應函妤, 邢家恒, 孫江川, 錢穎, 胡林峰, 田男

(浙江中醫(yī)藥大學 生命科學學院， 浙江 杭州 310053)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中排名第三[1],其惡性程度高，發(fā)病隱匿，大部分患者確診時已處于中晚期[2]。目前HCC的治療以手術切除輔助肝動脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)為主[3]，而患者極易產(chǎn)生化療耐藥性。另外，在肝癌晚期形成的腫瘤微環(huán)境中，免疫抑制細胞因子系統(tǒng)地擴增使得T細胞的抗腫瘤活性降低，發(fā)生免疫逃逸，免疫治療不能完全解決腫瘤細胞復發(fā)、轉移等問題，臨床效果欠佳[4]。因此，挖掘新的HCC預后分子標志物、挖掘新型防治靶點有利于肝癌治療新方法的建立。

高遷移率族蛋白組A1(high mobility group AT-hook 1，HMGA1)是hook(HMGA)蛋白家族高遷移率組的轉錄因子，通過結合雙鏈DNA(double-stranded，dsDNA)中富含AT區(qū)域的小凹槽在轉錄水平上調節(jié)下游基因的表達[5]。HMGA1與雙鏈DNA的結合常改變DNA結構以促進其他轉錄因子的結合，并協(xié)調轉錄復合物的組裝以增強或抑制轉錄[6-7]從而參與胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、衰老和轉移[8-9]。有研究報道，HMGA1的過度表達增加了乳腺癌細胞S期的占比[10]，在宮頸癌中加速G1/S的轉變[11]。上述研究均提示，在部分腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中HMGA1發(fā)揮了一定的作用。

目前，關于HCC和HMGA1之間的研究尚未清楚。本研究在肝癌細胞中敲低HMGA1表達后，通過實時定量PCR，蛋白質印跡、MTT、克隆形成，transwell以及流式細胞術等實驗，研究小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)敲低HMGA1表達量對肝癌細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力的影響，為研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng)與轉染

人肝癌細胞系HepG2、Hep3B和SNU-182和人肝細胞系HL-7702購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，使用達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)(含質量分數(shù)為10%新生牛血清、質量濃度分別為100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)并置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。siHMGA1、siRNA對照、miRNA模擬物、抑制劑、sh-HMGA1及其陰性對照由上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司合成。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待其匯合度至30%～50%時按照說明書的指導采用Lipofectamine 2000進行轉染。

1.1.2 數(shù)據(jù)收集及基因表達分析

70例肝細胞癌(HCC)、13例膽管癌(cholangiocarcinoma, CC)和7例混合型HCC和CC的基因表達譜來自GSE15765數(shù)據(jù)集(GEO，RRID:SCR_005012，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。肝癌組織和鄰近肝組織樣本中獲得的基因表達譜和臨床數(shù)據(jù)來自TCGA-LIHC(RRID: SCR_003193, http://cancergenome.nih.gov/)。根據(jù)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)比較HCC和鄰近組織樣本中HMGA1的相對表達水平。癌癥非編碼RNAs地圖集(The Atlas of Noncoding RNAs in Cancer，TANRIC)(http://ibl.mdanderson.org/tanric/_design/basic/index.html)用于評估TCGA數(shù)據(jù)集中不同級別肝癌組織中HMGA1mRNA水平[12]。R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl)用于評估TCGA-LIHC中HCC患者的總體生存率。

1.1.3 基因富集與功能注釋評價

注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)用于進行相關路徑分析[13]與GO分析對預測基因進行功能注釋[14]；還通過KEGG法對相關基因進行功能注釋。選擇在TCGA-LIHC和GSE15765數(shù)據(jù)庫都與HMGA1具有統(tǒng)計顯著正相關和負相關的基因進行GO和通路分析。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR

使用TRIzol試劑分離提取總RNA，并依據(jù)使用HiFi MMLV cDNA試劑盒合成cDNA，加入UltraSYBR混合物進行實時PCR。引物：HMGA1正向：5′-TCCAAGAGAGCATCCGCATT-3′，反向：5′-AGAGAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGA-3′；β-actin正向：5′-GGCACCACCTTCTACAT-3′，反向：5′-GTGGTGGAAGCTGCTAGCC-3′。

