徐 翀，申利民，苑文杰

(1.保定市第二醫(yī)院骨科，河北 保定 071051；2.安國市中醫(yī)院骨科，河北 保定 071200)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是臨床上常見的退行性疾病，以行動受限及關(guān)節(jié)疼痛為主要臨床癥狀，由于關(guān)節(jié)軟骨纖維化、軟骨下骨增生形成骨贅?biāo)鶎?dǎo)致[1]。骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“骨痹”范疇，多由年老體衰及肝腎虧虛，機(jī)體在感受外邪情況下發(fā)病[2]。中醫(yī)治療骨關(guān)節(jié)炎具有豐富臨床經(jīng)驗，多采用外治法與內(nèi)治法聯(lián)合應(yīng)用，內(nèi)治法以口服中藥湯劑為主，外治法包括推拿、針灸等[3]。當(dāng)歸是傳統(tǒng)的中藥草本植物，研究證實當(dāng)歸在體內(nèi)外均具有抗氧化和抗炎作用，當(dāng)歸中主要活性成分當(dāng)歸多糖對活性氧的產(chǎn)生具有抑制作用，且可調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而起到抗氧化作用，推測其可以抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)[4]。Wnt/β-catenin信號通路是骨關(guān)節(jié)炎中經(jīng)典的信號通路，它參與白細(xì)胞介素(Interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的軟骨降解過程。但是當(dāng)歸多糖對炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用是否與該通路有關(guān)尚未有相關(guān)報道。本研究通過建立SD大鼠OA模型，觀察當(dāng)歸多糖對OA模型大鼠中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選取45～60 d的無特定病原體的遠(yuǎn)交群大鼠，簡稱為SD大鼠，共30只。

1.1.2 實驗藥物與試劑：當(dāng)歸多糖ASP(批號20200916，上海一林生物科技有限公司)；SW1353細(xì)胞(批號20200801，美國ATCC公司)；胎牛血清(批號20200902，美國Gibco公司)；羥乙基哌嗪乙硫磺酸(批號20200721，美國Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(批號20200812，美國Gibco公司)；培養(yǎng)基(批號20200528，美國Gibco公司)；過氧化氫酶(批號20200827，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(批號20200925，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；丙二醛(批號20190822，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TNF-α(批號20201102，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-β(批號20201011，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；碘乙酸(批號20200725，浙江海川化學(xué)品有限公司)；一抗、二抗(批號20201102、20201109，美國Abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 OA模型的構(gòu)建與分組：健康大鼠6只作為對照組。將大鼠稱重后麻醉，采用仰臥位固定，將右側(cè)膝關(guān)節(jié)處毛發(fā)剪去，消毒，OA組注射MIA，對照組用等量0.9%氯化鈉溶液代替。分組：造模3 d后，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、不同濃度的當(dāng)歸多糖溶液組(0.5、1、2 g/kg)，每組各6只，然后給藥，1次/d。給藥21 d后，從眼眶取血，并將大鼠處死，打開右側(cè)膝關(guān)節(jié)，收集軟骨并凍存于液氮中備用。

1.2.2 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠血漿參數(shù)：主要檢測過氧化物氫化酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、TNF-α以及IL-β的濃度。

1.2.3 測定各組大鼠軟骨組織MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表達(dá)水平：各基因引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.2.4 IL-1β模型中當(dāng)歸多糖對SW1353細(xì)胞活性的影響：SW1353是建立骨關(guān)節(jié)炎模型常用的細(xì)胞系。取SW1353細(xì)胞，將其接種到孔板中后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中進(jìn)行240 min周期培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，將SW1353細(xì)胞樣品進(jìn)行隨機(jī)分類，并分別向?qū)φ战M、當(dāng)歸多糖組的培養(yǎng)基中加入不同的藥劑，其中對照組予FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，當(dāng)歸多糖組使用不同濃度的當(dāng)歸多糖試劑。培養(yǎng)2 d，分別向模型組、當(dāng)歸多糖組的培養(yǎng)基中加入200 ng/ml的IL-1β，對照組的培養(yǎng)基中則無試劑加入，之后將各組樣品放入培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，并放入震蕩設(shè)備中進(jìn)行震蕩，外界溫度保持不變的情況下，使用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞增值率。細(xì)胞增殖率=用藥組與模型組的光密度值之差/對照組與模型組的光密度之差。

