【摘要】目的 探索口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉(zhuǎn)移與否的差異基因，并進一步分析其功能，以探索口腔鱗狀細胞癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的可能機制。方法 從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE176221芯片數(shù)據(jù)，在R軟件中利用Limma數(shù)據(jù)包篩選差異基因，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot數(shù)據(jù)包進行差異基因的GO和KEGG分析，最后在STRING網(wǎng)站構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape中篩選出關(guān)鍵差異基因。結(jié)果 通過分析，共篩選出218個差異基因。對差異基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要調(diào)控神經(jīng)元突觸膜的合成和組裝、絡(luò)氨酸磷酸化的調(diào)控、內(nèi)皮細胞的發(fā)育等生物過程;細胞組成富集主要包括遠離基底膜的細胞部分、外側(cè)細胞膜成分和AMPA谷氨酸受體復合;分子功能富集主要包括生長因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)富集的細胞通路主要包括PI3K-AKT信號通路、胰島素抵抗、TNF信號通路等。篩選出的5個關(guān)鍵基因分別是IL6， VEGFA， HSPA1A， NR4A2和UBC。結(jié)論 利用生物信息學篩選出口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉(zhuǎn)移與否的5個關(guān)鍵差異基因可能是其發(fā)生早期淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機制，有望成為其治療的靶點分子，為今后的研究提供新的思路。

【關(guān)鍵詞】口腔鱗狀細胞癌;淋巴轉(zhuǎn)移;GEO數(shù)據(jù)庫;生物信息學

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2021]一般433）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）是一種具有不同分化程度的具有侵襲性的腫瘤，傾向于早期、廣泛的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是口腔最常見的惡性腫瘤，約占口腔癌發(fā)病率的90%，且死亡率高，我國OSCC的死亡率約為1.26/10萬。OSCC病灶周圍器官血液供應(yīng)和淋巴回流豐富，常發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，手術(shù)難度高并且復發(fā)可能性高。其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是OSCC轉(zhuǎn)移的最主要途徑，對手術(shù)切除愈合影響最顯著。因此，探索OSCC早期淋巴轉(zhuǎn)移的可能機制十分必要。

生物信息學是近年來興起的一門新興學科，重點研究基因組學和蛋白組學。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的OSCC和未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的OSCC間差異基因，并進一步行基因本體論分析和基因組百科全書分析，最后構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心差異基因，從生物信息學角度出發(fā)探索哪些基因與OSCC發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為后續(xù)探究OSCC早期淋巴轉(zhuǎn)移的可能機制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1原始數(shù)據(jù)來源

本研究使用芯片來源與GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE176221芯片，平臺文件為GPL20795平臺文件。芯片包含9例OSCC數(shù)據(jù)信息，其中5例發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，4例未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。

1.2差異基因分析

將未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的芯片數(shù)據(jù)視為對照組，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的芯片視為實驗組，使用R軟件讀取基因芯片數(shù)據(jù)，使用limma數(shù)據(jù)包篩選差異基因，篩選條件為p<0.05，logFC>1，篩選出差異基因后立業(yè)pheatmap數(shù)據(jù)包繪制差異基因熱圖。

1.3GO和KEGG分析

使用R軟件讀取篩選出的差異基因，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot數(shù)據(jù)包進行差異基因的GO和KEGG分析，以p<0.05作為篩選條件篩選出顯著富及結(jié)果。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用蛋白互助網(wǎng)絡(luò)在線分析工具STRING構(gòu)建差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，置信度閾值設(shè)為0.7。根據(jù)所得的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape中尋找網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因

在R軟件中利用limma數(shù)據(jù)包篩選差異表達基因，共篩選出218個差異基因，將差異顯著程度排名前50的基因繪制熱圖，其結(jié)果見圖1。

2.2 差異基因的GO分析和KEGG分析

在R軟件中，使用clusterProfiler， org.Hs.eg.db， enrichplot和ggplot數(shù)據(jù)包對218個差異基因進行GO分析和KEGG分析。

2.2.1 差異基因GO分析結(jié)果

以p<0.01作為條件篩選差異基因富集的GO條目，共篩選出76條GO條目，其中生物過程富集了62條，主要包括神經(jīng)元突觸膜的合成和組裝、絡(luò)氨酸磷酸化的調(diào)控、p38MAPK通路的正向調(diào)控、內(nèi)皮細胞的發(fā)育等;細胞組成富集了4條，包括遠離基底膜的細胞部分、外側(cè)細胞膜成分和AMPA谷氨酸受體復合;，分子功能富集了10條，主要包括生長因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等。選擇前5顯著富集的條目并作柱狀圖，見圖2。

