王 影 范金鳳 張 晴 陳 瑛,

(1. 哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150025; 2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)(深圳)土木與環(huán)境學(xué)院, 深圳 518055)

1956年, Lieberman[1]首次從大腸桿菌菌株中分離得到腺苷酸基琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthase, 簡(jiǎn)稱Adss), 后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Adss廣泛存在于生物體內(nèi), 與不同環(huán)境中生存的生命體相適應(yīng)形成較高的遺傳多樣性。從細(xì)菌到高等哺乳動(dòng)物腺苷酸基琥珀酸合成酶同源性在40%—60%。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已登記了約三萬(wàn)種不同生物的Adss基因序列和氨基酸序列, 其中真核生物Adss的共同特征是都含有430—470個(gè)氨基酸, 分子量為45—50 kD,而病毒和細(xì)菌等非真核生物的Adss長(zhǎng)度較短, 約為90—120個(gè)氨基酸。1984年, 科學(xué)家首次利用同位素標(biāo)記法在模式動(dòng)物大鼠體內(nèi)研究Adss的生物學(xué)功能, 發(fā)現(xiàn)Adss可以在三磷酸鳥苷(GTP)去磷酸生成二磷酸鳥苷(GDP)的過程中發(fā)揮催化作用, 用肌苷酸(IMP)和天冬氨酸(Asp)作為原料合成腺苷酸基琥珀酸, 完成肌苷酸轉(zhuǎn)化為腺苷酸的過程, 是腺苷合成途徑最重要的關(guān)鍵酶之一[2,3]。近20年, 各種生物體內(nèi)Adss的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能及其應(yīng)用也被大量報(bào)道[4—13], 其中以Adss作為靶標(biāo)分子開展的抗生素和抗癌新藥研究取得了重要進(jìn)展。在人肺細(xì)胞中Adss的缺失會(huì)引起染色體發(fā)生變化, 影響遺傳物質(zhì)的正常表達(dá), 導(dǎo)致癌變的產(chǎn)生[14]; 在病原體幽門螺桿菌中Adss以二聚體形式存在時(shí), 具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性, 可以與生活環(huán)境高度適應(yīng), 對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可為抑制類藥物的研發(fā)提供參考[15]。而在原生動(dòng)物研究領(lǐng)域, Adss同樣可以作為抗寄生原蟲藥物的作用靶標(biāo)位點(diǎn), 應(yīng)用于杜氏利什曼原蟲等寄生原蟲病的防治[16,17], 在惡性瘧原蟲嘌呤代謝過程中也有Adss的參與, 抑制Adss的活性可用于抗瘧藥物的研發(fā)[18]。Adss作為生物體內(nèi)嘌呤合成過程中必需的酶, 在嘌呤核苷酸合成代謝時(shí)需要三磷酸腺苷(ATP)幫助, 去調(diào)控細(xì)胞內(nèi)核苷酸的平衡[19]。因此, Adss作為一種重要的生物酶, 在生物體內(nèi)的合成代謝和能量代謝系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。

浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)是高等自由生原生動(dòng)物的代表之一, 作為單細(xì)胞模型生物物種已經(jīng)被成功地應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)及毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究中[20—22]。在研究人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)對(duì)浮萍棘尾蟲二分裂增殖的分子作用機(jī)制研究中,發(fā)現(xiàn)浮萍棘尾蟲Adss基因在hEGF誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著上調(diào), 并與多個(gè)細(xì)胞分裂相關(guān)基因存在關(guān)聯(lián), 提示該基因可能參與了浮萍棘尾蟲細(xì)胞分裂和周期的調(diào)控過程[23]。因此有必要明確該基因序列和蛋白特征, 以便進(jìn)一步開展功能和分子機(jī)制研究。

本研究在克隆浮萍棘尾蟲Adss基因的cDNA全長(zhǎng)序列基礎(chǔ)上, 詳細(xì)分析了該基因序列及其編碼的氨基酸、蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)特征, 以及與其他物種同類蛋白的親緣關(guān)系, 并通過重組質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)定位載體, 確定Adss蛋白在浮萍棘尾蟲細(xì)胞中的空間分布, 為后續(xù)利用基因工程方法揭示該基因在原生動(dòng)物中作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

