李紅月，王金廂, ，李學鵬, ，勵建榮，李婷婷，林 洪，王明麗，郭曉華，于建洋，勞敏軍

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧錦州 121013；2.大連民族大學生命科學學院，遼寧大連 116600；3.中國海洋大學，山東青島 266100；4.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東煙臺 265600；5.山東美佳集團有限公司，山東日照 276815；6.榮成泰祥食品股份有限公司，山東威海 264309；7.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江舟山 316120）

竹莢魚（Trachurus japonicus）屬鱸形目，鲹科魚類，又名馬鯖魚、巴浪魚，主要分布于中國沿海、日本、朝鮮半島、越南等西北太平洋地區(qū)。竹莢魚屬暖水性中上層魚類，生產(chǎn)快，捕撈量居全球單一捕撈品種的第三位，在世界海洋漁業(yè)中占有極其重要的地位，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也將其列入我國遠洋漁業(yè)重點捕撈和研究對象[1]。竹莢魚的蛋白質(zhì)和血紅素含量豐富，且富含多種不飽和脂肪酸、維生素A、E及鈣、鋅、鐵等礦物質(zhì)，同時因其產(chǎn)量大、價格低、刺少、口感柔中帶韌，深受消費者歡迎。

竹莢魚與大多數(shù)海水魚一樣，遠洋捕撈之后不易存活，故需立即冷凍以保持其鮮度，實現(xiàn)長途運輸和銷售[2]。諸多研究表明[3-5]，冷凍條件下，肌肉組織中的大部分水分會發(fā)生凍結(jié)，機體內(nèi)的生化反應和微生物腐敗作用得到有效抑制，故冷凍貯藏相對于其他貯藏方式能夠較大程度地延長魚肉貨架期。但在凍藏過程中，肌細胞內(nèi)形成的冰晶會對肌肉組織造成不可逆的機械損傷，使魚肉在解凍時出現(xiàn)嚴重的汁液流失現(xiàn)象[6]。同時，魚肉中的蛋白質(zhì)、脂肪會氧化變性，發(fā)生一系列不良的物理化學反應，造成魚肉品質(zhì)的下降，影響其商品價值[7]。開展竹莢魚凍藏過程中的品質(zhì)監(jiān)控和快速評價具有重要的現(xiàn)實意義。

目前魚類新鮮度品質(zhì)評價的方法主要有傳統(tǒng)的感官評價、物理評價（色澤、質(zhì)構(gòu)、系水力、電特性參數(shù)和冰晶等）、化學評價（揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、K值、pH、酸價、過氧化物含量、羰基化合物含量、硫代巴比妥酸（TBA）值和組胺值等）和微生物評價（菌落總數(shù)（TVC）和特定腐敗菌（SSO））。近年來新型的無損檢測技術逐漸被研究和應用，如光譜技術（拉曼光譜、熒光光譜、紅外光譜、核磁共振氫譜）、光學成像技術（光譜成像、計算機視覺技術）、感官仿生技術（電子鼻、電子舌）和生物傳感器技術（酶傳感器、抗體傳感器、微生物傳感器）等[8-11]。盡管當前大多數(shù)新型評價技術都是基于水產(chǎn)品品質(zhì)變化規(guī)律和傳統(tǒng)新鮮度品質(zhì)評價指標發(fā)展而來的[12-16]，但目前在冷凍水產(chǎn)品上的應用仍較少，新型評價技術的適用性仍有待提高。因此研究魚類凍藏過程中的品質(zhì)與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)變化規(guī)律，可為其品質(zhì)特征指標的篩選、監(jiān)測模型的構(gòu)建以及新型品質(zhì)評價技術的開發(fā)提供理論依據(jù)。本研究采用真空包裝（VP）、空氣包裝（AP）兩種方式，以L*、a*、b*、白度值、pH、電導率、質(zhì)構(gòu)、冰晶大小及形態(tài)、K值和總蛋白二級結(jié)構(gòu)、肌原纖維蛋白的Ca2+-ATP酶活性、總巰基含量、活性巰基含量等為指標，研究竹莢魚在凍藏過程中（-18 ℃，90 d）的品質(zhì)變化規(guī)律，并通過相關性分析挖掘新鮮度品質(zhì)的特征指標，以期為冷凍海水魚的品質(zhì)監(jiān)測與貨架期預測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

速凍竹莢魚（Trachurus japonicus） 2020年9～10月購于廣東省潮州市饒平縣三百門碼頭，體重（100±5） g，體長（19±2） cm，體寬（5±0.5） cm；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、甲醇（色譜級）、Ca2+-ATPase測試盒 北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鹽酸胍、尿素、無水乙醇、氯化鈉、戊二醛、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 天津市福晨化學試劑廠，以上藥品均為分析純。