1.2.5 IL-1β模型中當(dāng)歸多糖保護(hù)SW1353細(xì)胞的分子機(jī)制：取出SW1353細(xì)胞樣品，將其接種到孔板中后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。當(dāng)歸多糖組加入不同濃度(10、50、100 μg/ml)的當(dāng)歸多糖，對照組用RPMI 1640培養(yǎng)基代替，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，在模型組、當(dāng)歸多糖組中加入20 ng/ml的IL-1β溶液，繼續(xù)培養(yǎng)8 h?？装宓撞考?xì)胞加Trizol裂解后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-PCR檢測細(xì)胞MMP-13、GSK-3β、Wnt 4a、ADAMTS4、β-catenin mRNA表達(dá)水平。采用Western blot法檢測β-catenin和MMP-13的蛋白表達(dá)。結(jié)果以相對表達(dá)定量2-△△Ct表示。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，裂解后等量蛋白上樣，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)模、封閉、分別與一抗和二抗雜交，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠組織病理學(xué)形態(tài)觀察 各濃度當(dāng)歸多糖組給藥21 d后，解剖大鼠關(guān)節(jié)腔進(jìn)行觀察。對照組大鼠關(guān)節(jié)腔中無積液，滑膜正常，關(guān)節(jié)軟骨光滑明亮；模型組關(guān)節(jié)腔中出現(xiàn)大量的積液，而且滑膜組織出現(xiàn)充血、腫大以及增生等現(xiàn)象，關(guān)節(jié)軟骨組織比較暗淡，其表面出現(xiàn)凹凸不平甚至深的凹坑，同時軟骨組織出現(xiàn)損傷；與模型組比較，當(dāng)歸多糖中劑量組、當(dāng)歸多糖低劑量組大鼠關(guān)節(jié)腔中積液減少，軟骨灰暗、粗糙，表面有裂隙，無軟骨缺損；當(dāng)歸多糖高劑量組大鼠的關(guān)節(jié)腔無明顯積液，部分滑膜增生，軟骨沒有明顯損傷。見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)腔病理學(xué)形態(tài)圖

2.2 各組大鼠IL-1β、TNF-α水平比較 模型組大鼠IL-1β和TNF-α表達(dá)水平均高于對照組；不同劑量當(dāng)歸多糖組IL-1β和TNF-α水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠IL-1β、TNF-α水平比較(pg/ml)

2.3 各組大鼠MDA、SOD、CAT水平比較 見表3。模型組大鼠MDA蛋白水平均高于對照組，SOD、CAT蛋白水平均低于對照組(P<0.05)。不同劑量當(dāng)歸多糖組MDA蛋白水平均低于模型組，SOD、CAT蛋白均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2 g/kg當(dāng)歸多糖組MDA蛋白均低于0.5 g/kg當(dāng)歸多糖組和1 g/kg當(dāng)歸多糖組，SOD、CAT蛋白均高于0.5 g/kg當(dāng)歸多糖組和1 g/kg當(dāng)歸多糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠MDA、SOD、CAT水平比較(U/mg)

2.4 各組大鼠軟骨組織MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表達(dá)比較 見表4(圖2)。模型組大鼠MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表達(dá)均高于對照組；不同劑量當(dāng)歸多糖組MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白均低于模型組，其中2 g/kg當(dāng)歸多糖組MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白水平最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 各組大鼠軟骨組織MMP-13 mRNA和c-Fos蛋白表達(dá)比較

A：對照組；B：模型組；C：0.5 g/kg當(dāng)歸多糖組；D：1 g/kg當(dāng)歸多糖組；E：2 g/kg當(dāng)歸多糖組

2.5 各組大鼠SW1353細(xì)胞活性比較 模型組大鼠細(xì)胞活性低于對照組(P<0.05)，不同劑量當(dāng)歸多糖組大鼠細(xì)胞活性均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠SW1353細(xì)胞活性比較(%)

2.6 各組大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA比較 見表6。模型組大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。0.5 g/kg當(dāng)歸多糖組、1 g/kg當(dāng)歸多糖組、2 g/kg當(dāng)歸多糖組大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同劑量當(dāng)歸多糖組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表6 各組大鼠Wnt 4a mRNA、β-catenin、GSK-3β mRNA水平比較

