李勇明 桂 彬 黎陽雨 李揚揚 陳亮明 黃 容 廖蘭杰 汪亞平

(中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072)

雌核發(fā)育是魚類單性生殖中一種重要的生殖方式, 與傳統(tǒng)的同胞近親交配選擇育種技術(shù)相比,由于雌核發(fā)育后代的遺傳物質(zhì)完全來自母本, 因而可以作為快速建立高純合度品系的有效手段, 在魚類染色體操作、遺傳改良及性別控制等方面都具有潛在的應(yīng)用價值[1,2]。20世紀(jì)90年代以來, 研究人員對魚類人工雌核發(fā)育的研究報道較多, 已先后在草魚(Ctenopharyngodon idella)[3]、鯉(Cyprinus carpio)[4]、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[5]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[6]等10 余種魚類中成功獲得了雌核發(fā)育二倍體后代。

人工誘導(dǎo)魚類的雌核發(fā)育包括兩個方面: 精子染色體的遺傳失活及卵子染色體的二倍體化[7]。用紫外線照射精液, 使精子遺傳物質(zhì)失活的方式最為普遍, 在誘導(dǎo)魚類人工雌核發(fā)育中大都使用此法。在卵子染色體的二倍化方面, 誘導(dǎo)的方法主要有溫度處理(冷休克或熱休克) 、化學(xué)藥物和靜水壓。最常用的是溫度休克法, 尤其是冷休克對大多數(shù)魚類雌核發(fā)育二倍化的形成有效[8]。也有研究人員使用秋水仙素溶液浸泡受精卵, 獲得了二倍體雌核發(fā)育個體[9]。用靜水壓來阻止卵子第二極體的排出或受精卵的第一次有絲分裂, 同樣可實現(xiàn)卵子的二倍化, 因其對胚胎的損傷小, 且成活率高, 近年來得到廣泛應(yīng)用[7]。

鱖是我國重要的淡水名特優(yōu)養(yǎng)殖魚類, 屬鱸形目、脂科、鱖屬。目前用于池塘養(yǎng)殖的鱖主要是翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)、大眼鱖(S. kneri)和斑鱖(S. scherzeri)三個種, 其中以翹嘴鱖的養(yǎng)殖規(guī)模最大, 翹嘴鱖中雌性比雄性生長快, 經(jīng)濟價值更高[10]。2019年, 鱖養(yǎng)殖產(chǎn)量達33700 kg[11]。隨著鱖養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 養(yǎng)殖密度不斷增加, 養(yǎng)殖病害頻繁暴發(fā), 生長速度減緩, 野生種質(zhì)資源受到過度捕撈和種質(zhì)混雜的威脅。對翹嘴鱖進行種質(zhì)資源挖掘, 創(chuàng)制單性或新的種質(zhì)資源, 從而選育出生長快、抗逆性好的翹嘴鱖優(yōu)良品系非常必要[12,13]。

本文以翹嘴鱖為研究對象, 對靜水壓誘導(dǎo)雌核發(fā)育過程中的精子滅活時間、靜水壓處理前受精時間、靜水壓強度及持續(xù)處理時間進行探索, 以期獲得靜水壓誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育的最佳參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 雌核發(fā)育親本的來源及催產(chǎn)方法

一冬齡性成熟翹嘴鱖(雌雄各30尾)購買自湖北武穴燕中水產(chǎn)品養(yǎng)殖有限公司, 暫養(yǎng)于水泥池1周,保持餌料魚和溶氧充足。人工繁殖前1天, 雌魚每公斤體重經(jīng)胸鰭下注射DOM 1 mg; LHRH-A2 5 μg;HCG 1000 IU, 雄魚劑量減半。注射后測量水溫為26℃, 效應(yīng)時間預(yù)計21h。

1.2 精子滅活時間的選擇

采集3尾雄性鱖精液, 按1∶10 的比例加入hanks保存液混勻, 冰上避光保存。解剖鏡下加水分別觀察精子活力, 確認(rèn)每尾雄魚的精子具有足夠的活力。然后各取15 mL 共45 mL精液于大玻璃皿中混勻, 置于搖床上, 在兩只15 w的紫外燈管下(培養(yǎng)皿與紫外燈管的垂直距離約17 cm)緩慢搖動, 分別于0、9min、12min、15min、18min、21min和24min時取2 mL精液, 冰上避光保存。