JA4103分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；CR-400色彩色差計 日本Konica-Minol-ta公司；E-1045鍍金儀 日本日立公司；S-4800場發(fā)射掃描電鏡 日本Minolta公司；FE30電導率儀上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stale Micro System公司；LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀 HORIBA公司；RCD-1A高速分散均質(zhì)機 常州越新儀器制造有限公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；AF-10全自動雪花制冰機 上海斯科茨曼制冰機系統(tǒng)有限公司；UV-2550紫外可見光分光光度計蘇州島津儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前處理 對冷凍的竹莢魚進行單條真空包裝（VP）、空氣包裝（AP）后，置于常用凍藏溫度-18 ℃恒溫冰箱中冷凍貯藏。樣品到達實驗室當天記為0 d，以10 d為間隔周期，流水解凍樣品、測定相關指標。

1.2.2 色澤 取竹莢魚背部肌肉，去皮去紅肉，切成10 mm×10 mm×8 mm的小塊，發(fā)色30 min，采用CR-400色彩色差計CIELab系統(tǒng)測量其色澤變化。CIELab系統(tǒng)中，L*（lightness） 稱為明度指數(shù)，L*=0表示黑色，L*=100表示白色，中間有100個等級；a*（redness/greenness）、b*（ yellowness/blueness）表示不同的色彩方向，a*表示紅綠方向，b*表示黃藍方向[17]。按照公式計算其白度：

1.2.3 電導率 準確稱取絞碎的去皮去紅肉的竹莢魚背部肉5 g于潔凈燒杯中，加入45 mL蒸餾水，充分攪拌后靜置30 min，用中速定性濾紙過濾，取濾液15 mL，在室溫（20±2）℃下采用1413 μs/cm標準液校準后的電導率儀（FE30）測定濾液的電導率。

1.2.4 冰晶大小及形態(tài) 利用掃描電鏡（SEM）測試。取凍結(jié)的竹莢魚背部中間肌肉，將其切成8 mm×8 mm×3 mm的魚塊，用體積分數(shù)2.5%的戊二醛溶液（含50% 0.2 mol/L，pH 7.2的磷酸鹽緩沖液）固定24 h后，用上述磷酸鹽緩沖液漂洗15 min，重復3次，蒸餾水漂洗1 h，再依次用50%、60%、70%、80%、90%和100%的梯度乙醇溶液脫水15 min，每個梯度重復3次，室內(nèi)放置12 h，置于干燥皿內(nèi)保存待測。樣品測試時，離子濺射鍍金，在電壓1 kV、電流10 μA和放大300倍的條件下觀察魚肉樣品的微觀結(jié)構(gòu)[1]。

1.2.5 質(zhì)構(gòu)特性 參考Utreram等[18]的方法并略作調(diào)整：取竹莢魚背部中間肌肉，將其切成10 mm×10 mm×5 mm的魚塊，采用兩次咀嚼測試（TPA），采用5點取樣法和P/50探頭對魚塊進行測定。參數(shù)設定：測前速度1.00 mm/s，測試速度1.00 mm/s，測后速度1.00 mm/s，壓縮比50%，觸發(fā)力5.0 g，探頭兩次測定間隔時間5.0 s。得到樣品的硬度（hardness，指樣品第一次壓縮時的最大峰值）、內(nèi)聚性（cohesiveness，指樣品內(nèi)部的粘合性）、咀嚼度（chewiness，指咀嚼固體食品到可吞下狀態(tài)過程中所做的功）和回復性（resilience，樣品在第一次壓縮過程中回彈的能力，是第一次壓縮循環(huán)過程中返回樣品所釋放的彈性能與壓縮時探頭的耗能之比），各參數(shù)的計算方法參考文獻[17]中的方法。

1.2.6 K值 參考Choi等[19]的方法并略作改動。取5 g碎魚肉加入25 mL預冷的5%高氯酸后均質(zhì)（7000～8000 r/min，1.5 min），4 ℃、3000 ×g離心10 min，取上清液10 mL，用KOH溶液（10 mol/L）調(diào)節(jié)pH至6.5～6.8，靜置20 min后再次離心（條件同上），取上清液，用預冷的超純水定容至25 mL，0.22 μm的水相濾膜過濾，-80 ℃冰箱中保存待測。

檢測參數(shù)：色譜柱BDS C18（250×4.6 mm），流動相磷酸二氫鉀（0.04 mol/L）和磷酸氫二鉀（0.06 mol/L）的混和液，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，上樣量20 μL。K值計算公式如下：

式中：HxR表示肌苷；Hx表示次黃嘌呤；ATP表示三磷酸腺苷；ADP表示二磷酸腺苷；AMP表示一磷酸腺苷；IMP表示肌核苷酸。

1.2.7 硫代巴比妥酸值（TBA值） 參考周明珠等[20]的方法：稱取8 g碎魚肉，加入20 mL蒸餾水，均質(zhì)（8000 r/min，30 s），再加入20 mL 5% TCA（三氯乙酸）溶液，攪拌均勻后，靜置30 min，過濾。取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，80 ℃水浴40 min，冷卻至室溫后，在波長532 nm處測定吸光度，計算TBA值。

