徐紅琴 馬慧妹 曾 起 胡蓓娟 盛軍慶 洪一江

(1. 南昌大學生命科學學院, 南昌 330031; 2. 江西省水產動物資源與利用重點實驗室, 南昌 330031)

在池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn), 成熟池蝶蚌中雌蚌比例偏高。這種現(xiàn)象在其他貝類中也普遍存在, 例如如馬氏珠母貝Pinctada martensi, 雄蚌先熟, 隨著貝齡的增加, 比例逐漸減少, 三齡之后, 雌蚌比例占優(yōu)勢[1,2]。在貝類性腺發(fā)育過程中, 發(fā)生了一定程度的性逆轉。在無脊椎動物軟體動物門中的雌雄同體現(xiàn)象也有不少報道, 如在牡蠣Saccostrea echinata[3]、櫛孔扇貝Chlamys nobilis[4]、蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis[5]、馬氏珠母貝[6]、菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum[7]和池蝶蚌[8]等貝類中發(fā)生雌雄同體或者性逆轉現(xiàn)象, 且以海水貝類雌雄同體現(xiàn)象為主要報道, 淡水貝類雌雄同體現(xiàn)象目前有扭蚌Arconaia lanceolata[9]、褶紋冠蚌cristaria plicata[10]和池蝶蚌[8], 研究都不深入, 關于雌雄同體現(xiàn)象或性逆轉發(fā)生的機制仍不清楚。

物種的性別可以通過兩種方式來決定[11,12]: 基因(基因型性別決定或Genotypic Sex Determination,GSD), 即受精時染色體的組成決定了物種的性別;環(huán)境(環(huán)境性別決定或Environmental Sex Determination, ESD), 即胚胎發(fā)育過程中遇到的外在條件決定了物種的性別。但是即使都是GSD型, 不同物種的性別決定機制仍存在很大差異。如, 哺乳動物通過Sry(Sex-determining region on Y)[13,14]調控Sox9(Sry-box 9)與促進雌性發(fā)育的Wnt/β-catenin相互抑制共同決定個體的性別[15], 其中能獨立決定雌性性別發(fā)育的Foxl2[16], 也與Sox9存在抑制作用[17]; 黑腹果蠅通過性染色體與常染色體的比例(X∶A)決定性別: 當X∶A≥1時, 機體釋放雌性遺傳信號激活Sxl(Sex lethal)[18]表達蛋白,Tra(Transformer)mRNA前體與之結合后發(fā)生雌特異性的可變剪接,激活Dsx(Doublesex)發(fā)生雌特異性剪接, 表達出雌特異DSX蛋白, 個體發(fā)育為雌性[19]。當X∶A=0.5時,機體釋放雄性遺傳信號,Sxl和Tra均未活化,Dsx直接發(fā)生雄特異性剪接, 表達雄特異DSX蛋白, 個體發(fā)育為雄性[20]; 秀麗隱桿線蟲通過性染色體的數(shù)量決定性別: XO(1條X染色體)個體釋放雄性遺傳信號激活Her-1(Hermaphrodization)表達蛋白, 抑制Tra-2的表達, 激活雄性性別決定必需基因Fem(Feminization)[21]表達FEM蛋白, 抑制Tra-1后又進一步激活DM域轉錄因子的表達, 發(fā)育為雄性。XX個體Her-1不表達蛋白,Tra-2被激活[22], 抑制Fem表達[23],Tra-1被激活[24], 表達TRA1蛋白抑制DM域轉錄因子轉錄, 促進卵巢的發(fā)生, 發(fā)育為雌雄同體[25,26]。ESD型物種決定性別的方式也很多樣, 其中比較普遍的是ESD中的TSD型(Temperature Sex Deterination), 如爬行動物[27]。

