王發(fā)艷 劉 丹 高 強(qiáng) 晁 燕 聶苗苗 楊朝杰 倪偉琳 王麗晗 祁得林

(1. 青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西寧 810016; 2. 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院, 西寧 810016;3. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系, 西寧 810016)

血紅蛋白(Hemoglobin, Hb)是承擔(dān)轉(zhuǎn)運(yùn)氧氣和二氧化碳的功能的必須蛋白, 幾乎存在于所有的脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞(除南極冰魚(yú)類(lèi)[1])及部分無(wú)脊椎動(dòng)物組織中[2]。脊椎動(dòng)物的血紅蛋白是由2個(gè)α-珠蛋白亞基和2個(gè)β-珠蛋白亞基組成的四聚體。隨著個(gè)體發(fā)育, 血紅蛋白珠蛋白亞基的組成會(huì)發(fā)生顯著的變化, 這種在特定階段表達(dá)特殊的血紅蛋白的現(xiàn)象稱(chēng)為血紅蛋白的時(shí)序轉(zhuǎn)換(Hemoglobin switching)[3—5]。血紅蛋白時(shí)序轉(zhuǎn)換是一個(gè)發(fā)展的過(guò)程, 涉及多個(gè)血紅蛋白編碼基因的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 該過(guò)程與造血系統(tǒng)發(fā)育密不可分, 在血紅蛋白向組織輸送氧氣的過(guò)程中起著重要作用[5]。

人類(lèi)血紅蛋白包括胚胎型(HbE)、胎兒型(HbF)和成年型(HbA)血紅蛋白, 在卵黃囊發(fā)育的紅系祖細(xì)胞中表達(dá)HbE血紅蛋白[6], 第1次時(shí)序轉(zhuǎn)換發(fā)生在懷孕后第12周, 胚胎型血紅蛋白HbE的表達(dá)急劇下調(diào), 直至由胎兒型血紅蛋白HbF所取代[7], 第2次血紅蛋白時(shí)序轉(zhuǎn)換發(fā)生在新生兒出生后6周左右, HbF血紅蛋白表達(dá)水平下降并由成年型血紅蛋白HbA所取代[8]。斑馬魚(yú)(Danio rerio)胚胎發(fā)育早期血紅蛋白由7個(gè)基因(hbae1、hbae3、hbbe1、hbae4、hbbe3、hbae5和hbbe2)所編碼, 稱(chēng)為胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白[9,10]。與人類(lèi)血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達(dá)相似, 斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期經(jīng)歷兩次血紅蛋白時(shí)序轉(zhuǎn)換, 即第1次由胚胎型到仔魚(yú)型血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受精后24—36h, 其顯著特征是hbbe3基因表達(dá)急劇下降而基因開(kāi)始表達(dá), 仔魚(yú)期hbbe2基因表達(dá)顯著上升并伴隨hbae5基因的表達(dá); 第2次由仔魚(yú)型到成年型的血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受精后22d, 其顯著特征是hbbe1/hbae1和hbbe2基因表達(dá)持續(xù)下降, 開(kāi)始表達(dá)成年型血紅蛋白, 直到受精后32d完全建立成年型血紅蛋白體系[9,10]。

研究表明, 硬骨魚(yú)類(lèi)全基因組復(fù)制事件促進(jìn)了硬骨魚(yú)類(lèi)包括血紅蛋白基因家族在內(nèi)的多個(gè)基因家族大量擴(kuò)增, 導(dǎo)致血紅蛋白基因家族的功能多樣性, 從而使基因家族成員獲得截然不同的生化功能或呈現(xiàn)特異的表達(dá)特征[11—13]。裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)是伴隨青藏高原隆升過(guò)程進(jìn)化形成的一個(gè)自然類(lèi)群,被認(rèn)為經(jīng)歷了第4輪全基因組復(fù)制[14], 研究其血紅蛋白家族成員的組成及血紅蛋白時(shí)序轉(zhuǎn)換具有重要意義。花斑裸鯉(Gymnocypris eckloni)屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚(yú)亞科(Schizothoracinae)、裸鯉屬(Gymncypris)[15], 是裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)的代表種之一, 對(duì)高原缺氧環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)性, 但在血紅蛋白表達(dá)調(diào)控方面并無(wú)研究報(bào)道。研究表明, 花斑裸鯉受精卵在14—16℃水溫條件下, 48h形成肌節(jié), 進(jìn)入器官形成階段, 96h進(jìn)入心臟跳動(dòng)期, 120h開(kāi)始破膜, 144h破膜結(jié)束, 432h卵黃囊消失, 魚(yú)鰭發(fā)育較為完全, 初步具備成魚(yú)的體型[16,17]。本文以花斑裸鯉為研究對(duì)象, 參照胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)采集樣本[16,17], 利用整胚原位雜交技術(shù)研究胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白在花斑裸鯉胚胎發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)轉(zhuǎn)換特征, 為進(jìn)一步研究血紅蛋白時(shí)序轉(zhuǎn)換及造血系統(tǒng)發(fā)育積累科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)中花斑裸鯉胚胎樣品由青海省循化縣蘇只黃河魚(yú)類(lèi)人工增殖站提供。