1.2.8 拉曼光譜 取適量解凍后的竹莢魚背部肌肉置于載玻片中央，使用拉曼光譜儀的LabSpec6軟件在50倍物鏡下進行測定，采用氬離子激光器作為光源。參考李文協(xié)等[21]設定參數(shù)：功率120 mW，激發(fā)波長532 nm，曝光時間60 s，掃描次數(shù)為3次，掃描范圍400～4000 cm-1。拉曼圖譜處理采用PeakFit和LabSpec軟件。二級結(jié)構(gòu)計算使用Alix公式。

1.2.9 肌原纖維蛋白的提取 參考Benjakul等[22]的方法并略作改動。將切碎的竹莢魚背部肌肉與4倍質(zhì)量的緩沖液A（10 mmol/L Tris-HCl，pH7.2）勻漿（13000 r/min，勻漿三次，每次勻漿1 min、停1 min），經(jīng)冷凍離心（4 ℃，1500 g，20 min）后棄上清，重復洗滌一次后，將沉淀物與5倍質(zhì)量的緩沖液B（10 mmol/L Tris-HCl，0.6 mol/L NaCl，pH7.2）勻漿（條件同上），冷凍離心（條件同上）后，使用4層濾布過濾上清液，即得肌原纖維蛋白溶液。將其置于4 ℃冰箱保存，并于2 d內(nèi)完成各指標的測定。

1.2.10 Ca2+-ATPase活性 用緩沖液B將肌原纖維蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，再用Ca2+-ATPase測試盒測定其Ca2+-ATPase活性。

1.2.11 總巰基與活性巰基含量 采用5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（簡稱DTNB）法[23]進行測定。用緩沖液B將肌原纖維蛋白溶液稀釋至5 mg/mL。

總巰基的測定：取0.5 mL蛋白溶于4.5 mL 緩沖液C（1% Tris，4 mmol/L EDTA，92 mmol/L甘氨酸，8 mol/L 尿素，pH8.0）中，充分振蕩，加入0.5 mL DTNB（10 mmol/L，以50 mmol/L pH7.0的磷酸緩沖液為溶劑配制），將混合液在25 ℃保溫30 min。于412 nm波長處測定吸光度?？瞻捉M為0.5 mL 緩沖液B+4.5 mL緩沖液C+0.5 mL DTNB。

活性巰基的測定：取1 mL蛋白溶于9 mL緩沖液D（含1% Tris，4 mmol/L EDTA，92 mmol/L甘氨酸，pH8.0）中，充分震蕩，加入1 mL DTNB（同上），將混合液在4 ℃保存1 h，再在5000 g，4 ℃條件下離心10 min，取其上清液于412 nm波長下測定吸光度，空白組為1 mL 緩沖液B+9 mL 緩沖液D+1 mL DTNB。

肌原纖維蛋白中總巰基/活性巰基含量按照如下公式計算：

式中：A表示吸光值；ε表示巰基摩爾消光系數(shù)，為13600 L/（mol·cm）；11表示稀釋倍數(shù)；Cpro表示取樣蛋白質(zhì)的濃度，mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)生物學重復測定3次，質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)生物學重復測定6次，實驗數(shù)據(jù)使用IBM SPSS 22.0軟件（美國IBM公司）進行ANOVA差異顯著性分析、獨立樣本T檢驗和Pearson相關性分析，以Duncan’s法進行檢驗，取95%置信度（P＜0.05），結(jié)果以“均值±標準差”表示。利用Origin 2018 （美國OriginLab公司）、LabSpec 5（日本HORIBA公司）、PeakFit 4.12（美國Systat Software公司）、Tbtools 1.89.0.0（中國CJchen）等軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹莢魚凍藏過程中色澤的變化

在凍藏過程中，魚肉色澤會由于脂肪氧化、色素降解等反應而發(fā)生一定的變化，使得消費者的可接受性降低[24-25]。從表1中可以看出，隨著凍藏時間的延長，兩組樣品L*值和白度值均顯著增加（P＜0.05），a*值和b*值均顯著減少（P＜0.05）。其中，樣品初始的L*值、a*值、b*值和白度值分別為40.73、2.48、7.32和40.23，經(jīng)過90 d的冷凍貯藏，AP組的L*值和白度值分別增至50.77、50.71，分別增長了19.78%、20.67%，a*值和b*值分別降至-0.49、2.39，分別下降了119.76%和67.35%，VP組的L*值和白度值分別增至50.95、50.93，分別增長了20.06%、21.01%，a*值和b*值分別降至-0.73、1.30，分別下降了129.44%和82.24%。說明魚肉凍藏期間，亮度逐漸增加，樣品色澤由鮮紅轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠，這可能是肌球蛋白逐漸變性導致的[26]。通過顯著性分析可知，在90 d的凍藏過程中，兩組樣品的L*值并無顯著性差異，a*值和白度值在凍藏70 d時組間差異顯著，b*值在凍藏70和90 d時組間差異顯著，這可能是因為后期的冰晶大小及形態(tài)不一、蛋白氧化程度略有不同[27-28]，導致兩組樣品的色澤參數(shù)有所差異。