于非非等[28]曾探討過雙殼類的性轉換現(xiàn)象及其機理, 認為影響雙殼類性別轉換的關鍵因素在于基因和環(huán)境因素(營養(yǎng)條件、水溫、群體性別構成)兩個方面, 但雙方在雙殼類性別轉換中的主導地位, 有待于進一步研究。已知溫度能增加貝類第一次性腺分化和配子發(fā)生的動力學[29], 影響淡水貝類的配子發(fā)育[30]。本文探究了溫度對池蝶蚌雌雄同體和性逆轉的影響, 結合性別相關基因的表達變化, 說明溫度對池蝶蚌生殖濾泡的分化有影響, 并且可能是通過影響Dmrt1等性別決定相關基因的表達發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

池蝶蚌取自于江西省撫州市南城縣池蝶蚌良種場。

雌雄同體蚌篩選材料(表 1): 2017年5月繁育的26—32月齡雌雄蚌(取樣時間為2019年7月—2020年1月)、2018年5月繁育的26、29—31月齡雌雄蚌(取樣時間為2020年7月、10—12月)和2020年5月繁育的6月齡雌雄蚌, 共960只(表 1)。

溫度刺激實驗材料: 2018年5月繁育的26月齡雌雄蚌, 雌、雄蚌各45只; 2019年6月繁育的13月齡雌雄蚌, 雌、雄蚌各40只。

時空表達實驗材料: 分別是2017年5月繁育的27—32月齡雌雄蚌, 每月定期取樣1次, 共6次, 每次雌、雄蚌各9只; 胚胎及2019年6月繁育的1—7月齡蚌, 每月定期取樣一次, 共8次, 每次30—50只。

Dmrt1原位雜交: 6月齡雌雄蚌、31月齡雌雄同體蚌。

1.2 雌雄同體蚌篩選及其發(fā)育跟蹤觀察

2019年7月17日開始逐月篩選雌雄同體蚌,2020年11月20日結束篩選。2019年10月10日抽樣觀察233只29月齡蚌, 獲得20只雌雄同體蚌。其中10只刻字標記(編為1—10號), 每月跟蹤觀察一次, 2020年7月結束, 共4次; 2020年10月04日—2020年10月05日抽樣觀察190只29月齡蚌,獲得8只雌雄同體蚌, 刻字標記(編為11—18號),每月跟蹤觀察一次, 2020年12月結束, 共2次;2020年11月06日—2020年11月07日抽樣觀察150只30月齡蚌, 獲得1只雌雄同體蚌, 刻字標記(編為19號), 每月跟蹤觀察1次, 2020年12月結束,共1次。

1.3 溫度刺激

基地抽取池蝶蚌性腺, 鏡檢分雌雄, 各自編號標記, 帶回實驗室, 室溫暫養(yǎng)1周。準備兩套相同的養(yǎng)殖系統(tǒng), 一套養(yǎng)殖系統(tǒng)內包含4口小缸, 長48 cm、寬30 cm、高40.5 cm (SUNSUN HE-480桌面小魚缸)和1口大缸, 長60 cm、寬35 cm、高40 cm, 4臺魚類專用冷水機、2個加溫棒和10個增氧石(統(tǒng)一開到最大, 控制溶氧量)。置水(4個蚌5 L水, 32個蚌40 L水, 大約在小缸的高27.8 cm處, 42個蚌52.5 L水, 大約在大缸的高25 cm處, 控制養(yǎng)殖密度), 另一套換水備用。設置5個溫度梯度: (15±1)℃、(19±1)℃、(23±1)℃、(27±1)℃和(31±1)℃(池蝶蚌養(yǎng)殖水域最低溫為1月份10℃左右, 最高溫為繁殖季節(jié)30℃左右[31])。將170只蚌分為5組, 每小組的蚌數(shù)和蚌號如表 1。在溫度刺激30d后, 13月齡的第22號雌蚌、26月齡的第26號雄蚌、26月齡的第10、第12、第20、第21、第30號雌蚌死亡。

