黃 卉 陳 莉 汪海洋 方 慶 程 超

(1. 湖北民族大學(xué)，恩施 445000; 2. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，恩施 445000)

在生物細(xì)胞中, 氧、有機碳環(huán)和金屬離子三者共同作用能夠形成一些特殊的化合物, 并在生命活動中發(fā)揮重要的功能。血紅素(Heme)是一類含鐵原卟啉[Ferro-protoporphyrin (Fe2+)]化合物,在生物組織細(xì)胞中廣泛分布。據(jù)緊鄰其四吡咯環(huán)外圍的基團(tuán), 血紅素可分為a、 b和c三種不同類型[1]。其中, 在動物細(xì)胞中c型血紅素以卟啉外圍基團(tuán)共價結(jié)合血紅蛋白, 對于氧的轉(zhuǎn)運和貯存、細(xì)胞能量產(chǎn)生和解毒等具有重要功能; 另一方面, 細(xì)胞內(nèi)游離的血紅素卻可誘發(fā)活性氧進(jìn)而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[2—4]。因此, 細(xì)胞內(nèi)血紅素須受酶促作用調(diào)節(jié)以維持相對穩(wěn)定; 而研究血紅素及其酶促調(diào)節(jié)與人體健康和疾病間的關(guān)系具有重要意義[4—6]。

血紅素氧合酶(Heme oxygenase, HO, 也稱血紅素氧化酶)能夠結(jié)合并氧化血紅素, 使之轉(zhuǎn)變?yōu)槟懢G素(Biliverdin, BV), 并釋放亞鐵離子(Fe2+)和一氧化碳(CO); 該酶是細(xì)胞中目前發(fā)現(xiàn)的血紅素氧化分解的限速酶[7,8]。最初, 人們發(fā)現(xiàn)動物體肝臟微粒體中一種介導(dǎo)血紅素氧化分解的酶活性較高;2002年, 日本研究人員報道了首個因人類血紅素氧合酶基因功能缺失、危害兒童生長發(fā)育乃至生命的病理案例, 證實血紅素氧合酶HO是抵抗炎癥、預(yù)防內(nèi)部組織進(jìn)一步氧化損傷刺激的重要防御性因子; 隨后, 關(guān)于生物體中血紅素氧合酶HO的結(jié)構(gòu)與功能方面的研究等取得了較多進(jìn)展[9—11]。目前,在植物等其他生物類群中也發(fā)現(xiàn)HO酶的同源基因,這些基因參與植物抵抗外部環(huán)境脅迫、種子萌發(fā)、氣孔開閉及根形態(tài)發(fā)生等多方面的調(diào)節(jié)[7,12,13]。

原核生物中一些厭氧菌利用血紅素氧合酶來清除多余的氧分[14]。葛仙米(Nostoc sphaeroides),學(xué)名擬球狀念珠藻, 作為藍(lán)藻綱特殊的原核藻類在湖北恩施地區(qū)分布較多, 具有重要的食藥性價值;新近研究發(fā)現(xiàn)葛仙米是促進(jìn)水稻作物生產(chǎn)的重要資源藻類[15—18]。伴隨經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展, 亟需深入研究和開發(fā)葛仙米的生物資源。本研究借助分子生物學(xué)等研究方法, 克隆葛仙米血紅素氧合酶基因并進(jìn)行大腸桿菌細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá), 對其蛋白進(jìn)化地位和高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。本研究有利于深入了解葛仙米血紅素氧合酶基因生物學(xué)功能, 并為進(jìn)一步加強葛仙米資源運用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

葛仙米采自湖北恩施鶴峰走馬鎮(zhèn)(東經(jīng)118.4°,北緯29.8°)。分子克隆用工具酶、表達(dá)載體等分別購于大連寶生物公司(TaKaRa)等公司; PCR用引物由南京金斯瑞公司合成; 克隆與表達(dá)大腸桿菌菌株等材料為實驗室保存。

1.2 DNA的提取

采用CTAB法提取葛仙米總DNA。取少量樣品(2—3團(tuán), 約1 mg)置于預(yù)冷的研缽中, 加入CTAB抽提緩沖液, 浸潤后迅速研磨成糊狀, 然后轉(zhuǎn)入EP管中, 于65℃保溫; 30min后取出, 冷卻后離心,將上清移入新的EP管中, 再加氯仿-異戊醇(24∶1),顛倒混勻, 10000 r/min離心10min, 輕輕吸取上清,加入600 μL異丙醇, 輕輕混勻(可見絮狀物), 4℃靜置10min后, 12000 r/min 離心10min; 75%乙醇洗滌沉淀并晾干, 溶解并低溫貯存樣品。