表1 竹莢魚凍藏期間色澤的變化Table 1 Changes of color of T. japonicus during frozen storage

2.2 竹莢魚凍藏過程中電導率的變化

魚肉的電特性（電阻、電導率和電容）是評價魚肉品質(zhì)的一個參考指標[29]。一般情況下，隨著貯藏時間的延長，魚體內(nèi)的自溶酶、消化酶與細菌繁殖過程中生成的胞外酶協(xié)同作用，分解肌肉組織中的蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)，生成氨基酸、有機酸、短鏈脂肪酸等帶電小分子物質(zhì)，使魚肉溶液中的電解質(zhì)增多，電導率增大，魚肉品質(zhì)降低[30-31]。圖1為竹莢魚肉溶液的電導率隨凍藏時間的變化。由圖1可知，凍藏0 d時，竹莢魚肉電導率較低，為1561.67 μs/cm；隨著貯藏時間的增加，兩組樣品電導率均呈先增大（P＞0.05）后減?。≒＜0.05）的整體變化趨勢，且均在50 d時達到最大值1924.83 μs/cm。凍藏前期（0～30 d）電導率緩慢增加，甚至略有減少，這可能是因為竹莢魚死后體內(nèi)糖原消耗較少，進入僵硬期較遲，也可能是因為凍藏初期酶和微生物的活性被抑制，催化反應進行得較為緩慢。凍藏50 d后，電導率持續(xù)下降，可能是因為貯藏過程中魚肉汁液流失，帶走了部分電解質(zhì)。80～90 d時，電導率有些許回升，可能是因為魚肉組織結(jié)構(gòu)遭到破壞、細胞內(nèi)溶物溢出造成的[32-33]。兩組樣品在統(tǒng)計學上無顯著性差異（P＞0.05），說明空氣、真空兩種包裝方式對竹莢魚肉的電導率影響不大。

圖 1 竹莢魚凍藏期間電導率的變化Fig.1 Changes of electrical conductivity of T. japonicus during frozen storage

2.3 竹莢魚凍藏過程中冰晶大小與形態(tài)的變化

在凍藏過程中，魚肉組織中的冰晶會逐漸生長且發(fā)生重結(jié)晶，使肌肉組織結(jié)構(gòu)受到機械損傷、蛋白質(zhì)發(fā)生變性，造成樣品持水力的下降，不僅使魚肉汁液損失嚴重，還會使其營養(yǎng)價值降低、風味變差，嚴重影響魚肉品質(zhì)。圖2為不同包裝處理的竹莢魚背部肌肉橫切面掃描電鏡（SEM）圖（圖中空洞可反映冰晶大小和形態(tài)）。如圖所示，不同包裝方式竹莢魚肉的冰晶形態(tài)隨凍藏時間的不同而發(fā)生改變。可以看出，隨著凍藏時間的延長，兩組樣品的冰晶孔隙均有不同程度的增大，說明冰晶體積在不斷增大，并不斷對魚肉造成機械損傷[34]。相同凍藏時間內(nèi)，VP組樣品冰晶直徑較小，形態(tài)較為圓潤，排布均勻而規(guī)則。直到凍藏90 d后，VP組樣品的肌肉組織結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，冰晶結(jié)構(gòu)發(fā)生極明顯變化，冰晶邊緣變得參差不齊。而AP組的冰晶形態(tài)從凍藏初始即大小不一，且從圖中可知，凍藏80 d后，其肌肉纖維開始斷裂，冰晶結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則、發(fā)生明顯變化。SEM結(jié)果表明，在樣品凍藏過程中，真空包裝處理可以更好地保持魚肉組織結(jié)構(gòu)的完整性。

圖 2 竹莢魚凍藏期間的肌肉橫切面微觀結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖（300×）Fig.2 Scanning electron microscope view of transverse section microstructure of T. japonicus muscle during frozen storage (300×)