1.2 整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa PrimeSscript RT reagent kit with gDNA eraser)、膠回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)、普通PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa PremixTaqplus dye); pGEM-T載體(PROMEGA pGEM-T Easy Vector), 質(zhì)粒DNA提取試劑盒(TIAN Rapid Mini Plasmid Kit); SP6 RNA Polymerase(Roche)、T7 RNA Polymerase(Roche)、Anti-Digoxigenin-AP(Roche)、NBT/BCIP Stock Solution(Roche)、DIG RNA Labeling Mix(Roche), tRNA(Roche)。

主要儀器NanoPhotometer NP80微量核酸蛋白測(cè)定儀, NiKon SMZ25體式顯微鏡。

1.3 花斑裸鯉胚胎/ 仔魚(yú)型血紅蛋白基因CDS序列獲取

以實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)得的花斑裸鯉基因組序列構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)https://ftp.cngb.org/, ID: CNA0035945),以 NCBI 中已公布的斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白編碼基因hbae1(NM_182940)、hbae3(NM_183066)、hbae4(NM_001082834)、hbae5(NM_001326701)、hbbe1(NM_198073)、hbbe2(NM_212846)和hbbe3(NM_001015058)的CDS 序列為搜索條件(Queries), 通過(guò) TBtools v1.098669軟件[18]獲取花斑裸鯉胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白基因 CDS 序列。

1.4 花斑裸鯉胚胎樣品

采樣地點(diǎn)位于青海省循化縣蘇只黃河魚(yú)類(lèi)人工增殖站, 花斑裸鯉人工繁殖時(shí)選擇年齡4—8齡、體重400—1400 g、發(fā)育良好、無(wú)傷無(wú)病的雌、雄魚(yú)作為催產(chǎn)的親魚(yú)。對(duì)親魚(yú)進(jìn)行稱(chēng)重, 根據(jù)體重提前1周注射促黃體素釋放激素和多潘立酮。雌、雄魚(yú)分開(kāi)養(yǎng)殖1周左右, 等待其性成熟后按照雌雄比為3∶1進(jìn)行人工授精和胚胎孵化[孵化溫度為(13±1)℃]。

參照花斑裸鯉胚胎發(fā)育研究結(jié)果, 采集受精后48h 、72h 、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h、288h、312h、336h、360h、384h、408h和432h的胚胎各兩份。1份用4%多聚甲醛(PFA)固定24h后, 在-20℃保存于100%甲醇中, 用于后續(xù)整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)；1份液氮保存, 用于提取RNA。

1.5 探針載體的構(gòu)建與RNA探針制備

構(gòu)建探針載體提取花斑裸鯉胚胎樣品總RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 根據(jù)已經(jīng)獲得的血紅蛋白基因CDS序列設(shè)計(jì)特異性探針引物, 所有引物由上海生工生物合成(表 1), 以上述cDNA為模板對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增, 經(jīng)切膠回收純化后, 將目的基因連接到pGEM-T載體中, 獲得對(duì)應(yīng)重組載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中, 篩選陽(yáng)性克隆送至生工生物測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果采用NCBI-Blast-2.2.28 +軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blastn命令搜索實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的花斑裸鯉基因組本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。取測(cè)序正確的質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA作為探針合成的模板。

