應(yīng)函妤, 邢家恒, 孫江川, 錢穎, 胡林峰, 田男

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310053)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中排名第三[1],其惡性程度高，發(fā)病隱匿，大部分患者確診時已處于中晚期[2]。目前HCC的治療以手術(shù)切除輔助肝動脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)為主[3]，而患者極易產(chǎn)生化療耐藥性。另外，在肝癌晚期形成的腫瘤微環(huán)境中，免疫抑制細胞因子系統(tǒng)地擴增使得T細胞的抗腫瘤活性降低，發(fā)生免疫逃逸，免疫治療不能完全解決腫瘤細胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問題，臨床效果欠佳[4]。因此，挖掘新的HCC預(yù)后分子標志物、挖掘新型防治靶點有利于肝癌治療新方法的建立。

高遷移率族蛋白組A1(high mobility group AT-hook 1，HMGA1)是hook(HMGA)蛋白家族高遷移率組的轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合雙鏈DNA(double-stranded，dsDNA)中富含AT區(qū)域的小凹槽在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)下游基因的表達[5]。HMGA1與雙鏈DNA的結(jié)合常改變DNA結(jié)構(gòu)以促進其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，并協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝以增強或抑制轉(zhuǎn)錄[6-7]從而參與胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、衰老和轉(zhuǎn)移[8-9]。有研究報道，HMGA1的過度表達增加了乳腺癌細胞S期的占比[10]，在宮頸癌中加速G1/S的轉(zhuǎn)變[11]。上述研究均提示，在部分腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中HMGA1發(fā)揮了一定的作用。

目前，關(guān)于HCC和HMGA1之間的研究尚未清楚。本研究在肝癌細胞中敲低HMGA1表達后，通過實時定量PCR，蛋白質(zhì)印跡、MTT、克隆形成，transwell以及流式細胞術(shù)等實驗，研究小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)敲低HMGA1表達量對肝癌細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力的影響，為研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人肝癌細胞系HepG2、Hep3B和SNU-182和人肝細胞系HL-7702購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，使用達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)(含質(zhì)量分數(shù)為10%新生牛血清、質(zhì)量濃度分別為100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)并置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。siHMGA1、siRNA對照、miRNA模擬物、抑制劑、sh-HMGA1及其陰性對照由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待其匯合度至30%～50%時按照說明書的指導(dǎo)采用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染。

1.1.2 數(shù)據(jù)收集及基因表達分析

70例肝細胞癌(HCC)、13例膽管癌(cholangiocarcinoma, CC)和7例混合型HCC和CC的基因表達譜來自GSE15765數(shù)據(jù)集(GEO，RRID:SCR_005012，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。肝癌組織和鄰近肝組織樣本中獲得的基因表達譜和臨床數(shù)據(jù)來自TCGA-LIHC(RRID: SCR_003193, http://cancergenome.nih.gov/)。根據(jù)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)比較HCC和鄰近組織樣本中HMGA1的相對表達水平。癌癥非編碼RNAs地圖集(The Atlas of Noncoding RNAs in Cancer，TANRIC)(http://ibl.mdanderson.org/tanric/_design/basic/index.html)用于評估TCGA數(shù)據(jù)集中不同級別肝癌組織中HMGA1mRNA水平[12]。R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl)用于評估TCGA-LIHC中HCC患者的總體生存率。

1.1.3 基因富集與功能注釋評價

注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)用于進行相關(guān)路徑分析[13]與GO分析對預(yù)測基因進行功能注釋[14]；還通過KEGG法對相關(guān)基因進行功能注釋。選擇在TCGA-LIHC和GSE15765數(shù)據(jù)庫都與HMGA1具有統(tǒng)計顯著正相關(guān)和負相關(guān)的基因進行GO和通路分析。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR

使用TRIzol試劑分離提取總RNA，并依據(jù)使用HiFi MMLV cDNA試劑盒合成cDNA，加入UltraSYBR混合物進行實時PCR。引物：HMGA1正向：5′-TCCAAGAGAGCATCCGCATT-3′，反向：5′-AGAGAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGA-3′；β-actin正向：5′-GGCACCACCTTCTACAT-3′，反向：5′-GTGGTGGAAGCTGCTAGCC-3′。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡

使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液沸水浴5 min變性。質(zhì)量分數(shù)為10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。質(zhì)量分數(shù)為1%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)室溫封閉2 h后置于4 ℃一抗孵育過夜。次日取出，經(jīng)TBST洗滌3次后室溫搖床孵育二抗2 h，再用TBST洗滌3次。最后，使用增強型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測試劑盒通過顯影儀檢測信號。