2.4 竹莢魚凍藏過程中質(zhì)構(gòu)的變化

質(zhì)構(gòu)特性能夠在一定程度上反映魚肉的感官品質(zhì)。表2中記錄了不同包裝方式的竹莢魚背部肌肉在凍藏期間的硬度、內(nèi)聚性、咀嚼度和回復性的變化。硬度是魚肉貯藏過程中較易發(fā)生變化的指標之一。大多樣品的硬度值出現(xiàn)在最大變形處，能夠反映魚肉在受到壓力時的抵抗力大小。從表2可以看出，凍藏初始時，竹莢魚的硬度為2156.79 g，內(nèi)聚性0.53，咀嚼度799.35，回復性0.17，該結(jié)果與王雪松等[35]研究的流水解凍的竹莢魚硬度為3128.45 g、內(nèi)聚性0.367、咀嚼度724.07的結(jié)果相似。經(jīng)過了90 d的冷凍貯藏，VP組、AP組的樣品硬度分別降至257.00和309.26 g，分別下降了85.66%（P＜0.05）和88.08%（P＜0.05）。兩組樣品的內(nèi)聚性呈先升高后降低的趨勢，咀嚼度均隨凍藏時間的延長而顯著下降（P＜0.05），VP組的回復性整體呈現(xiàn)下降趨勢（P＜0.05），AP組則波動較大，下降趨勢不明顯（P＞0.05）。綜上來看，凍藏期間的竹莢魚肉質(zhì)構(gòu)不斷劣變，究其原因，可能是肌肉蛋白的變性使二硫鍵含量降低，疏水相互作用減弱，冰晶的重結(jié)晶作用也會使肌肉的組織結(jié)構(gòu)不斷被破壞[24,36]。這也與總蛋白二級結(jié)構(gòu)和掃描電鏡的測試結(jié)果相吻合。許多研究得出了類似的結(jié)論。楊永安等[37]探究了不同溫度波動對凍藏三文魚質(zhì)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著凍藏時間的延長，各處理組（-50±0.1、-18±0.5、-18±1、-18±2 ℃）的三文魚肉硬度、彈性、咀嚼度均在降低。唐佳楣等[38]在研究不同凍結(jié)方法對大黃魚凍藏期間的品質(zhì)影響時發(fā)現(xiàn)，不同凍結(jié)速率處理組（普通慢凍、酒精速凍和液氮速凍）的大黃魚在凍藏過程中，硬度、彈性、膠著度和回復性均呈現(xiàn)下降的趨勢?？梢姡瑑霾貢档汪~肉的硬度、彈性、咀嚼度、膠著度、回復性等質(zhì)構(gòu)特性，且凍藏時間越長，降低程度越大。

表2 竹莢魚肉質(zhì)構(gòu)特性隨凍藏時間的變化Table 2 Changes of texture characteristics of T. japonicus muscle with frozen storage time

2.5 竹莢魚凍藏過程中K值的變化

K值是ATP降解產(chǎn)物（HxR和Hx）與ATP關聯(lián)物（ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx）總量的比值，是反映冷凍水產(chǎn)品新鮮度品質(zhì)的重要指標。一般認為，魚肉K值小于20%時，是一級鮮度，可用于生食，20%～40%時為二級鮮度，可在加工、烹飪后食用，當魚肉K值介于40%～60%之間時，為三級鮮度，此時瀕臨腐敗，當K值大于60%時，魚肉即達到腐敗標準[39-40]。由圖3可知，隨著凍藏時間的延長，兩組魚肉的K值均顯著性升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)前期增長緩慢，后期增長迅速的趨勢。凍藏初始時，魚肉K值為29.93%，即大于20%，處于二級鮮度的水平，這可能是因為魚在捕獲、速凍、運輸過程中，ATP降解較多，新鮮度略有降低。一般情況下，在初期生化變化階段，糖原的酵解（生成1 mol葡萄糖的同時可生成2 mol ATP）和ATP的降解同時進行，ATP含量可基本不變，而HxR和Hx等ATP降解產(chǎn)物增多，K值即呈現(xiàn)上升趨勢。凍藏10 d時，VP組K值稍有降低，而AP組幾乎沒有變化，這可能是因為VP組樣品的ATP降解緩慢，生成的HxR和Hx含量較少導致的。凍藏60 d時，兩組魚肉K值分別為62.42%、52.82%；凍藏70 d時，分別為70.38%和80.06%，表明兩組魚肉在凍藏60～70 d后已經(jīng)腐敗變質(zhì)。凍藏90 d時，VP、AP組樣品K值分別升高至95.76%和96.37%，已經(jīng)達到嚴重腐敗的程度。相較于前人研究[41]，本研究中魚肉K值同期增長較快，這可能與魚內(nèi)臟和微生物有關，微生物會導致HxR轉(zhuǎn)變?yōu)镠x，進而使K值升高?？傮w上看，真空、空氣兩種包裝方式對竹莢魚肉K值的變化沒有顯著影響。

圖 3 竹莢魚凍藏期間K值的變化Fig.3 Changes of K value of the muscle of T. japonicus during frozen storage