1.2.2 蛋白質印跡

使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液沸水浴5 min變性。質量分數(shù)為10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠分離蛋白質并轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。質量分數(shù)為1%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)室溫封閉2 h后置于4 ℃一抗孵育過夜。次日取出，經(jīng)TBST洗滌3次后室溫搖床孵育二抗2 h，再用TBST洗滌3次。最后，使用增強型化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測試劑盒通過顯影儀檢測信號。

1.2.3 MTT及克隆形成實驗

以每孔5.00×103細胞接種到96孔板中后將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液(質量濃度為5 g/L)。37 ℃避光培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩使紫色結晶溶解，用酶標儀在波長490 nm下檢測吸光度。以每孔500細胞接種于6孔板中，14 d后終止培養(yǎng)，經(jīng)體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定30 min，并用質量分數(shù)為0.1%結晶紫染色30 min，洗去多余的染液后置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 Transwell實驗

以每孔1.00×104細胞接種在無血清DMEM的上室，下室加入質量分數(shù)為20%血清的DMEM。培養(yǎng)36 h后取出經(jīng)體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定30 min，并用質量分數(shù)為0.1%結晶紫染色30 min，洗去多余的染液，用棉棒擦去位于上室的細胞，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞周期

收集各組細胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，于體積分數(shù)為70%乙醇中固定過夜。次日取出離心后棄上清，用PBS洗滌兩次，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)即用型染液300 μL及7.5 μL 核糖核酸酶A(ribonuclease A，RNaseA)，放于37 ℃避光孵育30 min。過200目篩網(wǎng)后用Guava easyCyte 8流式細胞儀分析樣品。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，取細胞懸液100 μL于4 ℃、1 000 r/min條件下離心5 min，用PBS洗滌，棄去上清液，加300 μL結合液至每管中，冰上避光，再加入3 μL AnnexinV-FITC和3 μL PI液于細胞懸液中混勻，過200目篩網(wǎng)后用Guava easyCyte 8流式細胞儀計算細胞凋亡率。

1.2.7 裸鼠異體移植實驗

將1.00×107HepG2、HepG2/shHMGA1細胞注射到BALB/c裸鼠(每組n=5)的背側。從接種后第7天開始，每隔3 d測量腫瘤異種移植物的長度和寬度,使用公式V=W2×L×0.5計算腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 肝癌組織及肝癌細胞系中HMGA1的表達情況

HMGA1在正常肝組織、肝細胞、不同等級的肝癌組織、肝癌細胞系中的表達量及其表達量與患者生存期的關系(圖1A～圖1E)。通過對TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫包含369個肝癌組織(n=369)和160個正常肝組織(n=160)的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比HCC組織中HMGA1基因的表達顯著升高，HMGA1在Edmondson Ⅲ級和Ⅳ級腫瘤中的表達水平高于Ⅰ級和Ⅱ級腫瘤，在有血管浸潤的肝癌組織中的表達水平高于無血管浸潤的肝癌組織(圖1A)。進一步提取HMGA1基因的表達水平與HCC預后的相關性數(shù)據(jù)，Kaplan-Meier Plotter分析后發(fā)現(xiàn)HMGA1表達高的患者生存率較低(圖1B)。The human protein ATLAS網(wǎng)站分析結果表明HMGA1蛋白在HCC組織細胞核中的表達顯著高于正常肝組織(圖1C)。實時定量PCR實驗結果顯示，HMGA1的mRNA在肝癌細胞中的表達量顯著高于正常肝細胞(圖1D)。蛋白質印跡結果顯示HMGA1蛋白在肝癌細胞系中的表達量更高(圖1E)。以上結果表明，HMGA1可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展。