1.3 PCR擴增

據(jù)GenBank 中HO1基 因(AP018326)采用BLAST檢索葛仙米對應(yīng)基因組 (Locus, NZ_CP031941) 中同源序列, 分析目的基因序列(區(qū)段為53825525383229),設(shè)計上、下游引物分別為: 5′-GGCATATGAGTAGTAA TCTAGCCAT-3′; 5′-GAATTCCTAATGAGTTAG GCTATTA-3′; 上下游引物分別設(shè)計限制性核酸內(nèi)切酶位點為NdeⅠ和EcoRⅠ(堿基序列下劃線所示).擴增目的基因的PCR反應(yīng)程序為 95℃ 3min, 95℃30s, 50℃ 30s, 72℃ 45s, 72℃ 5min, 16℃ 10min, 反應(yīng)循環(huán)數(shù)設(shè)為30。

1.4 克隆目的基因

上述擴增產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀回收。連接反應(yīng)體系為DNA 1.0 μL, ddH2O 3.5 μL, pMD18-T 0.5 μL,Solution 5.0 μL。16℃連接10h, 取連接產(chǎn)物2 μL進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞, 挑選中間克隆子并提取質(zhì)粒和測序鑒定。

1.5 表達(dá)載體連接與轉(zhuǎn)化

pCold Ⅰ 載體及中間載體進(jìn)行酶切反應(yīng)體系為: 載體 3.0 μL,NdeⅠ 1.0 μL,EcoRⅠ 1.0 μL, 10×H buffer 5.0 μL, ddH2O (含RNase) 40 μL。將上述成分輕輕混勻后, 37℃保溫4h, 回收酶切表達(dá)載體及目的基因片段, 進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,再挑選克隆子進(jìn)行測序等進(jìn)一步鑒定。

1.6 序列與蛋白結(jié)構(gòu)分析

對目的基因HO1編碼蛋白氨基酸序列, 限定Nostoc種屬進(jìn)行序列比對, 包括NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST和Clustal (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw);采用MEGA分子進(jìn)化軟件構(gòu)建目的蛋白基于Neighbor-Joining 方法的系統(tǒng)進(jìn)化樹, Bootstrap參數(shù)設(shè)為1000; 葛仙米Ns-HO1蛋白結(jié)構(gòu)分析采用Swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org/), 基于氨基酸序列相似性確定參比模板, 而后進(jìn)行分子模擬。

1.7 目的蛋白大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)與檢測

將正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌株 BL21感受態(tài)細(xì)胞中, 0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá) 4h, 超聲破碎細(xì)胞(破碎功率為 66 W, 時間 10s, 重復(fù) 3次, 間隔10s),制備表達(dá)樣品后進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因Ns-HO1擴增

提取葛仙米基因組DNA, 并以其為模板進(jìn)行PCR。 1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖 1A所示, 目的基因泳道(泳道1)出現(xiàn)擴增單一DNA條帶; 參照DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 (泳道M), 擴增DNA大小在500—750 bp, 與預(yù)期較符合。將目的基因片段回收并成功與pMD18-T克隆載體連接送出測序。結(jié)果顯示目的基因密碼區(qū)全長為678 bp。以上表明, 葛仙米血紅素氧合酶基因Ns-HO1克隆成功。

2.2 Ns-HO1基因在大腸桿菌中表達(dá)

為進(jìn)一步研究目的基因Ns-HO1, 我們成功構(gòu)建了原核細(xì)胞表達(dá)載體pCold-Ns-HO1. 對轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的大腸桿菌經(jīng)約4h, 0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)。而后進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎處理, SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示, 表達(dá)樣品在上清和沉淀(電泳泳道3和4; 圖 1B)中均有近26.0 kD的蛋白分子聚集, 而對照樣品中均未見明顯蛋白聚集(電泳泳道1和2), 表明試驗條件下葛仙米血紅素氧合酶基因Ns-HO1能夠在大腸桿菌細(xì)胞中順利表達(dá)。