1.2.3 MTT及克隆形成實驗

以每孔5.00×103細胞接種到96孔板中后將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液(質(zhì)量濃度為5 g/L)。37 ℃避光培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩使紫色結(jié)晶溶解，用酶標儀在波長490 nm下檢測吸光度。以每孔500細胞接種于6孔板中，14 d后終止培養(yǎng)，經(jīng)體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定30 min，并用質(zhì)量分數(shù)為0.1%結(jié)晶紫染色30 min，洗去多余的染液后置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 Transwell實驗

以每孔1.00×104細胞接種在無血清DMEM的上室，下室加入質(zhì)量分數(shù)為20%血清的DMEM。培養(yǎng)36 h后取出經(jīng)體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定30 min，并用質(zhì)量分數(shù)為0.1%結(jié)晶紫染色30 min，洗去多余的染液，用棉棒擦去位于上室的細胞，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

收集各組細胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，于體積分數(shù)為70%乙醇中固定過夜。次日取出離心后棄上清，用PBS洗滌兩次，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)即用型染液300 μL及7.5 μL 核糖核酸酶A(ribonuclease A，RNaseA)，放于37 ℃避光孵育30 min。過200目篩網(wǎng)后用Guava easyCyte 8流式細胞儀分析樣品。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，取細胞懸液100 μL于4 ℃、1 000 r/min條件下離心5 min，用PBS洗滌，棄去上清液，加300 μL結(jié)合液至每管中，冰上避光，再加入3 μL AnnexinV-FITC和3 μL PI液于細胞懸液中混勻，過200目篩網(wǎng)后用Guava easyCyte 8流式細胞儀計算細胞凋亡率。

1.2.7 裸鼠異體移植實驗

將1.00×107HepG2、HepG2/shHMGA1細胞注射到BALB/c裸鼠(每組n=5)的背側(cè)。從接種后第7天開始，每隔3 d測量腫瘤異種移植物的長度和寬度,使用公式V=W2×L×0.5計算腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及肝癌細胞系中HMGA1的表達情況

HMGA1在正常肝組織、肝細胞、不同等級的肝癌組織、肝癌細胞系中的表達量及其表達量與患者生存期的關(guān)系(圖1A～圖1E)。通過對TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫包含369個肝癌組織(n=369)和160個正常肝組織(n=160)的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比HCC組織中HMGA1基因的表達顯著升高，HMGA1在Edmondson Ⅲ級和Ⅳ級腫瘤中的表達水平高于Ⅰ級和Ⅱ級腫瘤，在有血管浸潤的肝癌組織中的表達水平高于無血管浸潤的肝癌組織(圖1A)。進一步提取HMGA1基因的表達水平與HCC預(yù)后的相關(guān)性數(shù)據(jù)，Kaplan-Meier Plotter分析后發(fā)現(xiàn)HMGA1表達高的患者生存率較低(圖1B)。The human protein ATLAS網(wǎng)站分析結(jié)果表明HMGA1蛋白在HCC組織細胞核中的表達顯著高于正常肝組織(圖1C)。實時定量PCR實驗結(jié)果顯示，HMGA1的mRNA在肝癌細胞中的表達量顯著高于正常肝細胞(圖1D)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示HMGA1蛋白在肝癌細胞系中的表達量更高(圖1E)。以上結(jié)果表明，HMGA1可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展。

1)與正常組比較,P<0.05。

圖1B HMGA1的表達量高低與患者生存期的關(guān)系

1)與HL-7702組比較,P<0.01; 2)與HL-7702組比較,P<0.05。

2.2 KEGG和GO分析HMGA1及其相關(guān)基因的功能

通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)和基因本體論(gene ontology，GO)分析，癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)-肝細胞肝癌(Liver hepatocellular carcinoma，LIHC)數(shù)據(jù)集中4 474個基因與HMGA1表達顯著相關(guān)，其中2 672個正相關(guān)，1 802個負相關(guān)；GSE15765數(shù)據(jù)集中的1 173個基因，其中654個正相關(guān)和519個負相關(guān)。滿足在兩個數(shù)據(jù)庫都具有統(tǒng)計意義的共有451個正相關(guān)基因和398個負相關(guān)基因。GO分析結(jié)果表明：HMGA1及其正相關(guān)基因主要富集于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分裂、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和增殖，參與細胞組分的細胞質(zhì)、細胞核，以及參與細胞-細胞黏附的蛋白結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合，與分子功能的相同蛋白質(zhì)結(jié)合(圖2A～圖2C)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)HMGA1及其正相關(guān)基因參與的前3個途徑分別是細胞周期、致病性大腸桿菌感染和志賀氏菌病(圖2D)，而HMGA1及其負相關(guān)基因參與氧化還原過程、代謝過程和蛋白質(zhì)水解等主要生物過程；組成細胞外泌體、胞質(zhì)和線粒體等細胞成分；發(fā)揮受體結(jié)合、氧化還原酶活性和蛋白均聚作用等分子功能(圖2E～圖2G)。KEGG分析證實這些基因主要參與代謝途徑、補體和凝血級聯(lián)以及脂肪酸降解(圖2H)。