采集3尾雌性鱖的卵子混勻, 按體積等分為7等份, 分別與紫外照射0、9min、12min、15min、18min、21min、24min的精液干法受精, 受精后置于7個孵化桶中26℃水溫孵化, 12h (原腸晚期)統(tǒng)計受精率, 24h統(tǒng)計畸形率, 72h統(tǒng)計存活率。

1.3 靜水壓誘導(dǎo)前受精時間的選擇

采集3尾雄性鱖的精液并確認(rèn)精子具有足夠活力, 按1∶10 的比例分別加入hanks保存液混勻, 各取15 mL按照1.2確定的紫外照射時間滅活精子。采集3尾雌性鱖的卵子混勻, 按體積等分為5等份, 各加入2 mL滅活的精液干法受精, 再加入曝氣水繼續(xù)受精2min、3min、4min、5min和6min后, 置于靜水壓裝置中, 30s內(nèi)將壓力升至68 MPa持續(xù)1min誘導(dǎo)受精卵, 后置于5個孵化桶中26℃水溫孵化,12h、24h和72h時分別統(tǒng)計受精率、畸形率和存活率。

1.4 靜水壓強度以及持續(xù)時間的選擇

采集3尾雄性鱖的精液并確認(rèn)精子具有足夠活力, 按1∶10 的比例分別加入hanks保存液混勻, 各取15 mL按照1.2確定的紫外照射時間滅活精子。采集6尾雌性鱖的卵子, 混勻后按體積等分為16等份,部分放入一次性打包袋中充氧遮光保存, 各加入2 mL滅活的精子干法受精, 依據(jù)1.3確定的受精時間加水繼續(xù)受精, 在58、63、68和73 MPa 靜水壓下, 分別持續(xù)1min、2min、3min和4min。孵化桶中26℃水溫孵化, 12h、24h和72h時分別統(tǒng)計受精率、畸形率和存活率。

1.5 最優(yōu)受精時間及靜水壓持續(xù)時間誘導(dǎo)雌核發(fā)育的效果

采集3尾雄性鱖的精液并確認(rèn)精子具有足夠活力, 按1∶10 的比例分別加入hanks保存液混勻, 各取30 mL按照1.2確定的紫外照射時間滅活精子。采集3尾雌性鱖的卵子, 每尾雌魚的卵子按體積等分為3等份, 分別與1尾雄魚未滅活的精子受精設(shè)為對照組1; 與滅活的精子受精設(shè)為對照組2; 最后一份與滅活的精子受精后設(shè)為實驗組, 按照1.3的結(jié)果選擇受精時間, 1.4的結(jié)果選擇靜水壓強度和持續(xù)時間進行雌核發(fā)育。每尾雌魚產(chǎn)生3組群體, 3尾雌魚共9組受精卵分別放入9個孵化桶中26℃水溫孵化。12h、24h和72h時統(tǒng)計受精率、畸形率和存活率,48h時體視顯微鏡(Olympus SZ61TR)觀察出膜后的正常和畸形魚苗并拍照。采用SPSS軟件, 對組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和兩兩比較。雌核發(fā)育群體開口后混合養(yǎng)殖, 直至可剪尾鰭進行性別鑒定。

1.6 雌核發(fā)育個體的性別鑒定

選取30尾雌核發(fā)育個體及其親本(雌雄各3尾),分別剪取部分尾鰭放入96孔板。利用chelex100煮沸法, 在96孔板中一步完成DNA樣品的制備。操作步驟為將150 μL 5%濃度的chelex100加入裝有尾鰭的96孔板, 58℃消化1h, 100℃煮沸8min, 4000轉(zhuǎn)離心5min。取1 μL上清作為PCR模板, 在本實驗室發(fā)掘的一個鱖性別特異性標(biāo)記上設(shè)計引物(F: 5′-CAAACTACATGAGAAACTCTTGGTTGAC-3′; R:5′-CTTTATCCATAGCCCCTCAGCCTTG-3′)進行PCR擴增。擴增體系為10×Buffer(Mg2+plus)1 μL,LC Green 1 μL, dNTP(10 mmol/L each)0.2 μL, F primer(10 mmol/L)0.2 μL, R primer(10 mmol/L)0.2 μL,Taq酶(5 U/μL)0.1 μL, 模板DNA 1 μL, 最后補充ddH2O至10 μL。擴增條件為94℃預(yù)變性4min, 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸25s, 40個循環(huán)后72℃延伸5min, 4℃保存。擴增完成后采用LightS-canner 96(美國Idaho Technology公司)進行HRM分析, 區(qū)分雌性和雄性個體。