2.3 目的基因HO1分子進(jìn)化

葛仙米屬藍(lán)藻門念珠藻科, 其生態(tài)型與生境具有特殊性[18,19,21]。葛仙米Ns-HO1預(yù)編碼含225個氨基酸的多肽鏈。在人類血紅素氧合酶與一種腦膜炎病菌HO1分子中, 最近的螺旋(近N端α螺旋)中一個氨基酸位點(His-25/23)突變能夠?qū)е旅甘Щ?被認(rèn)為是底物血紅素與HO1的最直接接合位點[9]。序列分析顯示, 在念珠藻HO1分子中, His17(H17)與該His-25/23位點對應(yīng), 可能是血紅素金屬鐵離子的關(guān)鍵接合位點(圖 1C, 黑色倒三角所示); 其他關(guān)鍵位點如底物血紅素的預(yù)結(jié)合位點(如Arg10, Tyr125)在該蛋白氨基酸序列中保持穩(wěn)定(圖 1C, 黑色菱形所示氨基酸位點)。

選取念珠藻科里的典型種質(zhì), 如點狀念珠藻(Nostoc punctiforme), 發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)和普通念珠藻(Nostoc commune)等, 對其血紅素氧合酶基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行綜合比對分析, 并構(gòu)建分子進(jìn)化樹(圖 1C和圖 2)。結(jié)果顯示, 血紅素氧合酶同源蛋白氨基酸序列總相似性可達(dá)90.3%。血紅素氧合酶特異性分割血紅素分子α-碳鍵, 產(chǎn)生膽綠素IXα, 酶與底物首先接合是反應(yīng)順利進(jìn)行的前提條件。這些氨基酸位點替換, 可能在一定程度上影響同源蛋白的活性, 預(yù)示不同種源念珠藻的血紅素氧合酶功能可能存在變異。分子進(jìn)化樹顯示, 葛仙米Ns-HO1與點狀念珠藻 (Nostoc punctiforme)等幾個分支藻種中的血紅素氧合酶親緣關(guān)系較近 (圖 2)。該結(jié)果也為葛仙米區(qū)分與其生態(tài)型相近的念珠藻種提供了證據(jù)[18,21]。

圖1 目的基因Ns-HO1PCR擴增(A)及其表達(dá)蛋白(B)與氨基酸序列分析(C)Fig. 1 The gene Ns-HO1 amplication by PCR (A), and its protein(B) and the amino acid sequence analysis (C)

圖2 念珠藻中HO1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 The phylogenic tree of HO1 from Nostoc sp.

2.4 Ns-HO1蛋白高級結(jié)構(gòu)模擬

在葛仙米Ns-HO1形成的二級結(jié)構(gòu)中, 以8個α-螺旋為主要類型。其中位于N和C末端的兩個螺旋(α-螺旋H1和H8) 較大, 并與第四螺旋共同形成Ns-HO1分子的支撐底面; 并且C末端的螺旋, 其突出部分可視為HO1單分子結(jié)構(gòu)的一個特殊支撐; 而另外幾個α-螺旋進(jìn)一步延展并填充其中。含有血紅素預(yù)結(jié)合位點氨基酸殘基(圖 1C, 黑色菱形所示)的幾個肽段形成的螺旋(包括第一、五和七螺旋結(jié)構(gòu))分布于Ns-HO1分子的外圍(圖 3A), 為底物捕獲提供了便利; 另外, 我們發(fā)現(xiàn)在念珠藻血紅素氧合酶HO1中, 一段非常保守的甘氨酸序列(-G-D-L-S-GG-) (圖 1C, 方框所示), 構(gòu)成為第五和第六α螺旋向上延展的連接點, 從而為形成Ns-HO1分子高級結(jié)構(gòu)提供了條件[9,20]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)游離的血紅素分子與HO1靠近后, HO1分子以第一、三和五等主要螺旋維持的疏水內(nèi)核空間, 利于血紅素進(jìn)一步在HO1分子內(nèi)深入進(jìn)而發(fā)生反應(yīng)(圖 3B)。