表1 整胚原位雜交探針引物Tab. 1 Primer information used for whole embryo in situ hybridization

體外轉(zhuǎn)錄RNA探針?lè)磻?yīng)取10 μg酶切得到的DNA,基因插入方向?yàn)檎? 則加入10×buffer B(add BSA)10 μL, Enzyme SacII 5 μL, 最后用DEPC水補(bǔ)充至100 μL; 基因插入方向?yàn)榉聪? 則加入buffer Trago(with BSA)10 μL, EnzymeSpeI 5 μL, 最后用DEPC水補(bǔ)充至100 μL。37℃孵育2h, 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)孵育結(jié)果, 后測(cè)定濃度以用于RNA 探針制備。

取1 μg孵育的DNA, 加入10×transcription buffer 2 μL, DIG-RNA labeling 2 μL, RNase inhibitor 1 μL, polymerase(正向?yàn)門(mén)7 polymerase, 反向?yàn)镾P6 polymerase)5 μL, 用DEPC水補(bǔ)充至20 μL。短暫低速離心后封口膜封口, 37℃水浴2h后, 加入2 μL RNase free DNase, 37℃加熱15min, 加入適量的LiCl和預(yù)冷的無(wú)水乙醇, 將上述反應(yīng)液在-20℃保存過(guò)夜。將反應(yīng)液從-20℃取出后4℃、12000 r/min離心30min, 去除廢液, 加入1 mL冰預(yù)冷的70%乙醇, 上下顛倒混勻, 使沉淀懸浮, 離心棄廢液, 管底是一層白色沉淀, 超凈工作臺(tái)干燥后加入55℃預(yù)熱的DEPC水, 輕彈溶解, 獲得反義RNA探針, 正義探針的合成需要相反的酶。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)探針質(zhì)量后保存于-80℃。

1.6 整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)

整胚原位雜交方法參考文獻(xiàn)[19, 20], 顯色后用70%酒精洗滌3次, 每次30min, 去除背景顏色。顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果, 采集圖像, 更換新的70%酒精, 避光保存于-20℃。

2 結(jié)果

2.1 花斑裸鯉胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白基因 CDS序列

通過(guò)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)搜索, 鑒定到花斑裸鯉5個(gè)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白基因, 包括3個(gè)α-珠蛋白基因:hbae1、hbae4和hbae5, CDS序列全長(zhǎng)分別為432、426和432 bp, 分別編碼143、141和143個(gè)氨基酸;2個(gè)β-珠蛋白基因hbbe1和hbbe3, CDS序列全長(zhǎng)分別為444和441 bp, 分別編碼147和146個(gè)氨基酸。搜索結(jié)果中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)花斑裸鯉基因組中與斑馬魚(yú)hbae3和hbbe2基因同源的序列。將鑒定得到的花斑裸鯉胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白氨基酸序列與斑馬魚(yú)中對(duì)應(yīng)基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì), 結(jié)果顯示兩個(gè)物種α-珠蛋白hbae1、hbae4及hbae5基因的氨基酸序列同源性分別為88.11%、87.23%和79.02%, β-珠蛋白hbbe1和hbbe3基因的氨基酸序列同源性為82.99%和 79.59%。

2.2 探針的合成效果與特異性驗(yàn)證

將陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果與花斑裸鯉基因組的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn), 擴(kuò)增片段與目的片段完全一致, 提取質(zhì)粒DNA后進(jìn)行酶切, 得到探針模板用于制備整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)正、反義探針。

2.3 花斑裸鯉胚胎型血紅蛋白基因在胚胎發(fā)育中的整胚原位雜交表達(dá)

hbae1與hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為30.79%、28.29%、34.54%和32.38%;hbae4與hbae5、hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為34.03%、38.65%和36.13%;hbae5與hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為34.54%和37.9%;hbbe1和hbbe3核酸序列相似性為35.08%。