1.4 總RNA提取

TRIzol法提取。在時空表達材料中, 大齡蚌每次3只蚌1組混樣(雌雄分開), 小齡蚌每次10—15只混樣, 平行混3組; 在溫度刺激材料中, 存活的同溫度蚌2只蚌1組混樣(雌雄分開), 每個溫度約3個平行組; 在雌雄同體材料中, 29月齡和31月齡的雌雄同體蚌單只蚌成組。在每只蚌開殼后, 剪開內臟團表皮, 從中間部位夾取適量性腺顆粒, 置于加入RNAiso Plus裂解液的離心管內, 過液氮, 研磨儀研磨, 氯仿分離總RNA, 異丙醇沉淀, 75%的無水乙醇洗滌,DEPC水溶解。

1.5 qRT-PCR

根據(jù)已克隆出來的Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1和Foxl2六個基因的 cDNA, 使用 Oligo7.0 軟件設計qRT-PCR引物(表 2)。采用2-ΔΔCt法,以β-actin基因作為內參基因評估結果。

1.6 HE染色

將溫度刺激的蚌取性腺組織分塊。14月齡蚌取部位1、2和3進行HE染色(qRT-PCR檢測部位4,圖 1A); 27月齡取部位1、2、3、4和5進行HE染色(qRT-PCR檢測部位6, 圖 1B)。同時鏡檢2020年篩選的9只雌雄同體蚌, 將仍有同體現(xiàn)象的16號、18號、19號31月齡雌雄同體池蝶蚌性腺分8塊(參照本實驗室前期分塊方法[32], 如圖 1C和1D, 部位7用于原位雜交分析), 并隨機挑選12只6月齡小蚌,性腺組織對半分2塊。

圖1 池蝶蚌性腺組織分區(qū)Fig. 1 Gonadal tissue division of H. schlegelii

中性通用型組織固定液固定24h以上, 無水乙醇梯度脫水, 純二甲苯透明, 石蠟包埋(6月齡蚌的性腺全部包埋在同一蠟塊內)。切片厚度6 μm, 二甲苯脫蠟, 乙醇梯度復水, 蒸餾水流洗(用于原位雜交的切片烘干備用, 不進行下一步的染色), 蘇木精染色, 1%鹽酸99%乙醇分化, 3%氨水返藍, 乙醇梯度脫水, 曙紅染色, 無水乙醇脫水, 二甲苯透明, 中性樹脂封片, 烘干, 鏡檢。

1.7 Dmrt1原位雜交

構建帶有EcoRⅠ酶和XhoⅠ酶切位點的pET-32a-Dmrt1重組質粒(表 2), 將生工測序正確的菌液提取重組質粒為cDNA模板, 設計探針引物(表 2),克隆目的序列并回收PCR產物為制備探針模板, 按照T7 High Efficiency Transcription Kit (Tranagen,Beijing)試劑盒的說明將dNTP Mix換成地高辛標記的RNA Labeling Mix, 合成探針后立即按照Easy?RNA Purification Kit說明書純化, 并稀釋至0.5—2 μg/mL備用。

表2 本實驗所用引物序列Tab. 2 Primers used in this study

取6月齡雌、雄蚌, 31月齡雌雄同體蚌(部位7),中性通用型組織固定液(含有1/1000 DEPC)固定1.5h, 常規(guī)脫水, 包埋。切片厚度6 μm, 常規(guī)脫蠟,復水, 烘干, 組化筆圈住組織, mRNA核酸片段暴露,預雜交, 雜交, 封閉, 孵生物素化鼠抗地高辛, SABCAP和BCIP/NBT顯色, 充分水洗, 封片。