浮萍棘尾蟲準(zhǔn)備浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae), 由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所饋贈(zèng), 隸屬于纖毛門、多膜綱、下毛目、尖毛科、棘尾蟲屬[24]。以麥粒浸出液喂食, 在20—25℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行大量培養(yǎng)。進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)的前3天, 進(jìn)行無(wú)菌化純培養(yǎng)和饑餓處理[25]。

主要試劑Taq酶(EasyTaq?DNA polymerase)、T4DNA連接酶、DNA Marker、EcoRⅠ和PstⅠ限制性核酸內(nèi)切酶和感受態(tài)細(xì)胞(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universa RNA Extraction Kit)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit)購(gòu)自寶生物工程有限公司, 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)、pGM-T克隆試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP120)購(gòu)自天根生化科技有限公司, pEGFPN1質(zhì)粒(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒, 所攜帶的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP), 是一種優(yōu)化的突變型GFP, 可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá), 產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比普通GFP增強(qiáng)約35倍)購(gòu)自上海吉滿生物科技有限公司, Hoechst 33342購(gòu)自于Solarbio公司, LB培養(yǎng)基和乙醇等其他藥品購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 基因克隆

總RNA提取及cDNA合成吸取懸浮培養(yǎng)的浮萍棘尾蟲細(xì)胞5000cells于1.5 mL的離心管中,8000×g4℃離心2min, 棄上清。首先根據(jù)RNA提取試劑盒操作步驟洗脫獲得高質(zhì)量的RNA, 然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟在Microtube中配制反應(yīng)混合液: Oligo dT Primer 1 μL, dNTP Mixture 1 μL, 模板RNA 5 μL, RNase free ddH2O 3 μL, 總量為10 μL。首先在65℃條件下保溫5min后, 冰上迅速冷卻。使模板RNA變性, 提高反轉(zhuǎn)錄效率。在上述Microtube管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液: 上述變性后反應(yīng)液10 μL, 5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL, RNase Inhibitor 0.5 μL, PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL, RNase free ddH2O 4.5 μL, 總量為20 μL, 緩慢混合均勻。首先在50℃條件下處理60min, 然后在95℃條件下處理5min, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。冰上冷卻, 產(chǎn)物收于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)浮萍棘尾蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://stylo.ciliate.org/index.php/home/welcome)中的腺苷酸琥珀酸合成酶基因序列Contig 2018.g2178的序列信息, 依據(jù)保守區(qū)域的氨基酸序列利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物, 上游引物(Adss-F)為: 5′-GTCTGAGGAACATAGCT-3′, 下游引物(Adss-R)為: 5′-GCATCAAGGCAAGTA-3′, 由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

Adss cDNA的克隆與測(cè)序以S. lemnae的cDNA為模板, 用設(shè)計(jì)的引物Adss-F/Adss-R擴(kuò)增Adss基因的啟動(dòng)子序列。PCR反應(yīng)體系: 模板0.5 μL;上、下游引物各0.5 μL; EasyTaq?Buffer 2.5 μL;dNTPs 2 μL; EasyTaq?DNA Polymerase 1 μL;RNase free ddH2O 18 μL, 總量為25 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, 退火52℃30s, 72℃延伸30s, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖溶液電泳檢測(cè), 凝膠成像系統(tǒng)拍照保存, 取鑒定正確的PCR產(chǎn)物依照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒操作步驟, 對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。參考pGM-T克隆連接試劑盒中的說明書將目的基因連接到pGM-T載體上, 轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中, 通過含有氨芐青霉素的LB固體平板進(jìn)行抗性篩選, 挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè), 同時(shí)進(jìn)行LB液體培養(yǎng)基搖菌。選取經(jīng)菌液PCR檢測(cè), 且目標(biāo)條帶大小正確的菌液送哈爾濱博仕生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用Prot-Param(http://web.expasy.org/protparam)軟件分析Adss蛋白的氨基酸序列、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及其他相關(guān)的理化性質(zhì); 通過Signa IP(http://www.cdb.dtu.dk/services/Signa IP/)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè); 使用Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件分析Adss蛋白的親水性和疏水性; NCBI protein BLAST分析, 可獲得Adss蛋白的結(jié)構(gòu)域; 用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在線軟件分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域; TASSER蛋白模型(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu); 運(yùn)用SWISSMODEL(http://swissmodel. expasy.org/)軟件對(duì)蛋白序列三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè); 利用DNAstar軟件包中的MegAlign對(duì)Adss蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)和序列相似性分析。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