2.2.2 差異基因KEGGE分析結(jié)果

以p<0.01作為條件篩選差異基因富集的KEGG條目，共篩選出10條KEGG通路，主要包括，PI3K-AKT信號通路、胰島素抵抗、TNF信號通路等，見圖3。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

在STRING在線網(wǎng)站對218個差異基因進行蛋白互作分析，將所得結(jié)果導入到Cytoscape軟件中，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），并利用Cytoscape軟件中的MCODE插件篩選Hub基因，共得到5個Hub基因（見圖5）。

3 討論

本研究通過挖掘GEO數(shù)據(jù)庫，對比了口腔鱗狀細胞癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移和未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的差異基因，共發(fā)現(xiàn)218個差異基因。進一步對差異基因進行了GO可KEGG分析。最后對差異基因繪制蛋白互相網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選差異基因的Hub基因，共篩選出5個Hub基因，分別是：IL6， VEGFA， HSPA1A， NR4A2和UBC。

通過基于功能富集分析發(fā)現(xiàn)相較于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細胞癌，發(fā)生轉(zhuǎn)移者差異基因的生物過程主要集中在神經(jīng)元的發(fā)育和內(nèi)皮細胞的發(fā)育，這與發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移特性相符;細胞組成主要集中在細胞自身部分，包括遠離基底膜的細胞膜部分、外側(cè)細胞膜成分和AMPA谷氨酸受體復合等，分子功能則主要集中在生長因子活性、NADPH酶活性、凝脂酰肌醇激酶活性、花生四烯酸加氧酶活性等，與癌癥發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移特性相符。這說明本研究篩選的差異基因與口腔鱗癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本研究篩選出的5個Hub基因均與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。白細胞介素6（Interleukin-6， IL-6）是一串分子量為25kDa的糖基化多肽鏈，參與機體的免疫反應(yīng)、炎癥、造血、胚胎發(fā)育和其他的基礎(chǔ)過程。有研究指出IL-6在大多數(shù)腫瘤中均高表達，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等，且與腫瘤的侵襲性生長和對治療的反應(yīng)密切相關(guān)。在口腔鱗狀細胞癌方面，有研究證實血清IL-6濃度與其預后密切相關(guān)，甚至有研究者提出IL-6可作為口腔鱗狀細胞癌治療的靶點分子。血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor a， VEGFA）是血管內(nèi)皮生長因子家族的一員，是促進腫瘤內(nèi)血管生長的重要因子，與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VEGFA在口腔鱗狀細胞癌中高表達，且與其預后密切相關(guān)。熱休克蛋白A1A（Head shock protein A1A， HSPA1A）是熱休克蛋白的一員，參與腫瘤的生長、侵襲和癌變。HSPA1A在多種癌癥組織中均有高表達，且有研究證實其高表達和卵巢上皮癌的預后密切相關(guān)。HSPA1A在口腔鱗狀細胞癌中也高表達，且能提高鱗狀癌細胞的惡性程度。核受體4A2（Nuclear receotor 4A2， NR4A2）是核受體亞家族成員之一，參與調(diào)控細胞周期、凋亡、脂質(zhì)代謝、炎癥、成血管化和癌變等過程。NR4A2在多數(shù)實體瘤中均有高表達，如胃腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和直腸癌等。泛素蛋白C（Ubiquitin C， UBC）是編碼泛素蛋白的主要基因之一，在蛋白泛素化過程中起著至關(guān)重要的作用。UBC介導的泛素化參與細胞增殖、細胞周期和應(yīng)急反應(yīng)等。有研究發(fā)現(xiàn)UBC參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如前列腺癌、膀胱癌和胃癌等。上述五個Hub基因在其他腫瘤中均有不同程度的研究，但在口腔鱗狀細胞癌中HSPA1A， NR4A2和UBC所起的作用還不清楚，且上述五個基因在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及機制還需進一步研究。由于此五個基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，因此，本研究的結(jié)果可為口腔鱗狀細胞癌的早期淋巴轉(zhuǎn)移研究提供新的靶點分子研究思路。

本研究通過對數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行生物信息學的分析，篩選出口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉(zhuǎn)移與未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的差異基因，并進一步對差異基因進行GO和KEGG分析，最后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，找到5個關(guān)鍵基因。雖然篩選的關(guān)鍵基因有部分在口腔鱗狀細胞癌中的研究還不多，在其早期淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及機制還不清楚，但這給我們啟示這些基因可能是口腔鱗狀細胞癌發(fā)生早期淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，未來可能是治療的靶點，還需更多的實驗來驗證。

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作者簡介：陳河林（1990-），男，土家族，湖北恩施人，主治醫(yī)師，博士，貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，種植牙和修復