鄧穎慧

(首都醫(yī)科大學(xué)石景山教學(xué)醫(yī)院，北京市石景山醫(yī)院，北京 100043)

原發(fā)性膽囊癌是膽道系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。膽囊癌發(fā)病率居消化系統(tǒng)腫瘤的第6位，占膽道腫瘤的80%～95%。因其早期癥狀不典型，診斷比較困難，多數(shù)患者明確診斷時已為中晚期[1]。目前膽囊癌疾病生物學(xué)機制尚不明確，缺少特異性標(biāo)志物[2]。T細(xì)胞淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(Tiam1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，在乳腺癌、胃癌與肺癌等多種癌組織中呈比較高的表達率[3]。

本實驗選取具有詳細(xì)臨床資料和隨訪結(jié)果的52 例原發(fā)性膽囊癌及10 例非癌性膽囊疾病的石蠟包埋組織，通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測Tiam1在原發(fā)性膽囊癌和非腫瘤性膽囊疾病組織的表達情況，分析Tiam1的表達程度及其與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管侵犯、TNM分期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

收集2012年1月—2018年1月經(jīng)病理證實為原發(fā)性膽囊癌的患者石蠟標(biāo)本52 例，膽囊良性疾病患者石蠟標(biāo)本10 例，所有標(biāo)本均為手術(shù)后切除標(biāo)本，并且臨床資料完整。所有病例具有詳細(xì)的臨床資料和隨訪結(jié)果，并且術(shù)前均未接受放療和化療。術(shù)后病理切片經(jīng)過兩位病理專家閱片證實。52 例膽囊癌患者中，腫瘤>2.5 cm 24 例(46.15%)，≤2.5 cm 28 例(53.85%)。

1.1.2 病例查詢內(nèi)容

患者住院號、病理號、性別、年齡、腫塊大小、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、淋巴血管侵犯情況、手術(shù)日期、死亡日期及隨訪日期。

1.1.3 主要實驗器材

醫(yī)用凈化工作臺：蘇州金燕凈化設(shè)備廠生產(chǎn)。冰凍切片機：德國徠卡公司生產(chǎn)。微波爐：格蘭仕公司生產(chǎn)?？鞠?DHG-9053A)：上海一恒科技有限公司生產(chǎn)。光學(xué)顯微鏡(CX51)：日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。照相顯微鏡：日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要試劑

免疫組化染色超敏試劑盒(S-P法)：北京中山生物公司。濃縮型兔抗人Tiam1多克隆抗體：Abcam公司。DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋公司。0.01%枸椽酸鹽緩沖液：1 000 mL蒸餾水內(nèi)加枸椽酸0.4 g，枸椽酸鈉3 g。PBS緩沖液(PH=7.4)：1 000 mL蒸餾水內(nèi)加入Na2HPO4·12H2O 6 g，NaH2PO4·2H2O 0.4 g，氯化鈉9 g。

1.2 實驗方法

本實驗運用免疫組織化學(xué)EnVisionTM二步法測定Tiam1表達情況。按照試劑盒操作說明書操作，Tiam1抗體工作濃度為1∶100，具體操作步驟如下。

1.2.1 實驗步驟

甲醛固定標(biāo)本24 h后進行脫水、浸蠟、包埋、制備5 μm厚的石蠟切片，60 ℃烘烤10 min。此過程由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科協(xié)助完成。石蠟切片二甲苯脫蠟、乙醇水化：將石蠟切片依次浸入二甲苯Ⅰ液2～5 min，浸入二甲苯Ⅱ液2～5 min；浸入無水乙醇中1～2 min，浸入95%乙醇中1～2 min，浸入80%乙醇中2～5 min，浸入70%乙醇中2～5 min；自來水沖洗片刻，蒸餾水沖洗5 min。用PBS緩沖液沖洗2 次，每次5 min，用干紗布吸干PBS液。30%過氧化氫室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗3 次。石蠟切片高壓抗原修復(fù)：將適量的抗原修復(fù)液在微波爐中加熱煮沸；將切片置于金屬架上，放入微波爐中，使切片位于液面以下加熱，然后微波解凍15 min，至室溫，蒸餾水沖洗后，PBS緩沖液洗滌3 次，每次5 min。每張切片滴加50 μL正常山羊血清封閉液，室溫下孵育60 min。PBS洗滌5 min，連續(xù)3 次。每張切片滴加50 μL一抗，20～37 ℃條件下孵育1 h，PBS緩沖液洗滌3 次，每次5 min。滴加二抗，20～37 ℃條件下孵育60 min，PBS緩沖液洗滌3 次，每次5 min。滴加S-P免疫復(fù)合物(三抗)，20～37 ℃條件下孵育20 min，PBS洗滌3 次，每次5 min。DAB顯色：每張切片滴加50 μL新鮮配制的DAB顯色劑(取1 mL蒸餾水，加入DAB顯色劑盒A，B，C試劑中各1 滴，混勻)，室溫顯色，一般5～30 min，蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 結(jié)果判定方法