2 結果

2.1 雌雄同體池蝶蚌篩選和跟蹤觀察

本實驗室前期已在26—32月齡發(fā)現(xiàn)雌雄同體池蝶蚌[32], 本研究兩年內不斷地對6月齡和26—32月齡池蝶蚌性腺進行雌雄同體現(xiàn)象篩選, 并將篩選出的雌雄同體蚌定期跟蹤觀察, 結果顯示池蝶蚌在6、28和29月齡較容易出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象(表 3), 且雌雄同體蚌在發(fā)育至30月齡左右向不同性別分化:77.8%分化為雄蚌、16.7%維持雌雄同體現(xiàn)象和5.5%分化為雌蚌(表 4和圖 2)。

圖2 跟蹤觀察的雌雄同體蚌Fig. 2 The regular observation of hermaphroditic H. schlegelii

表3 雌雄同體蚌篩選情況Tab. 3 The screening situation of hermaphrodite H. schlegelii

表4 雌雄同體蚌跟蹤觀察Tab. 4 Tracking observation of hermaphrodite H. schlegelii

2.2 溫度影響池蝶蚌雌雄生殖濾泡分化

本研究對隨機篩選的6月齡蚌和已鏡檢確定的31月齡雌雄同體蚌性腺組織切片觀察, 結果顯示6月齡蚌出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象, 雌性生殖濾泡占70%,雄性生殖濾泡占30%(圖 3A—C); 31月齡雌雄同體蚌內出現(xiàn)三種生殖濾泡: 雌性生殖濾泡、雄性生殖濾泡和雌雄生殖細胞共存濾泡(圖 3D—F), 同時發(fā)現(xiàn)其內的雄性生殖濾泡有向雌性生殖濾泡轉分化的趨勢(圖 3G—J), 初步認定篩選到的28月齡雌雄同體蚌(9月份)可能由雄蚌變化而來。結果表明池蝶蚌生殖濾泡具有多能性, 性腺中雌雄同體現(xiàn)象有三種產生方式: 一個個體中同時分化出雌和雄兩種生殖濾泡、一個生殖濾泡中同時分化出雌和雄兩種生殖細胞、雄性生殖濾泡轉分化為雌性濾泡的過渡階段。

圖3 池蝶蚌性腺發(fā)育期間的雌雄同體現(xiàn)象Fig. 3 Hermaphroditic phenomenon during development of H. schlegelii

另一方面, 本研究利用32℃、27℃、23℃、19℃和15℃五個溫度誘導13、26月齡雌和雄蚌生殖濾泡分化, 30d后, 切片結果顯示(圖 4): 32℃誘導,14月齡雄蚌出現(xiàn)12.5%雌雄同體現(xiàn)象; 27℃誘導,14月齡雄蚌和27月齡雄蚌分別出現(xiàn)37.5%和12.5%性逆轉; 23℃誘導, 14月齡雌蚌出現(xiàn)14.29%性逆轉; 19℃誘導, 14月齡雌蚌出現(xiàn)25%性逆轉。不包括死亡的蚌。

圖4 14、27月齡池蝶蚌在5個溫度(15℃、19℃、23℃、27℃和32℃)下的性比柱狀圖Fig. 4 Histograms of sex ratio of 14-month-old and 27-month-old H. schlegelii at five temperatures (15℃, 19℃, 23℃, 27℃ and 32℃)

以上結果表明, 池蝶蚌生殖濾泡在4月齡—37月齡具有多能性, 溫度影響其分化: 27℃及以上的高溫容易誘導雄蚌向雌蚌逆轉或產生雌雄同體現(xiàn)象, 23℃及以下的低溫容易誘導雌蚌向雄蚌逆轉。且性腺發(fā)育早期受溫度影響更大。