首先在National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP比對(duì), 選取和浮萍棘尾蟲Adss氨基酸序列相似度較高的序列, 進(jìn)行多重序列比對(duì), 然后進(jìn)行手工校正, 通過自展(Bootstrap)檢驗(yàn)對(duì)進(jìn)化樹分支的可信度進(jìn)行評(píng)估。最后, 利用軟件MEGA 7.0運(yùn)用最大似然法ML(Maximum Likehood)構(gòu)建Adss蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 Adss基因亞細(xì)胞定位表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)Adss基因起始密碼子ATG后的CDS序列內(nèi)的限制性酶切位點(diǎn)及pEGFP-N1綠色熒光蛋白表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)的情況, 設(shè)計(jì)啟動(dòng)子序列擴(kuò)增引物F/R, 在CDS上下游引物的5′端分別加入EcoRⅠ和PstⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶的切位點(diǎn)(酶切位點(diǎn)序列用下劃線標(biāo)識(shí))。引物為5′-GAATTCGTCTGAG GAACATAGCT-3′和5′-CTGCAGGCATCAAGG CAAGTA-3′。

以浮萍棘尾蟲cDNA為模板, 用設(shè)計(jì)的引物F/R擴(kuò)增Adss基因啟動(dòng)子表達(dá)序列。PCR擴(kuò)增體系、PCR運(yùn)行條件的設(shè)置、目的片段回收純化、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、培養(yǎng)、驗(yàn)證及測(cè)序步驟參見上文。使用EcoRI和PstⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切同時(shí)雙酶切pEGFP-N1載體和Adss基因的cDNA片段。酶切體系:Adss或pEGFP-N1載體3 μL, 10×Cutsmart Buffer 5 μL,EcoRI 1 μL,PstⅠ 1 μL, RNase free ddH2O 20 μL, 總量為40 μL。在37℃條件下, 酶切15min。然后用T4DNA連接酶連接, 連接體系:T4DNA連接酶 1 μL, 10×T4DNA Buffer 2 μL, 酶切后pEGFP-N1載體 1 μL, 酶切后AdsscDNA片段3 μL, RNase free ddH2O 3 μL, 總量為 10 μL。 在25℃條件下, 連接10min, 將目的基因Adss啟動(dòng)子區(qū)和線性載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中, 復(fù)蘇培養(yǎng)使其形成單菌落。進(jìn)行菌液PCR鑒定及測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果無(wú)突變的菌液使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Adss, 用于轉(zhuǎn)染定位使用。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及定位觀察

轉(zhuǎn)染方法參考2003年P(guān)aschka等[26]的實(shí)驗(yàn)方法,通過喂飼法將含有pEGFP-N1-Adss重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)進(jìn)S.lemnae體內(nèi), 以pEGFP-N1為空載對(duì)照, 同時(shí)用Hoechst 33342 (1 μg/mL)進(jìn)行細(xì)胞核染色。轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞接種至六孔板中, 待細(xì)胞密度達(dá)到30%—40%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔細(xì)胞中加入30 μL的大腸桿菌菌液(A600=0.5), 每24h進(jìn)行一次補(bǔ)液, 在蔡司熒光顯微鏡(Axio Imager A2)下觀察Adss蛋白的表達(dá)分布并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 Adss基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆和分析

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板, 用引物Adss-F和Adss-R克隆Adss基因啟動(dòng)子序列片段, PCR擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收、連接轉(zhuǎn)化及測(cè)序的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX比對(duì)。發(fā)現(xiàn)該序列與嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)和海水派琴蟲(Perkinsus marinus)的腺苷酸基琥珀酸合成酶相似度達(dá)到50%以上。進(jìn)一步分析表明, 浮萍棘尾蟲Adss基因片段的長(zhǎng)度為1396 bp, GC含量占43%。最大開放閱讀框?yàn)?26 bp, 預(yù)測(cè)分子量約為48.72 kD, 等電點(diǎn)為9.09。