圖3 Ns-HO1 分子結(jié)構(gòu)模型與血紅素進(jìn)入HO1 分子模式Fig. 3 Ns-HO1 molecular modeling

3 討論

細(xì)胞內(nèi)活性氧等自由基能夠損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子并抑制其正常功能, 自由基理論強化了營養(yǎng)與健康和疾病之間聯(lián)系[22—24]。適當(dāng)補充天然抗氧化物, 對于保持健康、預(yù)防疾病產(chǎn)生具有重要作用[24]。葛仙米在我國食用歷史悠久,含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂類與維生素等活性物質(zhì); 另外, 葛仙米可能還具有抑制感染、抵抗氧化、減緩衰老和預(yù)防腫瘤等重要活性[15—17]。在藍(lán)藻中, 血紅素氧合酶參與藻膽素的合成; 而藻膽素是藍(lán)藻構(gòu)建藻膽體光合器的必需色素, 可能在醫(yī)用生物素方面具有重要的開發(fā)價值[17,19,25]。本研究首次克隆了葛仙米的血紅素氧合酶基因Ns-HO1,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá), 經(jīng)SDS-PAGE鑒定成功表達(dá)目的蛋白, 并對Ns-HO1分子進(jìn)化和高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。實驗為進(jìn)一步研究血紅素氧合酶基因Ns-HO1的生物學(xué)功能、探討其作用機制, 及進(jìn)一步運用奠定了基礎(chǔ)。

在有氧細(xì)胞中, 血紅素合成與分解代謝處于動態(tài)平衡。HO作為血紅素降解的起始酶和限速酶,能氧化分解血紅素產(chǎn)生膽綠素(Biliverdin, BV)、亞鐵離子和一氧化碳。目前, 念珠藻科來源的HO1同源基因編碼血紅素氧合酶的活性研究較少。比較而言, 該酶蛋白分子中關(guān)鍵位點尤為保守, 如His17位點和保守的甘氨酸模體等(圖 1C), 這為底物血紅素中金屬亞鐵離子與該酶分子接合提供了位點基礎(chǔ)。而葛仙米血紅素氧合酶分子形成以8個α-螺旋二級結(jié)構(gòu)為主要支撐的類夾心式結(jié)構(gòu)(圖 3A),為氧化分解血紅素并成功釋放產(chǎn)物提供了重要空間條件[9]。葛仙米血紅素氧合酶其保守的C末端螺旋一部分突出于夾心結(jié)構(gòu)表面, 可能為該酶分子活性提供支撐; 亦或有可能作用于其他分子。另外,血紅素氧合酶HO1的分子進(jìn)化亦可為葛仙米區(qū)別于其他近源念珠藻種提供證據(jù)[18,21]。

膽紅素是一種內(nèi)源性很強的抗氧化劑, 具有抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化作用; 亞鐵離子是一種在體內(nèi)具有多種生物活性的金屬, 它可以被機體產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)儲存鐵蛋白迅速結(jié)合, 從而失去催化自由基產(chǎn)生和防止其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的功能; 一氧化碳作為一種氣體信號分子, 可以通過cGMP途徑發(fā)揮其生理功能[7,26,27]。這表明血紅素氧合酶的防御或應(yīng)激活性很可能與其酶促產(chǎn)物緊密關(guān)聯(lián)。我們借助模式動物飼喂等實驗, 發(fā)現(xiàn)該蛋白很可能具有增強機體應(yīng)激的功能(本文未顯示結(jié)果), 但其具體作用機制還有待深入研究。已有研究發(fā)現(xiàn), 真核來源的血紅素氧合酶HO1能夠保護(hù)細(xì)胞免受血紅素介導(dǎo)的氧化和亞硝基應(yīng)激和損傷, 并能夠在多種病理條件下參與髓系細(xì)胞的募集和T細(xì)胞的反應(yīng)[28,29]。在HIV-1感染時, 多個免疫細(xì)胞亞群中HO1基因表達(dá)上調(diào);HO1過表達(dá)調(diào)控抗HIV免疫; 在惡性腫瘤胰腺管癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PADA)細(xì)胞中, 低氧條件下抑制HO1表達(dá), 則能夠抑制PADA細(xì)胞增殖, 并強化藥物治療效果[30,31]?？梢?若主動調(diào)節(jié)血紅素氧合酶在人體的活性, 有利于保障健康、預(yù)防和治療疾病?？傊? 本研究為深入了解葛仙米血紅素氧合酶基因Ns-HO1功能并為其進(jìn)一步運用提供了分子基礎(chǔ)。