2 結(jié)果

2.1 精子滅活時間的選擇

3尾雌魚卵子混勻后等分的7份卵子, 分別與紫外照射0、9min、12min、15min、18min、21min和24min的精子受精孵化。12h、24h和72h時分別統(tǒng)計受精率、畸形率和存活率, 并繪制折線圖(圖 1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 紫外滅活0—24min精子的受精率變化并不大, 從0的最高值90.12%降至24min的最低值72.47%, 總體上紫外照射的時間越長則受精率越低?；温蕜t隨著紫外照射的時間越長比率越高,從對照的0增加至15min的100%, 15min后基本穩(wěn)定在100%。存活率則隨著紫外照射的時間越長數(shù)值越低, 從對照的85.57%降至18min的0, 18min后所有魚苗全部死亡。結(jié)果表明在本研究使用的紫外照射強度下, 翹嘴鱖精子的最佳滅活時間為18min。

圖1 不同滅活時間精子與正常卵子受精的受精率、畸形率和存活率Fig. 1 Fertilization rate, deformity rate and survival rate of normal eggs fertilized with sperms at different inactivation times

2.2 靜水壓誘導(dǎo)前不同受精時間的效果比較

3尾雌魚卵子混勻后等分為5份, 分別與2 mL的滅活精子, 加水受精2min、3min、4min、5min和6min, 于68 Mpa靜水壓下持續(xù)處理受精卵1min。5種受精時間的受精率、畸形率和存活率的折線圖顯示, 受精率在76.24%—82.84%; 畸形率從2min的86.46%降至5min的62.64%, 受精6min的比率又稍微升高; 5種受精時間的存活率變化不大, 但比較起來5min時存活率最高, 為3.45%(圖 2)。結(jié)果說明受精5min后進行靜水壓誘導(dǎo)為最合適的受精時間。

圖2 不同受精時間受精卵的受精率、畸形率和存活率Fig. 2 Fertilization rate, deformity rate and survival rate of fertilized eggs at different fertilization times

2.3 靜水壓強度以及持續(xù)時間的效果比較

6尾雌魚卵子混勻后等分的16份卵子, 分別與2 mL滅活精子, 加水受精5min 后, 在58、63、68和73 MPa 靜水壓下, 各分別持續(xù)處理1min、2min、3min和4min。12h、24h和72h時分別統(tǒng)計受精率、畸形率和存活率(表 1)。與上述結(jié)果相似, 受精率在不同的靜水壓及不同的持續(xù)處理時間變化均不大, 最大值為58 Mpa靜水壓持續(xù)處理3min的受精率(85.56%), 最低為58 Mpa靜水壓持續(xù)處理4min的受精率(70.25%); 畸形率則介于62.47%—78.25%, 73 Mpa靜水壓持續(xù)處理3min的畸形率最高, 63 Mpa靜水壓持續(xù)處理4min的畸形率最低; 存活率介于0—6.99%,63 Mpa靜水壓持續(xù)處理2min的存活率最高。綜合評估63 Mpa靜水壓持續(xù)處理時間2min為凈水壓誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育的最佳參數(shù)。

表1 不同靜水壓強度及不同持續(xù)處理時間的受精率、畸形率和存活率Tab. 1 Fertilization rate, deformity rate and survival rate of different hydrostatic pressure intensity and different durations

2.4 最優(yōu)受精時間及靜水壓持續(xù)時間誘導(dǎo)雌核發(fā)育的效果

3尾雌魚卵子每尾3等份, 分別與3尾雄魚未滅活的精子受精(對照組1)、滅活的精子受精(對照組2)、滅活的精子受精5min后63 Mpa靜水壓持續(xù)處理2min誘導(dǎo)雌核發(fā)育(實驗組)。統(tǒng)計9組受精卵的受精率、畸形率和存活率, 對組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和兩兩比較的結(jié)果見下表(表 2)。首先從受精率上看, 3組間均無顯著性差異(P＞0.05); 對照組1和另外兩組之間的畸形率均具有顯著性差異(P＜0.05), 對照組2和實驗組之間的畸形率無顯著差異(P＞0.05); 3組之間的存活率兩兩比較均具有顯著差異(P＜0.05)。48h時出膜的畸形魚苗與正常魚苗的形態(tài)觀察如圖 3所示, 圖 3A中箭頭均顯示卵子與未滅活的精子受精發(fā)育的正常魚苗; 圖 3B中黑色箭頭顯示單倍體畸形的魚苗, 身體扭曲、尾巴粗短、眼睛體節(jié)顯示不清, 具有明顯的單倍體綜合征;圖 3B中白色箭頭顯示雌核發(fā)育二倍化的胚胎, 體型與正常發(fā)育的對照魚苗相似。