整胚原位雜交結(jié)果顯示,hbae1基因(圖 1a)在花斑裸鯉胚胎受精后120h開(kāi)始表達(dá), 雜交信號(hào)持續(xù)表達(dá)至受精后432h, 在192—288h期間雜交信號(hào)最為強(qiáng)烈, 后呈下降趨勢(shì)。hbae4基因 (圖 1b)與hbae5基因(圖 1c)在整個(gè)胚胎發(fā)育階段未觀(guān)察到雜交信號(hào)。hbbe1基因(圖 1d)在花斑裸鯉胚胎受精后96h開(kāi)始表達(dá), 雜交信號(hào)持續(xù)表達(dá)至受精后432h, 整體表達(dá)趨勢(shì)與hbae1基因相同。hbbe3基因(圖 1e)在受精后120—384h內(nèi)均能觀(guān)察到雜交信號(hào), 在192—288h期間雜交信號(hào)最為強(qiáng)烈, 但相較于hbae1和hbbe1基因,hbbe3基因雜交信號(hào)持續(xù)時(shí)間較短。

圖1 花斑裸鯉胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白基因整胚原位雜交結(jié)果Fig. 1 Whole embryo in situ hybridization results of embryo/larval hemoglobin gene

雖然不同的花斑裸鯉胚胎/仔魚(yú)型基因的表達(dá)情況有所不同, 但觀(guān)察到雜交信號(hào)的hbae1、hbbe1與hbbe3基因在胚胎發(fā)育階段的表達(dá)位點(diǎn)基本相同。在胚胎發(fā)育的96h在胚胎肌節(jié)形成初期正中軸處出現(xiàn)雜交信號(hào), 胚胎發(fā)育至120h雜交信號(hào)遷移至胚胎軀干中央, 發(fā)育至144h在胚胎正中軸兩側(cè)及位于腎節(jié)部位的中央細(xì)胞團(tuán)部位均能觀(guān)察到雜交信號(hào), 胚胎發(fā)育至168h、192h和216h時(shí), 雜交信號(hào)隨著胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育轉(zhuǎn)移至胚胎卵黃囊、背主動(dòng)脈腹側(cè)區(qū)(Ventral wall of dorsal aorta,VDA)及尾部造血區(qū)(Caudal hematopoietic tissue,CHT), 240h胚胎破膜而出, 在胚胎卵黃部位可以觀(guān)察到網(wǎng)狀的雜交信號(hào), 這種現(xiàn)象一直持續(xù)到該基因雜交信號(hào)減弱至消失。

3 討論

脊椎動(dòng)物在進(jìn)化早期連續(xù)發(fā)生兩次全基因組復(fù)制事件, Amores等[21]研究結(jié)果表明硬骨魚(yú)在大約320—400百萬(wàn)年發(fā)生了第3次全基因組復(fù)制事件,被稱(chēng)為硬骨魚(yú)特異性基因組復(fù)制。有研究表明硬骨魚(yú)類(lèi)在全基因組復(fù)制事件中, 一些基因會(huì)發(fā)生重復(fù)復(fù)制和刪除, 使得胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白編碼基因的種類(lèi)和數(shù)量在種間存在較大差異[22—24], 例如,青鳉(Oryzias latipes)基因組中擁有9個(gè)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白:hbae0、hbae1、hbae2、hbae3、hbae4、hbbe1、hbbe2、hbbe3和hbbe4[25]; 斑馬魚(yú)基因組中含hbae1、hbae3、hbae4、hbae5、hbbe1、hbbe2和hbbe3共7個(gè)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白[10]; 黃河裸裂尻魚(yú)(Schizopygopsis pylzovi)中共鑒定到4個(gè)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白, 分別是hbae1、hbae4、hbbe1和hbbe3[26]。在本研究中, 通過(guò)花斑裸鯉基因組數(shù)據(jù)共鑒定到5個(gè)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白, 分別是hbae1、hbae4、hbae5、hbbe1和hbbe3。與斑馬魚(yú)相比, 花斑裸鯉基因組缺少hbae3與hbbe2基因, 與黃河裸裂尻魚(yú)相比, 花斑裸鯉基因組中保留了hbae5基因, 因此推測(cè)花斑裸鯉在適應(yīng)高原環(huán)境的進(jìn)化過(guò)程當(dāng)中丟失hbae3與hbbe2基因, 可能與裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)第四輪全基因組復(fù)制事件后發(fā)生的小規(guī)?；騽h除事件有關(guān)。