2.6 竹莢魚凍藏過程中TBA值的變化

動物性食品中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，在儲存過程中容易氧化，影響其質(zhì)量。作為一種富含脂肪的魚類，脂質(zhì)氧化對竹莢魚凍藏品質(zhì)變化影響較大。TBA值與魚類脂肪氧化程度有較強的正相關性，已被許多國家公認為評價脂肪氧化程度的指標，其限值主要取決于樣品中不飽和脂肪酸的含量[36,42]。由圖4可知，樣品初始TBA值為0.201 mg MDA/kg，隨著凍藏時間的延長，AP組、VP組樣品的TBA值均顯著升高（P＜0.05），且均于70 d后達到最大值，分別為2.16、1.57 mg MDA/kg。有研究表明，當魚肌肉中的TBA值達到1～2 mg時，即會產(chǎn)生難以接受的氣味[42]；也有報道稱，TBA值的最大限制為2 mg MDA/kg[43]。本研究中，AP、VP組樣品凍藏70 d后表現(xiàn)出腐敗，其TBA值分別達到2.16和1.57 mg MDA/kg，與劉璘等[44]研究的冷藏竹莢魚菌落總數(shù)超過國家限定標準時，其TBA值為1.70～1.75 mg MDA/kg的研究結(jié)果相一致。兩組樣品之間具有顯著性差異（P＜0.05）。魚肉TBA值在凍藏前期和中期（0～70 d）均上升，后期（80～90 d）略有下降，與Aubourg等[45]、Hematyar等[46]的研究結(jié)果的趨勢相同，這可能是由于脂肪氧化分解的二次產(chǎn)物丙二醛與肌肉中的氨基發(fā)生反應，形成NH=CH-CH2-CHO，降低了反應底物濃度，導致TBA值降低[24,47-48]。此外，也可能是因為丙二醛不穩(wěn)定，容易分解為有機醇和有機酸[24,48]。

圖 4 竹莢魚凍藏期間TBA值的變化Fig.4 Changes of TBA value in T. japonicus during frozen storage

2.7 竹莢魚凍藏過程中拉曼光譜及總蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化

拉曼光譜可以有效地表征蛋白多肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)、側(cè)鏈微環(huán)境等，進而獲取蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的信息。圖5為經(jīng)平滑、去基線后的竹莢魚肉凍藏過程中的拉曼圖譜（800～1800 cm-1）變化示意圖，其中酰胺I帶（1645～1685 cm-1）的振動主要來自于酰胺C=O伸縮和N-H彎曲，其主要歸屬峰的位置和對應的構(gòu)象為：α-螺旋（1654 cm-1）、β-折疊（1666 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1683 cm-1）和無規(guī)則卷曲（1662 cm-1），可用來分析測試樣品肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)[49]。從圖5中可以看出，隨著凍藏時間的不斷增加，兩組樣品酰胺I帶的特征峰均藍移，且AP組先于VP組，說明AP組的魚肉樣品變性更快。

圖 5 竹莢魚凍藏期間拉曼光譜的變化Fig.5 Changes of Raman spectra of the muscle of T. japonicus during frozen storage

圖 6 竹莢魚凍藏期間酰胺I區(qū)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)百分含量分布圖Fig.6 Distribution map of protein secondary structure percentage content in amide I domain of T. japonicus during freezing storage

圖6是經(jīng)Alix公式計算得出的凍藏期間兩組樣品酰胺I區(qū)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的百分含量變化示意圖。隨著凍藏時間的延長，兩組樣品的α-螺旋百分含量顯著降低（P＜0.05），β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的百分含量均顯著升高（P＜0.05）。具體來看，在0～90 d的凍藏期內(nèi)，VP組、AP組樣品的α-螺旋含量由63.28%分別減少到43.70%、41.91%，同比降低了30.94、33.77個百分點；β-折疊含量由13.07%分別增加至28.31%、29.71%，同比升高了53.83、56.01個百分點；β-轉(zhuǎn)角含量由13.89%分別增加至17.01%、17.29%，同比升高了18.34、19.66個百分點，無規(guī)則卷曲由9.76%增加到10.98%、11.09%，同比增加了11.11和11.99個百分點。結(jié)果表明，竹莢魚肉在凍藏過程中，肌原纖維蛋白逐步變性、變得無序化，可能是因為冰晶的生長和重結(jié)晶破壞了肌原纖維蛋白的空間構(gòu)象，也可能是因為蛋白酶的作用，使得肌原纖維蛋白中Z線脆弱、斷裂，組織中膠原分子結(jié)構(gòu)改變，結(jié)締組織發(fā)生變化[24,50]。經(jīng)過90 d的凍藏期，VP組比AP組樣品的α-螺旋百分含量高4.10%，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的百分含量分別低4.71%、1.62%和0.99%，這可能是因為真空包裝有效隔絕了樣品與空氣之間的接觸，降低了組織蛋白酶對肌原纖維蛋白氧化作用的程度，一定程度上穩(wěn)定了肌原纖維蛋白的構(gòu)象，減緩了肌原纖維蛋白的變性。