2.2 Adss基因編碼氨基酸序列特征

Adss基因編碼458個(gè)氨基酸, 其中帶正電荷氨基酸(K、R)46個(gè), 占10.53%, 帶負(fù)電荷氨基酸(D、E)39個(gè), 占8.92%, 疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)152個(gè), 占34.78%, 極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)133個(gè), 占30.43%, 脂肪族類氨基酸(G、A、V、L、I)151個(gè), 占34.55%, 芳香族類氨基酸(F、W、Y)15個(gè), 占3.43%, 堿性氨基酸(K、R、H)62個(gè), 占14.19%, 酸性氨基酸(B、D、E、N、Q、Z)75個(gè), 占17.16%。親/疏水性分析結(jié)果顯示:Adss基因編碼的蛋白在1—9、18—31、47—102、115—129、185—189、209—215、231—242、267—279、310—334、376—380和401—410區(qū)域?yàn)槭杷詤^(qū)域, 在10—17、32—45、104—116、130—139、151—161、165—183、191—202、217—230、245—251、258—265、290—300、335—354、382—400和415—431區(qū)域?yàn)橛H水性區(qū)域。不穩(wěn)定系數(shù)為55.19, GRAVY是-0.264, 屬于親水蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該基因編碼的多肽鏈無(wú)信號(hào)肽, 未形成跨膜結(jié)構(gòu)域。浮萍棘尾蟲屬于單細(xì)胞生物, 說明該蛋白質(zhì)屬于定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或細(xì)胞器基質(zhì)中的蛋白質(zhì), 不屬于膜蛋白或分泌蛋白。

保守結(jié)構(gòu)域分析顯示, Adss氨基酸序列包含有一個(gè)P-loop NTPase超家族結(jié)構(gòu)域, 也被稱為Walker A和Walker B保守基序, 可以與ATP或者GTP結(jié)合, 參與細(xì)胞的生命活動(dòng)過程。

同源性分析發(fā)現(xiàn),S.lemnaeAdss基因編碼的氨基酸序列與其他纖毛蟲Adss的氨基酸序列具有較高的同源性, 與第四雙小核草履蟲Paramecium tetraurelia、嗜熱四膜蟲Tetrahymena thermophila、天藍(lán)喇叭蟲Stentor coeruleus以及多子小瓜蟲Ichthyophthirius multifiliis的Adss氨基酸同源性分別為60.23%、56.84%、56.41%和55.92%。

2.3 Adss氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建基于Adss氨基酸序列的最大似然樹ML(圖 1)顯示, 浮萍棘尾蟲Adss氨基酸序列與草履蟲、嗜熱四膜蟲、多子小瓜蟲及天藍(lán)喇叭蟲Adss氨基酸序列聚為一簇, 親緣關(guān)系最近。與長(zhǎng)雙歧桿菌、土星狀毛霉以及奧爾森派琴蟲等距離較遠(yuǎn)。

圖1 根據(jù)不同物種的Adss氨基酸序列構(gòu)建的最大似然樹Fig. 1 Phylogenetic tree inferred from different species of Adss amino acid sequences using ML

2.4 Adss蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

TASSER蛋白模型預(yù)測(cè)浮萍棘尾蟲Adss蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖 2A), 是由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲組成, 分別占比為53.9%、18.1%和27.8%。SWISSMODEL預(yù)測(cè)浮萍棘尾蟲Adss蛋白的空間結(jié)構(gòu)(圖 2B),發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)相似性最高, 這與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相一致。細(xì)胞色素P450是血紅素蛋白的超家族, 它存在于所有生物的有機(jī)體中, 從細(xì)菌、酵母菌、真菌、植物、動(dòng)物到人體。這種酶的顯著特點(diǎn)是能催化多種有機(jī)化合物的反應(yīng), 并能將有害物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性物質(zhì)并排出體外[27]。

圖2 浮萍棘尾蟲Adss空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Predicted spatial structure prediction of S. lemnae Adss

2.5 Adss表達(dá)序列擴(kuò)增與重組質(zhì)粒鑒定及亞細(xì)胞定位

引物F/R擴(kuò)增S. lemnaeAdss表達(dá)序列片段大小為1408 bp左右, 包括完全編碼區(qū)1396 bp和兩端添加的EcoRI和PstⅠ各6 bp的酶切保護(hù)位點(diǎn)。pEGFP-N1-Adss質(zhì)粒電泳條帶大小為6129 bp左右, 結(jié)果符合預(yù)期。