2.3 池蝶蚌性別調控機制的初步探究

本研究利用qRT-PCR技術檢測池蝶蚌胚胎、1—7月齡內臟團及27—32月齡雌、雄蚌性腺內Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五個基因的時空表達水平, 結果顯示:Tra2a、Fem1b、Fem1c和Sox9四個基因在1—7月齡的mRNA水平與胚胎期相比沒有明顯變化, 但是Tra2a、Fem1b和Fem1c三個基因的mRNA水平有相同的變化趨勢, 而Sox9基因在5月齡內臟團內, 呈現(xiàn)與之相反的表達趨勢(圖 5)。同時Tra2a、Fem1b、Fem1c和Sox9四個基因在27—32月齡的雌、雄蚌中均有表達, 其中Tra2a和Sox9在雄蚌中表達高于雌蚌。并且Tra2a、Fem1b和Fem1c三個基因在雌、雄蚌中的表達趨勢一致, 而Sox9基因在27—30月齡的表達趨勢與三者一致, 31、32月齡的表達趨勢與三者相反(圖 6)。這說明Fem1b和Fem1c的時空表達趨勢基本一致, 與Tra2a大體一致, 在5、32月齡與Sox9相互抑制。

圖5 池蝶蚌胚胎以及1—7月齡內臟團內性別決定相關基因的mRNA表達水平Fig. 5 mRNA expression levels of sex-determining related genes in embryo and visceral mass of H. schlegelii at 1—7 months of age

圖6 27—32月齡池蝶蚌性腺組織內性別決定相關基因的mRNA表達水平Fig. 6 mRNA expression levels of sex-determining related genes in gonad of H. schlegelii at 27—32months of age

另一方面Dmrt1基因在1—7月齡的mRNA水平與胚胎期相比, 1—5月齡基本上不表達, 直到6、7月齡才開始表達量有顯著性上升, 并且在27月齡雄蚌中表達高于雌蚌, 之后在28—32月齡的雄蚌中特異性表達。這說明Dmrt1基因可能與原始生殖細胞的分化以及雄蚌的發(fā)育有關。

本研究利用qRT-PCR技術檢測13、26月齡雌和雄蚌性腺在15℃、19℃、23℃、27℃和32℃五個溫度刺激下Tra2a、Fem1b、Sox9、Dmrt1和Foxl2五個基因的表達水平, 結果顯示(圖 7): 不同發(fā)育階段的雌、雄蚌的Tra2a、Fem1b和Sox9三個基因在不同溫度下的變化趨勢總體上一致; 不同發(fā)育階段的雌、雄蚌的Dmrt1基因與Tra2a、Fem1b和Sox9三個基因在15、19和23℃變化趨勢相同, 在27和32℃變化趨勢不穩(wěn)定, 但是在27月齡雄蚌中與Fem1b基因變化趨勢一致, 與Sox9基因在27和32℃的表達趨勢相反; 另一方面, 雄蚌中的Foxl2基因基本不表達, 14月齡的雌蚌的Foxl2與Tra2a、Fem1b、Sox9、Dmrt1四個基因在不同溫度下表達趨勢基本相反, 但在27℃與Fem1b基因相同; 27月齡雌蚌的Foxl2與Fem1b基因在不同溫度下的變化趨勢基本一致, 與Dmrt1基因在不同溫度下的變化趨勢基本相反, 與Tra2a和Sox9兩個基因在15、19℃下變化趨勢相同, 在23、27和32℃下變化趨勢相反。

圖7 在不同溫度刺激下13、26月齡雌和雄蚌性腺內性別決定相關基因的mRNA表達水平Fig. 7 mRNA expression levels of sex-determining related genes in gonad of female and male H. schlegelii at 13 and 26 months of age

本研究利用qRT-PCR技術分別檢測29和31月齡雌、雄、雌雄同體蚌性腺內Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1和Foxl2六個基因的表達水平, 結果顯示(圖 8):

圖8 29、31月齡雌、雄和雌雄同體蚌性腺組織內性別決定相關基因的mRNA表達水平Fig. 8 mRNA expression levels of sex-determining related genes in gonad of female, male and hermaphrodite H. schlegelii at 29 and 31 months of age