1)與正常組比較,P<0.05。

圖1B HMGA1的表達量高低與患者生存期的關系

1)與HL-7702組比較,P<0.01; 2)與HL-7702組比較,P<0.05。

2.2 KEGG和GO分析HMGA1及其相關基因的功能

通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)和基因本體論(gene ontology，GO)分析，癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)-肝細胞肝癌(Liver hepatocellular carcinoma，LIHC)數(shù)據(jù)集中4 474個基因與HMGA1表達顯著相關，其中2 672個正相關，1 802個負相關；GSE15765數(shù)據(jù)集中的1 173個基因，其中654個正相關和519個負相關。滿足在兩個數(shù)據(jù)庫都具有統(tǒng)計意義的共有451個正相關基因和398個負相關基因。GO分析結果表明：HMGA1及其正相關基因主要富集于信號轉導、細胞分裂、轉錄調控和增殖，參與細胞組分的細胞質、細胞核，以及參與細胞-細胞黏附的蛋白結合、鈣粘蛋白結合，與分子功能的相同蛋白質結合(圖2A～圖2C)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)HMGA1及其正相關基因參與的前3個途徑分別是細胞周期、致病性大腸桿菌感染和志賀氏菌病(圖2D)，而HMGA1及其負相關基因參與氧化還原過程、代謝過程和蛋白質水解等主要生物過程；組成細胞外泌體、胞質和線粒體等細胞成分；發(fā)揮受體結合、氧化還原酶活性和蛋白均聚作用等分子功能(圖2E～圖2G)。KEGG分析證實這些基因主要參與代謝途徑、補體和凝血級聯(lián)以及脂肪酸降解(圖2H)。

2.3 下調HMGA1抑制肝癌細胞的增殖和遷移并促進凋亡

轉染HMGA1siRNA對肝癌細胞活力、增殖、遷移和凋亡的影響結果(圖3A～圖3E)。為檢測HMGA1對肝癌細胞增殖和遷移能力的影響，通過siRNA下調了3種肝癌細胞系中HMGA1的表達水平。qRT-PCR和蛋白質印跡結果表明，轉染HMGA1 siRNA成功降低了HepG2、Hep3B和SNU-182細胞中HMGA1的表達(圖3A)。MTT結果表明與陰性對照相比，轉染組細胞的細胞活力顯著降低(圖3B)。此外，克隆形成試驗提示下調HMGA1的表達可抑制細胞的增殖能力(圖3C)。Transwell結果顯示HMGA1沉默導致HepG2、Hep3B和SNU-182細胞遷移能力下降(圖3D)。流式細胞儀檢測結果顯示HMGA1沉默增加了3株膠質瘤細胞的凋亡率(圖3E)。

1)與對應細胞系0 h組相比,P<0.01;2)與對應細胞系0 h組相比,P<0.05。

1)與對應細胞系0 h組相比,P<0.05;2)與對應細胞系0 h組相比,P<0.01。

1)與陰性對照組比較，P<0.05; 2)與陰性對照組比較，P<0.01。

圖3E 轉染組與陰性對照組的細胞凋亡率

2.4 HMGA1低表達阻滯了肝癌細胞G0/G1期

細胞周期失調與腫瘤生長抑制有關[15]，同時KEGG分析發(fā)現(xiàn)HMGA1及其正相關基因參與細胞周期調控(圖2D)。檢測si-HMGA1轉染組和陰性對照組細胞的細胞周期分布(圖4A、表1)。結果表明，降低HMGA1表達引起肝癌細胞的G0/G1期阻滯，而3株細胞的G2/M期分布無明顯變化。為了進一步證明HMGA1表達下調對G0/G1期的阻滯作用，通過蛋白質印跡實驗檢測各組細胞中周期蛋白依賴性蛋白激酶6(Cyclin-dependent kinases 6，CDK6)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1，CCND1)蛋白的表達量，結果顯示si-HMGA1轉染組CDK6和CCND1的表達量均低于陰性對照組(圖4B)。

A:正相關基因參與的生物學過程；B:正相關基因參與的細胞組分；C:正相關基因發(fā)揮的分子功能；D:顯著正相關通路的分析；E:負相關基因參與的生物學過程；F:負相關基因參與的細胞組分；G:負相關基因發(fā)揮的分子功能；H:顯著負相關通路的分析。

表1 轉染組與陰性對照組細胞周期分布的變化

A: 下調HMGA1后3種肝癌細胞周期不同時相的細胞占比;1)與陰性對照組比較,P<0.05;2)與陰性對照組比較,P<0.01;B:敲低HMGA1后3種肝癌細胞系中CCND1和CDK6的表達。

2.5 敲低 HMGA1對其表達量和裸鼠異位移植瘤生長的影響

為了研究shHMGA1的抑制效率，我們通過qRT-PCR和蛋白質印跡實驗檢測基因敲除結果。qRT-PCR結果顯示，與陰性對照相比，轉染組HMGA1 mRNA的表達被顯著抑制(圖5A)。蛋白質印跡結果也證實，低表達HMGA1使其蛋白表達量明顯減少(圖5B)。采用裸鼠體內腫瘤模型進一步研究HMGA1在肝癌進展中的作用。結果顯示：與對照組相比，HepG2/shHMGA1組的腫瘤體積和腫瘤重量顯著減少(圖5C～圖5D)。此外，對腫瘤切片進行Ki-67表達染色，HepG2/shHMGA1細胞顯示出較低的Ki-67增殖指數(shù)(圖5E)。