在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的第16個(gè)體節(jié)期檢測(cè)到胚胎型血紅蛋白hbbe3開(kāi)始表達(dá), 伴隨hbae1、hbae3和hbbe1的表達(dá), 在第1次血紅蛋白時(shí)序轉(zhuǎn)換時(shí), 胚胎型血紅蛋白轉(zhuǎn)換為仔魚(yú)型血紅蛋白,hbbe3基因表達(dá)水平下降, 而hbbe2基因表達(dá)顯著上升并伴隨hbae5珠蛋白的表達(dá), 第2次血紅蛋白時(shí)序轉(zhuǎn)換時(shí)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白表達(dá)水平下降并且轉(zhuǎn)換為成年型血紅蛋白[9]。在本研究中, 花斑裸鯉hbae1、hbbe1與hbbe3基因在胚胎器官形成階段出現(xiàn)雜交信號(hào),表達(dá)信號(hào)從胚胎期持續(xù)至仔魚(yú)期, 且在胚胎向仔魚(yú)轉(zhuǎn)換階段雜交信號(hào)最為強(qiáng)烈, 這與斑馬魚(yú)胚胎/仔魚(yú)型血紅蛋白基因表達(dá)研究大致相似, 說(shuō)明hbae1、hbbe1和hbbe3基因在花斑裸鯉胚胎發(fā)育早期有氧代謝方面發(fā)揮了重要作用。斑馬魚(yú)仔魚(yú)型血紅蛋白編碼基因hbae5表達(dá)量低且持續(xù)時(shí)間短[9],在Nefedochkina等[27]的研究發(fā)現(xiàn), 斑馬魚(yú)hbae4基因轉(zhuǎn)錄水平極低, 僅為hbae5轉(zhuǎn)錄水平的2%。在黃河裸裂尻魚(yú)胚胎型血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達(dá)初步研究中, 發(fā)現(xiàn)黃河裸裂尻魚(yú)基因組丟失hbae5基因且hbae4基因表達(dá)極其微弱[26]?；ò呗沲幣咛グl(fā)育過(guò)程中并未觀(guān)察到hbae4與hbae5基因的雜交信號(hào), 由此推測(cè)hbae4和hbae5基因可能在裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中不發(fā)揮生物學(xué)功能或出現(xiàn)功能的弱化。與斑馬魚(yú)有所不同的是, 在斑馬血紅蛋白基因家族中hbbe3基因僅在胚胎發(fā)育初始階段高表達(dá), 胚胎破膜后基因表達(dá)量下降、雜交信號(hào)微弱[9], 而花斑裸鯉胚胎破膜后仍然可以觀(guān)察到hbbe3基因的雜交信號(hào), 而且表達(dá)信號(hào)強(qiáng)烈、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng), 因此, 花斑裸鯉具有與斑馬魚(yú)和黃河裸裂尻魚(yú)不同的血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達(dá)特征, 這可能與花斑裸鯉特殊的進(jìn)化歷程和高原環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。

在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中, 原始造血有兩個(gè)起始部位: 前部側(cè)向中胚層(Anterior Lateral Mesoderm, ALM), 這里生成原始髓系細(xì)胞; 另一個(gè)起始部位時(shí)后部側(cè)向中胚層(Posterior Lateral Mesoderm, PLM), 受精后原始造血最先發(fā)生于ALM部位, 在受精后18h, PLM部位進(jìn)一步發(fā)育形成中央細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu), 生成紅細(xì)胞前體并進(jìn)入血液循環(huán)[28]。斑馬魚(yú)定向造血起始于VDA區(qū)域, 在受精后48h, 定向造血轉(zhuǎn)移至CHT, 在受精后144h定位于生成成熟血細(xì)胞的場(chǎng)所腎臟[28]。在本研究中可以觀(guān)察到花斑裸鯉胚胎早期發(fā)育過(guò)程中, 雜交信號(hào)主要位于胚胎正中軸、胚胎軀干中央、卵黃囊、VDA和CHT部位, 位點(diǎn)與斑馬魚(yú)相同, 表明花斑裸鯉造血系統(tǒng)發(fā)育可能與斑馬魚(yú)相一致。