與同期雄蚌比較, 29和31月齡雌雄同體蚌的Tra2a、Fem1b、Sox9和Dmrt1四個基因在開始階段先全部表達量上升, 之后又下降。與同期雌蚌相比, 31月齡雌雄同體蚌的Foxl2基因的表達量明顯降低。

2.4 池蝶蚌Dmrt1 mRNA 在雌、雄、雌雄同體蚌性腺中的細胞學定位

Dmrt1mRNA原位雜交結果顯示, 在雄性生殖濾泡精原細胞、桑葚胚結構、精母細胞和精細胞上檢測到陽性信號(圖 9D), 在雌性生殖濾泡初級卵母細胞上未出現(xiàn)陽性信號(圖 9B), 在雌雄同體生殖濾泡成熟卵母細胞上檢測到陽性信號(圖 9G)。這說明Dmrt1不僅與雄性原始生殖細胞分化有關, 同時與成熟卵母細胞的發(fā)育有關。

圖9 池蝶蚌 Dmrt1 mRNA 在性腺中的細胞學定位Fig. 9 Localization of Dmrt1 mRNA in H. schlegelii gonads at the mature stage demonstrated by in situ hybridization

3 討論

3.1 溫度對淡水貝類性腺發(fā)育的影響

本研究中, 在自然條件下, 6月齡蚌(12月份左右)中發(fā)現(xiàn)以雌性濾泡為主的雌雄同體池蝶蚌, 說明某些6月齡池蝶蚌在前期性別分化時, 原始生殖濾泡可能優(yōu)先分化為雌性濾泡, 后期由于持續(xù)低溫的誘導, 原始生殖濾泡又分化為雄性濾泡, 從而出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象, 這表明低溫可能有利于雄蚌發(fā)育;28月齡蚌(9月份左右)中發(fā)現(xiàn)雄性濾泡為主的雌雄同體池蝶蚌, 說明某些28月齡池蝶蚌前期是雄蚌,由于持續(xù)高溫的誘導, 原始生殖濾泡又開始分化出雌性濾泡, 這表明高溫可能有利于雌蚌的發(fā)育。另外, 本實驗室研究人員最開始在26月齡左右蚌內發(fā)現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象[32], 與后期研究者在28月齡左右蚌內發(fā)現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象有明顯的月齡差異[8], 但是因為雙方的研究對象分別為秋繁蚌和春繁蚌, 所以均是在歷經酷暑的9月份左右發(fā)現(xiàn)蚌內出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象, 這進一步說明雌雄同體蚌的產生需要一定時間以及一定強度的溫度刺激。而且溫度對池蝶蚌生殖濾泡分化的影響可能比較大, 一方面是因為本文在觀察雌雄同體蚌的性腺組織時發(fā)現(xiàn)同一個生殖濾泡內能分化出雌雄兩種生殖細胞; 另一方面是因為前期分析池蝶蚌雌雄線粒體DNA雙重單性遺傳時發(fā)現(xiàn)沒有明顯的性別連鎖線粒體遺傳現(xiàn)象[33]。

因此本文設計了溫度刺激實驗, 證實了溫度影響池蝶蚌原始生殖濾泡的分化, 27℃及以上的高溫容易誘導雄蚌向雌蚌逆轉或產生雌雄同體現(xiàn)象,23℃及以下的低溫容易誘導雌蚌向雄蚌逆轉。但是仍然還有一些問題亟須解決, 比如貝類性腺發(fā)育的整個生殖周期均會受到溫度的影響嗎? 所有貝類的性腺均具有分化出兩種生殖細胞的潛能嗎? 性腺發(fā)育受到溫度影響的貝類在下一個發(fā)育周期是維持影響后的性別還是再次回歸原本的性別呢?這些都需要進一步研究。