免疫組化結(jié)果由2名不了解臨床資料的高級職稱病理科醫(yī)師共同閱片，Tiam1陽性細(xì)胞著色見于細(xì)胞質(zhì)，呈黃褐色。染色結(jié)果的判定為高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，共計數(shù)1 000個細(xì)胞。Tiam1的表達情況根據(jù)染色強度及染色陽性細(xì)胞的百分率來計分。

1.2.2.1 染色強度計分標(biāo)準(zhǔn)

0 分：無色；1 分：淡黃色；2 分：棕黃色；3 分：黃褐色。

1.2.2.2 陽性染色細(xì)胞百分率計分

0 分：陽性細(xì)胞數(shù)0；1 分：陽性細(xì)胞數(shù)0～10%；2 分：陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%；3分：陽性細(xì)胞數(shù)>50%。

1.2.2.3 分值計算

將兩種計分結(jié)果相乘得到腫瘤最終得分。腫瘤最終得分>4 分者(即腫瘤10%的細(xì)胞染色強度中等或強)被視為Tiam1的陽性表達，≤4 分為陰性。最終結(jié)果由兩位病理醫(yī)師使用雙盲法分別觀察每張切片的情況，并獲得一致意見。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗將Tiam1在原發(fā)性膽囊癌組織中的表達程度與非腫瘤性膽囊組織不同的生物學(xué)特征進行比較，采用χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件的使用Fisher精確概率檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理，雙側(cè)檢驗，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Tiam1在膽囊癌組織和非癌性膽囊組織中的表達

膽囊癌細(xì)胞中Tiam1的陽性染色主要集中在細(xì)胞質(zhì)中(見圖1)，呈黃褐色顆粒狀物質(zhì)，顏色不一。Tiam1陽性表達44 例(84.61%)。在非癌變的膽囊組織中均未檢測到Tiam1免疫反應(yīng)(見圖2)。

Tiam1在膽囊癌組織中呈陽性表達，黃褐色，位于細(xì)胞漿 (SP×400)

Tiam1在非癌性膽囊組織中呈陰性表達(SP×400)

2.2 原發(fā)性膽囊癌Tiam1的表達與臨床特征的關(guān)系

2.2.1 原發(fā)性膽囊癌Tiam1的表達與性別和年齡的關(guān)系

52 例原發(fā)性膽囊癌患者中，男性和女性患者Tiam1陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。年齡≥60 歲和年齡<60 歲患者陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 膽囊癌組織中Tiam1的表達與年齡和性別的關(guān)系

2.2.2 原發(fā)性膽囊癌Tiam1的表達與腫瘤浸潤深度和淋巴血管侵犯的關(guān)系

52 例原發(fā)性膽囊癌組織中，腫瘤浸潤至黏膜層、肌肉層、結(jié)締組織和浸出漿膜患者的Tiam1陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)；有淋巴血管侵犯和無淋巴血管侵犯患者的Tiam1陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)(見表2)。

表2 膽囊癌組織中Tiam1的表達與浸潤深度和淋巴血管侵犯的關(guān)系

2.2.3 原發(fā)性膽囊癌Tiam1的表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期的關(guān)系

52 例原發(fā)性膽囊癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移患者的Tiam1陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010)。根據(jù)2018年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南對52 例原發(fā)性膽囊癌患者進行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者的Tiam1陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)(見表3)。

表3 膽囊癌組織中Tiam1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期的關(guān)系

3 討 論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移涉及腫瘤細(xì)胞惡性增殖、腫瘤組織新生血管形成、腫瘤細(xì)胞黏附分泌蛋白降解機制及腫瘤細(xì)胞遷移運動、躲避免疫監(jiān)視等多種過程，是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)[4]，腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力與其自身的運動能力密切相關(guān)。細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)特性的不同導(dǎo)致其運動能力的不同，是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞以及其他具有不同轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細(xì)胞之間的生物遺傳素質(zhì)差異的具體表現(xiàn)。