2.3 下調(diào)HMGA1抑制肝癌細胞的增殖和遷移并促進凋亡

轉(zhuǎn)染HMGA1siRNA對肝癌細胞活力、增殖、遷移和凋亡的影響結(jié)果(圖3A～圖3E)。為檢測HMGA1對肝癌細胞增殖和遷移能力的影響，通過siRNA下調(diào)了3種肝癌細胞系中HMGA1的表達水平。qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HMGA1 siRNA成功降低了HepG2、Hep3B和SNU-182細胞中HMGA1的表達(圖3A)。MTT結(jié)果表明與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染組細胞的細胞活力顯著降低(圖3B)。此外，克隆形成試驗提示下調(diào)HMGA1的表達可抑制細胞的增殖能力(圖3C)。Transwell結(jié)果顯示HMGA1沉默導(dǎo)致HepG2、Hep3B和SNU-182細胞遷移能力下降(圖3D)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示HMGA1沉默增加了3株膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率(圖3E)。

1)與對應(yīng)細胞系0 h組相比,P<0.01;2)與對應(yīng)細胞系0 h組相比,P<0.05。

1)與對應(yīng)細胞系0 h組相比,P<0.05;2)與對應(yīng)細胞系0 h組相比,P<0.01。

1)與陰性對照組比較，P<0.05; 2)與陰性對照組比較，P<0.01。

圖3E 轉(zhuǎn)染組與陰性對照組的細胞凋亡率

2.4 HMGA1低表達阻滯了肝癌細胞G0/G1期

細胞周期失調(diào)與腫瘤生長抑制有關(guān)[15]，同時KEGG分析發(fā)現(xiàn)HMGA1及其正相關(guān)基因參與細胞周期調(diào)控(圖2D)。檢測si-HMGA1轉(zhuǎn)染組和陰性對照組細胞的細胞周期分布(圖4A、表1)。結(jié)果表明，降低HMGA1表達引起肝癌細胞的G0/G1期阻滯，而3株細胞的G2/M期分布無明顯變化。為了進一步證明HMGA1表達下調(diào)對G0/G1期的阻滯作用，通過蛋白質(zhì)印跡實驗檢測各組細胞中周期蛋白依賴性蛋白激酶6(Cyclin-dependent kinases 6，CDK6)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1，CCND1)蛋白的表達量，結(jié)果顯示si-HMGA1轉(zhuǎn)染組CDK6和CCND1的表達量均低于陰性對照組(圖4B)。

A:正相關(guān)基因參與的生物學(xué)過程；B:正相關(guān)基因參與的細胞組分；C:正相關(guān)基因發(fā)揮的分子功能；D:顯著正相關(guān)通路的分析；E:負相關(guān)基因參與的生物學(xué)過程；F:負相關(guān)基因參與的細胞組分；G:負相關(guān)基因發(fā)揮的分子功能；H:顯著負相關(guān)通路的分析。

表1 轉(zhuǎn)染組與陰性對照組細胞周期分布的變化

A: 下調(diào)HMGA1后3種肝癌細胞周期不同時相的細胞占比;1)與陰性對照組比較,P<0.05;2)與陰性對照組比較,P<0.01;B:敲低HMGA1后3種肝癌細胞系中CCND1和CDK6的表達。

2.5 敲低 HMGA1對其表達量和裸鼠異位移植瘤生長的影響

為了研究shHMGA1的抑制效率，我們通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡實驗檢測基因敲除結(jié)果。qRT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染組HMGA1 mRNA的表達被顯著抑制(圖5A)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也證實，低表達HMGA1使其蛋白表達量明顯減少(圖5B)。采用裸鼠體內(nèi)腫瘤模型進一步研究HMGA1在肝癌進展中的作用。結(jié)果顯示：與對照組相比，HepG2/shHMGA1組的腫瘤體積和腫瘤重量顯著減少(圖5C～圖5D)。此外，對腫瘤切片進行Ki-67表達染色，HepG2/shHMGA1細胞顯示出較低的Ki-67增殖指數(shù)(圖5E)。