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Adss轉(zhuǎn)染到浮萍棘尾蟲中, 觀察24h和48h Adss蛋白在蟲體內(nèi)的分布情況(圖 3)。結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Adss的蟲體細(xì)胞質(zhì)中始終有Adss表達(dá), 且48h的熒光表達(dá)量(圖 3J、3K和3L)強(qiáng)于24h的熒光表達(dá)量(圖 3G、3H和3I), 但是細(xì)胞核上始終沒有表達(dá)。轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒pEGFP-N1的蟲體中, 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有明顯熒光反應(yīng), 但是強(qiáng)度沒有隨時(shí)間發(fā)生明顯變化, 在24h的熒光表達(dá)量(圖 3A、3B和3C)高于重組質(zhì)粒組(圖 3G、3H和3I), 48h的熒光表達(dá)量(圖3D、3E和3F)低于重組質(zhì)粒組(圖 3J、3K和3L)。這說明轉(zhuǎn)入蟲體的重組質(zhì)粒中Adss基因啟動(dòng)子序列使Adss蛋白大量表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 Adss在S. lemnae細(xì)胞中的定位(40×)Fig. 3 Intracellular localization of Adss in S. lemnae cells

3 討論

本研究獲得的浮萍棘尾蟲Adss蛋白由458個(gè)氨基酸組成, 屬于典型的真核生物Adss。脊椎動(dòng)物有兩種不同的Adss同工酶, 這兩種酶的等電點(diǎn)不同,一種是堿性酶Adss1, 等電點(diǎn)約為6.0, 參與嘌呤核苷酸循環(huán)的重要過程, 與糖酵解過程密切相關(guān); 另一種是酸性酶Adss2, 等電點(diǎn)約為8.9, 催化AMP的從頭合成, 是反應(yīng)過程中第一個(gè)關(guān)鍵的酶[28]。本研究中預(yù)測(cè)浮萍棘尾蟲Adss蛋白氨基酸組成中的堿性氨基酸有62個(gè), 酸性氨基酸有75個(gè), 含有的酸性氨基酸殘基個(gè)數(shù)較多, 且等電點(diǎn)約為9.09。因此, 其應(yīng)該屬于第二類的酸性酶。

本研究采用構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法進(jìn)行Adss蛋白定位檢驗(yàn), 選擇了一種增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP。由于細(xì)胞內(nèi)部沒有EGFP基因, 因此可以通過連接EGFP和靶基因的編碼區(qū), 從而通過熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。本研究結(jié)果表明這一方法在浮萍棘尾蟲目標(biāo)基因表達(dá)定位研究中是可行的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后48h熒光強(qiáng)度高于24h, 提示Adss蛋白表達(dá)量隨時(shí)間推移而升高, 其機(jī)制和生理意義還有待研究。本研究確定浮萍棘尾蟲的Adss蛋白定位于細(xì)胞質(zhì), 在人體骨髓細(xì)胞和豬腎上皮細(xì)胞中Adss2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的線粒體中[29,30], 浮萍棘尾蟲Adss蛋白是否也定位于線粒體還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

浮萍棘尾蟲Adss保守結(jié)構(gòu)域中含有P-loop NTPase, P-loop NTPase結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞質(zhì)中蛋白組裝的重要組成部分[31], 因此推測(cè)浮萍棘尾蟲體內(nèi)Adss在蛋白質(zhì)加工過程中同樣發(fā)揮重要作用。已有研究表明Adss蛋白在生物的代謝過程中屬于必需酶, 作為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子之一, Adss蛋白的定位對(duì)于理解蛋白質(zhì)功能和分子機(jī)制具有重要作用。而且, 目的基因Adss啟動(dòng)子序列的克隆及相應(yīng)表達(dá)載體的構(gòu)建, 也是研究Adss基因啟動(dòng)子區(qū)功能以及研究其如何進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一個(gè)重要內(nèi)容。

因此, 本研究補(bǔ)充了單細(xì)胞真核動(dòng)物Adss基因序列信息, 并對(duì)其基因序列特征、氨基酸序列、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成和空間結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了描述, 豐富了該基因遺傳多樣性數(shù)據(jù)庫(kù), 也為進(jìn)一步揭示纖毛蟲Adss基因的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。