Tiaml是Habets等[5]于1994年從鼠T淋巴瘤中分離出來的一種腫瘤轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因，其產(chǎn)物Tiaml蛋白作為一種鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子，特異性激活Rac1，并通過Tiaml-Rac信號途徑，改變腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能。Tiam1蛋白通過與其他蛋白質(zhì)分子相結(jié)合進行亞細(xì)胞定位及活性調(diào)節(jié)[6-7]，參與了細(xì)胞骨架重組、形體極化、運動和遷移過程[8-9]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[10-11]。近年來越來越多的研究已經(jīng)證實了Tiam1在腫瘤進展中的作用，在肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、胃癌等多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)Tiam1蛋白的高表達，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)[12-13]。

Tiam1能夠激活Rac1并誘導(dǎo)細(xì)胞膜的細(xì)胞骨架介導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞黏附運動，從而在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。Tiam1作為Ras超家族的分離刺激因子，結(jié)構(gòu)中含有DH(Db1 homology)和PH(Pleckstrin homology)結(jié)構(gòu)區(qū)，其DH區(qū)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。正常表達的Tiam1或只含有DH功能區(qū)的蛋白都具有這種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的特性。

雖然原發(fā)性膽囊癌的總體發(fā)病率不是很高，但卻是膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的一類。原發(fā)性膽囊癌早期缺少特征性癥狀和體征，這是由于早期膽囊癌病變小、局限，其臨床表現(xiàn)及各種檢查與膽囊結(jié)石雷同或易被結(jié)石掩蓋。其早期診斷困難，多數(shù)患者診斷時即為中晚期，導(dǎo)致膽囊癌患者預(yù)后差，生存率低，5 年總生存率僅為5%[14]。因此提高膽囊癌的早期診斷率及尋找更有效的治療手段一直是人們關(guān)注的問題。有學(xué)者[15]也對膽囊癌的分子生物學(xué)異常進行了廣泛而深入的研究，試圖尋找膽囊癌的早期診斷分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點。

本實驗采用了免疫組化法檢測Tiam1在52 例原發(fā)性膽囊癌組織、10 例非腫瘤性膽囊組織中的表達。結(jié)果顯示原發(fā)性膽囊癌組織中Tiam1陽性率為84.61%，非腫瘤性膽囊組織中呈陰性表達。結(jié)合臨床資料，探討Tiam1與膽囊癌的臨床病理之間關(guān)系，證實Tiam1陽性表達的腫瘤患者更易出現(xiàn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.010)和淋巴血管侵犯(P=0.009)。52 例原發(fā)性膽囊癌患者中，Tiam1表達陽性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例為13 例(86.67%)，Tiam1陽性表達但未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例31 例(83.78%)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010)。有淋巴血管侵犯的Tiam1陽性表達率為92.31%(12/13)，無淋巴血管侵犯的Tiam1陽性表達率為82.05%(32/39)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)，提示Tiaml蛋白的高表達與膽囊癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴血管侵犯密切相關(guān)，說明Tiaml蛋白在膽囊癌的進展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究中Tiam1陽性表達膽囊癌患者與腫瘤分期、浸潤深度及患者生存具有相關(guān)性。根據(jù)2018年NCCN指南對52 例原發(fā)性膽囊癌患者進行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期Tiam1陽性表達率為79.41%(27/34)，Ⅲ～Ⅳ期Tiam1陽性表達率為94.44%(17/18)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Tiaml蛋白高表達與膽囊癌的惡性程度密切相關(guān)。52 例原發(fā)性膽囊癌組織中，腫瘤浸潤至黏膜的Tiam1陽性表達率為0(0/2)，肌肉層的Tiam1陽性表達率為75.00%(6/8)，結(jié)締組織的Tiam1陽性表達率為90.00%(27/30)，浸出漿膜的Tiam1陽性表達率為91.67%(11/12)，四者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)。Tiam1陽性表達膽囊癌患者與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。

研究表明，Tiaml可提示結(jié)腸癌[16]、食管癌[17]、胃癌[18]、乳腺癌等多種腫瘤的預(yù)后，即Tiaml蛋白高表達患者生存期短、預(yù)后差。Li等[19]通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Tiaml高表達是影響乳腺癌患者不良預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。本次研究發(fā)現(xiàn)Tiaml蛋白高表達與膽囊癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移、淋巴血管侵犯、臨床分期密切相關(guān)，提示Tiaml蛋白高表達的患者預(yù)后差、生存時間短(即Tiaml蛋白高表達可成為膽囊癌患者不良預(yù)后的一項分子指標(biāo))。

綜上所述，Tiam1在膽囊癌的轉(zhuǎn)移、侵襲過程中起了一定的作用，對于判斷膽囊癌的進展具有一定的價值。