3.2 溫度影響淡水貝類性腺發(fā)育的分子機制

溫度僅僅只是一種外在刺激, 它能增加貝類第一次性腺分化和配子發(fā)生的動力學[29], 但最終影響仍需通過內在性別決定與分化機制級聯(lián)放大表現(xiàn)出來。本研究檢測了池蝶蚌性別決定相關基因(Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9、Dmrt1和Foxl2)在不同發(fā)育階段以及不同組織中的表達量, 發(fā)現(xiàn)Dmrt1在胚胎和6、7月齡表達顯著高于其他時期。且Dmrt1mRNA原位雜交在6月齡雄蚌生殖濾泡精原細胞、“桑葚胚”結構、精母細胞、精細胞和發(fā)育后期的卵母細胞中檢測到陽性信號。這說明Dmrt1不僅參與6月齡雄性生殖細胞的分化, 而且參與在27月齡雌蚌生殖濾泡內成熟卵母細胞的排放。并且在這個時期, 雄蚌內Sox9的表達高于其他時期, 雄蚌內Dmrt1可能與其一起在此時調控DNA甲基化從而調節(jié)雄性生殖干細胞的多能性, 因此導致28月齡出現(xiàn)雄性濾泡轉分化的雌性濾泡, 如Dmrt1-Sox2級聯(lián)調節(jié)精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)的多能性[34]。另外,Dmrt1在胚胎期表達高可能是因為此時開始發(fā)生遺傳上的性別決定,開始激活雄性特異性基因的表達, 類似于小鼠性腺分化時Dmrt1的表達變化, 開始在雌雄胚胎的生殖嵴內表達差異不明顯, 隨著性腺的分化, 雌雄胚胎間Dmrt1表達量發(fā)生巨大變化[35]。

在本研究中, 在池蝶蚌性腺中,Fem1b和Fem1c有相同的表達趨勢, 且兩者在5和29月齡表達均低于其他時期, 說明它們可能行使同一種功能。池蝶蚌內臟團在5月齡時期出現(xiàn)性腺組織, 發(fā)育至29月齡時, 性腺組織濾泡數(shù)目增多, 體積增大[36],Fem基因在這兩個階段受到抑制, 是否同線蟲XX個體發(fā)育, 抑制Fem表達, 進而抑制DM域基因表達,卵巢發(fā)生, 形成雌雄同體[25,26]。Foxl2為雌性特有,能獨立地決定雌性性別發(fā)育, 這已經在多種物種中得到證實[16]。本文27℃下的27月齡雌蚌性腺內Foxl2的表達量顯著高于其他溫度, 說明27℃有利于雌蚌發(fā)育。23℃下的14和27月齡雄蚌性腺內Sox9的表達量顯著高于其他溫度, 19℃下的14和27月齡雌蚌性腺內Dmrt1的表達量顯著高于其他溫度, 說明19和23℃有利于雄蚌發(fā)育, 并且Dmrt1可能參與19℃下誘導雌蚌性逆轉的過程。同時在雌雄同體蚌內,Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五個基因都存在先高表達, 再低表達的趨勢。總之,這五個基因可能都參與雌雄同體的形成以及性逆轉的發(fā)生, 并且可能位于多條調控通路上, 因為它們彼此之間沒有很明顯的表達互抑現(xiàn)象。而Sox9可能在Dmrt1上游, 一方面是Dmrt1啟動子上有Sry、Sox5等性別相關轉錄因子的結合位點[37], 另一方面是凝膠阻滯分析Sox9和Dmrt1兩個啟動子調控結果, 發(fā)現(xiàn)Sox9可能自調控, 也可能調控Dmrt1[38]。

綜上, 溫度影響池蝶蚌生殖濾泡的分化, 27℃及以上的高溫容易誘導雄蚌向雌蚌逆轉或產生雌雄同體現(xiàn)象, 23℃及以下的低溫容易誘導雌蚌向雄蚌逆轉; 并且溫度可能是通過調控Dmrt1等性別相關基因的表達量, 從而調節(jié)生殖濾泡分化的。