2.8 竹莢魚凍藏過程中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的變化

ATP酶是生物膜上的一種蛋白酶，可分解ATP生成ADP和無機磷，存在于組織細胞及細胞器的膜上。Ca2+-ATPase活性與肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)密切相關，已被廣泛用來表征肌球蛋白的完整性和蛋白變性程度[51-52]。由圖7可知，隨著凍藏天數(shù)的增加，兩組魚肉的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性顯著降低（P＜0.05）。凍藏0 d時，肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性為0.939 mmol Pi/mg Pro/hour，凍藏90 d后，VP組、AP組的Ca2+-ATPase活性分別為0.342、0.258 mmol Pi/mg Pro/hour，分別下降了63.58%、72.52%。該結(jié)果與馬超鋒[28]研究的羅非魚片在-20 ℃條件下貯藏90 d后Ca2+-ATPase活性下降了約75%、周果等[53]研究-20 ℃凍藏30 d后的鮐魚Ca2+-ATPase活性下降了約70%、Jiang等[54]研究遮目魚的Ca2+-ATPase活性在凍藏8周后相對初始值0.62 μmol（Pi）/mg/10 min下降了79%的變化結(jié)果較為一致。兩組樣品的Ca2+-ATPase活性均在40 d前（凍藏前期）快速下降，40 d后（凍藏后期）緩速下降，與錢攀[55]研究的液體快速凍結(jié)（-18、-25 ℃）對鳙魚品質(zhì)的影響中所得結(jié)果相似。Ca2+-ATPase活性的降低可能是因為，魚肉組織中冰晶的生長導致體系離子強度升高，使得肌球蛋白頭部區(qū)域的微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶功能區(qū)減小甚至消失[28]，也可能是因為巰基分子間生成了二硫鍵，導致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集造成的[29]，還可能是因為貯藏過程中，肌球蛋白之間的氫鍵或疏水鍵增強導致肌漿球蛋白功能障礙，進而使Ca2+-ATPase活性下降[30]。

圖 7 竹莢魚凍藏期間肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的變化Fig.7 Changes in Ca2+-ATPase activity of T. japonicus myofibrillar protein during frozen storage

2.9 竹莢魚凍藏過程中肌原纖維蛋白總巰基及活性巰基含量的變化

巰基反應活性極強，被認為是蛋白質(zhì)中最具功能性的基團，在魚肉貯藏過程中易被氧化成二硫鍵，對于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)有重要意義[21,56]。許多研究學者認為，巰基氧化形成二硫鍵，是引起蛋白質(zhì)分子間交叉、聯(lián)結(jié)、聚合的主要原因，故通過測定巰基的含量能夠了解竹莢魚肉在凍藏過程中的肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化情況[57-58]。圖8為不同包裝方式竹莢魚凍藏期間總巰基和活性巰基含量的變化，可以看出，兩組樣品的總巰基和活性巰基含量均隨凍藏時間的延長而顯著降低（P＜0.05），與Ca2+-ATPase活性、α-螺旋百分含量的變化趨勢一致，也與錢攀[59]研究的凍藏鳙魚總巰基含量隨時間延長顯著下降的結(jié)果相一致。說明巰基不斷被氧化成二硫鍵，使肌原纖維蛋白的變性程度不斷加深，且?guī)€基氧化生成二硫鍵與肌球蛋白變性存在一定聯(lián)系[29]。VP組樣品在凍藏前期（0～60 d）的總巰基、活性巰基含量均顯著高于AP組（P＜0.05），凍藏后期（60～90 d）均顯著低于AP組（P＜0.05），與質(zhì)構(gòu)、K值的結(jié)果類似。表明凍藏前期隔絕氧氣有利于竹莢魚新鮮度品質(zhì)的保持。

圖 8 竹莢魚凍藏期間肌原纖維蛋白（a）總巰基和（b）活性巰基含量的變化Fig.8 Changes of （a） total and （b） active sulfhydryl content of myofibrillar protein in T. japonicus during frozen storage

圖 9 竹莢魚凍藏過程中肌肉品質(zhì)指標和蛋白質(zhì)理化指標的相關性分析Fig.9 Correlation analysis between muscle quality indexes and protein physiochemical indexes of T. japonicus during frozen storage

2.10 相關性分析

為了進一步探究兩種包裝方式的竹莢魚在凍藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律，對上述品質(zhì)指標和蛋白質(zhì)理化指標進行了相關性分析，結(jié)果見圖9。由分析結(jié)果可知，兩組魚肉的K值、L*值、a*值、b*值、白度值、硬度、咀嚼度、總巰基、活性巰基、TBA值、Ca2+-ATPase活性、α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲百分含量均與凍藏時間呈極顯著性相關（P＜0.01），回復性顯著性相關（P＜0.05），電導率、內(nèi)聚性無顯著相關性（P＞0.05）。這主要是因為在凍藏過程中，魚體中的蛋白質(zhì)、脂肪、ATP等大分子物質(zhì)不斷地被氧化、降解，肌肉的組織結(jié)構(gòu)逐漸松散、結(jié)合力下降，所以總巰基、活性巰基、Ca2+-ATPase活性、總蛋白二級結(jié)構(gòu)、色澤參數(shù)、TBA值、K值、硬度、咀嚼度、回復性均呈現(xiàn)線性變化趨勢，與凍藏時間極顯著（P＜0.01）或顯著性相關（P＜0.05），而電導率、內(nèi)聚性因為受到諸多因素如細胞液濃度、蛋白質(zhì)變性程度、肌肉組織間結(jié)合力等[24,33]的影響，在凍藏過程中呈現(xiàn)非線性變化趨勢，且與凍藏時間無顯著相關性（P＞0.05）。