A:轉染組和陰性對照組HMGA1 mRNA的表達量;1)與0 h轉染組相比,P<0.01;B:轉染組和陰性對照組中HMGA1的相對表達;2)與48 h陰性對照組相比,P<0.01;C:各組裸鼠腫瘤大小的生長曲線;1)與對照組相比,P<0.01;D:各組異體移植瘤的平均重量;3)與對照組相比,P<0.01;E:Ki67和HMGA1在異種移植腫瘤中的表達的免疫組化結果。

3 討論

近年來，對于腫瘤基因轉錄調控的研究備受關注，已發(fā)現(xiàn)大量原癌及抑癌基因的產(chǎn)物可作為轉錄調控因子，其表達水平與腫瘤的惡性程度密切相關[16-18]。HMGA1是hook(HMGA)蛋白家族高遷移率組的轉錄因子，被報道在甲狀腺癌的生長和侵襲發(fā)揮著重要作用[19]。Fu等[11]發(fā)現(xiàn)HMGA1在宮頸癌中高表達，抑制HMGA1的表達可抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移及侵襲。Takaha等[20]研究報道，HMGA1在腎癌細胞中高表達，敲低HMGA1可抑制腎癌細胞的克隆形成能力、侵襲遷移能力并誘導細胞凋亡。除此之外，HMGA1還能夠通過參與細胞內DNA的復制轉錄過程調控細胞自噬水平，使腫瘤免疫逃逸發(fā)生。并且HMGA1高表達有助于促進腫瘤微血管形成，促進腫瘤生長轉移[6-7]。

本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)肝癌患者組織中HMGA1基因及蛋白表達水平明顯高于正常組織。在不同級別肝癌組織中，高級別組HMGA1表達量高于低級別組，說明HMGA1表達水平越高，肝癌患者病情越重。本研究結果顯示HMGA1在有血管浸潤的瘤體組織中表達較高，說明HMGA1表達越高，腫瘤發(fā)生侵襲轉移的可能性越大。另外，生存分析結果顯示HMGA1表達高的患者生存期較短，提示HMGA1可能是HCC診斷與預后的潛在標志物。為了進一步研究HMGA1對HCC細胞惡性生物學行為的影響，敲低肝癌細胞中HMGA1的表達量，分析發(fā)現(xiàn)下調HMGA1能夠明顯抑制肝癌細胞的增殖、遷移能力而增加細胞凋亡率，能夠明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。本研究初步表明，HMGA1可能作為原癌基因參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程。

GO功能注釋和KEGG通路富集分析結果表明，在HCC中，HMGA1與苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白激酶1(budding uninhibited by benzimidazoles 1，BUB1)、細胞分裂周期蛋白(cell division cycle 20，CDC20)、細胞周期檢查點激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)、E2F transcription factor 3(E2F3)、微小染色體維持蛋白6(minichromosome maintenance 6，MCM 6)等周期調控相關蛋白表達顯著正相關，暗示HMGA1可能通過調控細胞周期參與HCC的發(fā)生發(fā)展。Schuldenfrei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1通過上調細胞周期蛋白A1、A2、B1和E的表達量來維持淋巴細胞的細胞周期進程。因此，本研究通過流式細胞術檢測HMGA1對HCC細胞周期分布的影響，結果顯示HMGA1低表達誘導的肝癌細胞在G0/G1期發(fā)生阻滯。隨后，免疫印跡檢測G0/G1期阻滯相關蛋白表達發(fā)現(xiàn)，下調HMGA1抑制了HCC細胞中CDK6和CCND1的表達。以上結果表明，HMGA1參與HCC細胞的周期調控。

綜上，本研究利用生物信息學研究HMGA1在肝癌中的表達模式，分析其參與肝癌發(fā)生發(fā)展的可能機制，并通過實驗手段進行初步驗證，為深入探討HMGA1促癌作用機制提供了參考依據(jù)，在HMGA1及其相關基因對肝癌細胞周期的調控方式及參與的信號通路等方向值得深入探索。

作者貢獻聲明

應函妤：研究設計，撰寫并修改論文，數(shù)據(jù)整理；邢家恒：設計實驗方案，修改論文；孫江川：實驗操作，統(tǒng)計分析；錢穎：實驗指導；胡林峰：實驗指導；田男：論文指導。

利益沖突聲明

本研究未收到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。