2.7 各組大鼠ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表達(dá)比較 見表7(圖3)。模型組大鼠的ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，不同劑量當(dāng)歸多糖組大鼠的ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表達(dá)均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表7 各組大鼠ADAMTS4 mRNA和MMP-13蛋白表達(dá)比較

A：對照組；B：模型組；C：0.5 g/kg當(dāng)歸多糖組；D：1 g/kg當(dāng)歸多糖組；E：2 g/kg當(dāng)歸多糖組

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)中的病機(jī)為虛實兩端，即因虛致病和因病致虛，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、局部腫脹及屈伸功能受限，中醫(yī)認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的病機(jī)為本虛標(biāo)實[5]，對于不通則痛者給予散寒祛濕、活血化瘀治療，通痹止痛，疏通經(jīng)絡(luò)；對于不榮則痛者給予調(diào)養(yǎng)氣血，滋補(bǔ)肝腎治療[6]。多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎患者的IL-1β表達(dá)水平明顯高于常人[7-8]。IL-1β通過與目標(biāo)細(xì)胞上的受體結(jié)合而傳遞信息至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生理功能產(chǎn)生干擾，IL-1β可以通過激活單核巨噬細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)[9]。TNF主要分泌于單核巨噬細(xì)胞，是一種單核因子，與IL-1在體內(nèi)的分布相似，TNF在OA患者中水平較高[10]。IL-1β、TNF-α在OA疾病發(fā)生發(fā)展過程中均有重要意義[11]。本研究結(jié)果顯示，給予當(dāng)歸多糖治療后，大鼠IL-1β、TNF-α水平均降低，且具有一定劑量依賴性。當(dāng)歸入肝、脾、心經(jīng)，味甘、溫、辛，有補(bǔ)血活血、潤燥滑腸及調(diào)經(jīng)止痛的功效，可緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛及腫脹。當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸水溶性成分，可改善免疫力，抑制炎癥反應(yīng)[12]。

氧化應(yīng)激反應(yīng)對骨關(guān)節(jié)疾病的產(chǎn)生和發(fā)展也有一定影響[13]。氧化應(yīng)激反應(yīng)的水平高低反映骨關(guān)節(jié)細(xì)胞損傷程度[14]。CAT、SOD是抗氧化酶，可有效反映機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度，阻止氧化應(yīng)激對組織細(xì)胞的損害[15]。SOD是體內(nèi)廣泛存在的金屬酶，可以清除生物體內(nèi)的超氧自由基，起到機(jī)體自我保護(hù)的作用，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中具有重要作用[16]。CAT是一種可以清除H2O2的酶，是免疫系統(tǒng)的重要酶[17]。以往研究顯示，當(dāng)歸多糖對CCL4造成的肝細(xì)胞損傷具有一定抑制作用，可降低MDA水平，維持正常水平。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸多糖處理后，MDA表達(dá)降低，SOD和CAT水平顯著增加，提示當(dāng)歸多糖具有明顯抗氧化應(yīng)激作用，當(dāng)歸多糖可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究證實，當(dāng)歸多糖通過抑制肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，維持生物細(xì)胞膜穩(wěn)定性，抑制肝細(xì)胞的變形及壞死進(jìn)程，恢復(fù)肝細(xì)胞功能，抑制SOD和MDA產(chǎn)生，起到抗氧化、清除自由基作用[18]。

MMP在各種結(jié)締組織中廣泛存在，是OA關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要調(diào)控因子之一，正常情況下關(guān)節(jié)軟骨分泌的MMP較少，OA患者關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)水平增加，可引起關(guān)節(jié)軟骨退變[19]。有研究顯示，當(dāng)歸多糖具有抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，改善細(xì)胞功能，促進(jìn)受損軟骨細(xì)胞恢復(fù)，抑制MMP-13基因表達(dá)[20]，這與本研究結(jié)果相符。本研究顯示，當(dāng)歸多糖處理后MMP-13和cFos表達(dá)降低。

本研究采用IL-1β體外損傷模型研究當(dāng)歸多糖在OA治療中抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖可以有效降低IL-1β對軟骨細(xì)胞的損傷，增加軟骨細(xì)胞活性，且當(dāng)歸多糖可降低β-catenin、Wnt 4a、GSK-3β、MMP-13、ADAMTS4表達(dá)水平，抑制IL-1β引起的軟骨降解，緩解患者癥狀，提示當(dāng)歸多糖通過Wnt/β-catenin信號通路抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷與炎癥反應(yīng)。