分析理化指標之間的相關性可知，凍藏竹莢魚的K值、色澤、硬度、咀嚼度、TBA值、巰基含量、Ca2+-ATPase活性和蛋白二級結(jié)構(gòu)百分含量之間均呈極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）相關性，而電導率、粘聚性、回復性與其他理化指標之間均無顯著相關性（P＞0.05）。表明魚肉色澤、硬度的變化與蛋白質(zhì)氧化變性、脂肪氧化降解、ATP降解密切相關，原因可能是蛋白質(zhì)中的巰基氧化成二硫鍵，導致α-螺旋相對百分含量下降，進而導致蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得無序，蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交叉、聯(lián)結(jié)、聚合，從而ATP酶活性區(qū)減小甚至消失，再加之脂肪氧化程度逐步加深，所以肌肉品質(zhì)逐漸劣變[57-59]（本研究中表現(xiàn)為魚肉色澤由鮮紅轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠、硬度逐漸下降）。且蛋白質(zhì)氧化指標（巰基含量、Ca2+-ATPase活性和蛋白二級結(jié)構(gòu)百分含量）和脂肪氧化指標（TBA值）之間極顯著相關（P＜0.01），也從側(cè)面驗證了脂肪氧化降解的同時可能也會誘導蛋白質(zhì)氧化[24]。因硬度的測量誤差較大，故可將K值、色澤、TBA值、巰基含量、Ca2+-ATPase活性、二級結(jié)構(gòu)百分含量作為評價竹莢魚凍藏過程中品質(zhì)變化的有效指標。

雖然，目前關于魚肉貯藏期間的品質(zhì)指標之間的相關性分析已經(jīng)有一些報道[60-61]，如徐曉蓉等[2]研究得出冷鏈馬鮫魚的TVB-N、組胺、感官評分與時間、pH值、菌落總數(shù)等呈極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）相關性，而TBA值與pH值、菌落總數(shù)之間無顯著相關性（P＞0.05）。石鋼鵬等[62]研究了大口黑鱸魚肉凍藏過程中蛋白特性地變化，結(jié)果表明鹽溶性蛋白與Ca2+-ATPase活性、羰基、表面疏水性、最大熒光強度呈極顯著相關（P＜0.01），與48 kDa Ac、MLC-3電泳條帶呈顯著相關（P＜0.05）。藍蔚青等[63]研究了模擬冷鏈流通過程中大目金槍魚的品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)魚肉的高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分數(shù)、TVB-N、組胺、菌落總數(shù)之間互呈顯著正相關（P＜0.01，P＜0.05）。但是，諸位學者研究結(jié)果不盡相同[2,25,31,59,64]，這可能是因為魚的種類、致死方式、貯存條件和樣品處理、分析儀器等的不同而導致的，故還需大量研究數(shù)據(jù)加以支撐，以完善相關評價方法。今后研究可以公認度較高的品質(zhì)指標為基礎進行相關性分析，如冷藏水產(chǎn)品以TVB-N或組胺為指標，冷凍水產(chǎn)品以K值或Ca2+-ATPase活性為指標。

3 結(jié)論

隨著凍藏時間的延長，真空和空氣包裝竹莢魚肉的K值、L*值、白度值、TBA值均逐漸升高，其中K值凍藏90 d后分別增加了65.83%和66.44%。魚肉的冰晶孔隙在凍藏過程中逐漸增大，a*值、b*值、硬度、咀嚼度、回復性逐漸下降，內(nèi)聚性和電導率先升高后降低。從蛋白質(zhì)理化指標看，α-螺旋百分含量由63.28%分別降低到43.70%、41.91%，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲百分含量逐漸升高，肌原纖維蛋白的總巰基、活性巰基含量逐漸下降，Ca2+-ATPase活性逐漸降低，分別下降了63.58%和72.52%。兩種包裝方式對竹莢魚凍藏期間的肌肉品質(zhì)影響差異不大，但從蛋白理化特性看，真空包裝略優(yōu)于空氣包裝。相關性分析結(jié)果表明，竹莢魚肉的K值、L*值、a*值、b*值、白度值、硬度、咀嚼度、總巰基、活性巰基、TBA值、Ca2+-ATPase活性、二級結(jié)構(gòu)含量均與凍藏時間呈極顯著性相關（P＜0.01），且這些指標兩兩之間也均呈極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）相關。因此除常用指標K值外，色澤、TBA值、巰基含量、Ca2+-ATPase活性、總蛋白二級結(jié)構(gòu)含量等指標也可作為評價竹莢魚凍藏過程中品質(zhì)變化的有效指標。后續(xù)研究中，可結(jié)合這些特征指標，嘗試開發(fā)新型的新鮮度品質(zhì)評價技術，進而實現(xiàn)凍藏魚類新鮮度的快速判別與監(jiān)測。