在一定程度上促進(jìn)異亮氨酸的產(chǎn)率，并且添加0.2%的有機(jī)磷，即總無機(jī)磷∶總有機(jī)磷為66.7%時(shí)是最佳的有機(jī)磷添加量。因此，在異亮氨酸的發(fā)酵配料過程中，應(yīng)注意檢測培養(yǎng)基中的無機(jī)磷∶有機(jī)磷的值，將其維持在66.7%左右，這將在一定程度上促進(jìn)異亮氨酸的產(chǎn)率。

4 結(jié)論

本研究從5個(gè)批次的玉米漿出發(fā)，對(duì)其本身含有的無機(jī)磷和有機(jī)磷元素進(jìn)行了測定，并進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)異亮氨酸產(chǎn)率的影響。在篩選出了一個(gè)產(chǎn)酸最高的玉米漿批次后又進(jìn)行了無機(jī)磷與有機(jī)磷的添加實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)玉米漿中的總無機(jī)磷∶總有機(jī)磷為60%～70%時(shí)最佳，當(dāng)超出這一范圍時(shí)應(yīng)當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加無機(jī)磷或有機(jī)磷元素，從而提高異亮氨酸的產(chǎn)率。這將指導(dǎo)在異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)過程中玉米漿的選擇與采購。

由于玉米漿中所含元素過多，對(duì)發(fā)酵的影響因素也不僅僅局限于磷元素的含量，因此未來還可以進(jìn)一步對(duì)玉米漿中各類元素進(jìn)行研究，以求找到最適用于異亮氨酸發(fā)酵的玉米漿指標(biāo)。同時(shí)，不同的菌種所需要的磷元素的含量也存在一定的差異。本研究只針對(duì)特定異亮氨酸生產(chǎn)菌種進(jìn)行了研究，因此未來還可以針對(duì)不同的菌種進(jìn)行磷元素含量的影響研究。