圖3 正常魚苗與畸形魚苗的形態(tài)觀察Fig. 3 Morphological observation of normal and abnormal fries

表2 對照組與最優(yōu)誘導(dǎo)條件下受精卵的受精率、畸形率和存活率比較Tab. 2 Comparison of fertilization rate, deformity rate and survival rate of fertilized eggs between control group and optimal induction condition (%)

2.5 雌核發(fā)育個體的性別鑒定

圖4顯示了36尾個體的溶解曲線, 從圖中可以看出, 雌性和雄性個體明顯區(qū)分為2個部分: 33尾雌性個體(30尾雌核發(fā)育個體和3尾雌性親本)和3尾雄性親本。結(jié)果顯示我們隨機選擇的30尾雌核發(fā)育個體全部為雌性, 雌性率為100%, 說明本研究探索的翹嘴鱖靜水壓誘導(dǎo)參數(shù)是有效的。

3 討論

本文對靜水壓誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育進行了初步研究, 獲得了靜水壓誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育的最優(yōu)參數(shù)。該方法簡單快捷, 誘導(dǎo)孵化率(受精后72h的存活率)達到7.56%。

該方法流程為: 翹嘴鱖卵子與紫外滅活的精子受精5min, 于63 Mpa靜水壓下持續(xù)處理2min, 孵化桶中常規(guī)孵化。整個過程與目前一般使用的冷休克法的處理時間15—45min相比, 優(yōu)勢較明顯, 如已報道的翹嘴鱖的最合適冷休克時間為30min[14], 紅鯉的冷休克時間為30min[15], 草魚為15—20min[3,16],牙鲆(Paralichtys olivaceus)為45min[17]。與一般使用的熱休克的處理時間1—3min相比, 則時間相當(dāng),導(dǎo)稀有鯽(Gobiocypris rarus)的熱休克時間為1—3min[16], 錦鯉(C. carpiod)為1min[18], 鰱(Hypophthalmichthys molitrix)為1min[19]。

該方法的誘導(dǎo)孵化率為7.56%, 與余銳等[14]報道的冷休克方法誘導(dǎo)翹嘴鱖雌核發(fā)育的孵化率(4.72%)相比較高, 這可能是靜水壓誘導(dǎo)與溫度休克法誘導(dǎo)相比, 對受精卵傷害相對較小的原因, 這在樓允東等報道的虹鱒中也得到證實[20]。但與其他幾種魚類雌核發(fā)育的孵化率相比則偏低, 如半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的孵化率為8%[21], 牙鲆的孵化率為13.7%[22], 大黃魚(Larimichthys crocea)的孵化率為45.5%[23]。各魚類之間誘導(dǎo)孵化率的差異較大, 這一方面可能與每種魚類精子和卵子的敏感性或抗逆性有關(guān)。在一般魚類的雌核發(fā)育中, 溫度或壓力誘導(dǎo)等都是利用了一種亞致死的條件來抑制第二極體的排出, 處理時間加長或強度太大均會導(dǎo)致胚胎畸形或死亡, 處理時間縮短或強度太小則無效果。本研究對翹嘴鱖的精子滅活時間、靜水壓處理前受精時間、靜水壓強度和持續(xù)處理時間都進行了梯度實驗, 并未獲得更高的孵化率, 因此推測翹嘴鱖的卵子或精子的抗逆性可能比其他魚類低。

另一方面, 各研究者對每種魚雌核發(fā)育后孵化率的統(tǒng)計時間點并不一致, 這可能也導(dǎo)致了孵化率之間的差異。本研究在對靜水壓誘導(dǎo)翹嘴鱖受精卵的觀察中發(fā)現(xiàn), 受精卵在約40h出膜后仍然有較多的畸形魚苗陸續(xù)死亡, 我們統(tǒng)計誘導(dǎo)孵化率的時間在受精后72h, 此時魚苗的存活率已經(jīng)相對穩(wěn)定。而半滑舌鰨中雌核發(fā)育8%孵化率的統(tǒng)計時間是原腸胚時期[21], 大黃魚中45.5%孵化率的統(tǒng)計時間則是在受精后60h[23], 翹嘴鱖中4.72%和牙鲆中13.7%孵化率的統(tǒng)計時間未明確說明[14,22]。因此,我們推測雌核發(fā)育誘導(dǎo)孵化率的高低可能與不同物種本身精子和卵子的抗逆性有關(guān), 此外也可能與孵化率的統(tǒng)計時間點有關(guān)。