A:轉(zhuǎn)染組和陰性對照組HMGA1 mRNA的表達量;1)與0 h轉(zhuǎn)染組相比,P<0.01;B:轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中HMGA1的相對表達;2)與48 h陰性對照組相比,P<0.01;C:各組裸鼠腫瘤大小的生長曲線;1)與對照組相比,P<0.01;D:各組異體移植瘤的平均重量;3)與對照組相比,P<0.01;E:Ki67和HMGA1在異種移植腫瘤中的表達的免疫組化結(jié)果。

3 討論

近年來，對于腫瘤基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究備受關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)大量原癌及抑癌基因的產(chǎn)物可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[16-18]。HMGA1是hook(HMGA)蛋白家族高遷移率組的轉(zhuǎn)錄因子，被報道在甲狀腺癌的生長和侵襲發(fā)揮著重要作用[19]。Fu等[11]發(fā)現(xiàn)HMGA1在宮頸癌中高表達，抑制HMGA1的表達可抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲。Takaha等[20]研究報道，HMGA1在腎癌細胞中高表達，敲低HMGA1可抑制腎癌細胞的克隆形成能力、侵襲遷移能力并誘導(dǎo)細胞凋亡。除此之外，HMGA1還能夠通過參與細胞內(nèi)DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控細胞自噬水平，使腫瘤免疫逃逸發(fā)生。并且HMGA1高表達有助于促進腫瘤微血管形成，促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移[6-7]。

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肝癌患者組織中HMGA1基因及蛋白表達水平明顯高于正常組織。在不同級別肝癌組織中，高級別組HMGA1表達量高于低級別組，說明HMGA1表達水平越高，肝癌患者病情越重。本研究結(jié)果顯示HMGA1在有血管浸潤的瘤體組織中表達較高，說明HMGA1表達越高，腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的可能性越大。另外，生存分析結(jié)果顯示HMGA1表達高的患者生存期較短，提示HMGA1可能是HCC診斷與預(yù)后的潛在標志物。為了進一步研究HMGA1對HCC細胞惡性生物學(xué)行為的影響，敲低肝癌細胞中HMGA1的表達量，分析發(fā)現(xiàn)下調(diào)HMGA1能夠明顯抑制肝癌細胞的增殖、遷移能力而增加細胞凋亡率，能夠明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。本研究初步表明，HMGA1可能作為原癌基因參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程。

GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，在HCC中，HMGA1與苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白激酶1(budding uninhibited by benzimidazoles 1，BUB1)、細胞分裂周期蛋白(cell division cycle 20，CDC20)、細胞周期檢查點激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)、E2F transcription factor 3(E2F3)、微小染色體維持蛋白6(minichromosome maintenance 6，MCM 6)等周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達顯著正相關(guān)，暗示HMGA1可能通過調(diào)控細胞周期參與HCC的發(fā)生發(fā)展。Schuldenfrei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1通過上調(diào)細胞周期蛋白A1、A2、B1和E的表達量來維持淋巴細胞的細胞周期進程。因此，本研究通過流式細胞術(shù)檢測HMGA1對HCC細胞周期分布的影響，結(jié)果顯示HMGA1低表達誘導(dǎo)的肝癌細胞在G0/G1期發(fā)生阻滯。隨后，免疫印跡檢測G0/G1期阻滯相關(guān)蛋白表達發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HMGA1抑制了HCC細胞中CDK6和CCND1的表達。以上結(jié)果表明，HMGA1參與HCC細胞的周期調(diào)控。

綜上，本研究利用生物信息學(xué)研究HMGA1在肝癌中的表達模式，分析其參與肝癌發(fā)生發(fā)展的可能機制，并通過實驗手段進行初步驗證，為深入探討HMGA1促癌作用機制提供了參考依據(jù)，在HMGA1及其相關(guān)基因?qū)Ω伟┘毎芷诘恼{(diào)控方式及參與的信號通路等方向值得深入探索。

作者貢獻聲明

應(yīng)函妤：研究設(shè)計，撰寫并修改論文，數(shù)據(jù)整理；邢家恒：設(shè)計實驗方案，修改論文；孫江川：實驗操作，統(tǒng)計分析；錢穎：實驗指導(dǎo)；胡林峰：實驗指導(dǎo)；田男：論文指導(dǎo)。

利益沖突聲明

本研究未收到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。