劉俊仙 劉菁 唐榮華 陽(yáng)太億 韓柱強(qiáng) 唐秀梅 賀梁瓊 鐘瑞春 蔣菁 黃志鵬 吳海寧 韋榮昌 熊發(fā)前

摘要：以2份AA染色體組野生種花生為試驗(yàn)材料，擴(kuò)增分離Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，分析其序列特征、多樣性及進(jìn)化關(guān)系。利用根據(jù)Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的保守區(qū)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)目的條帶進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序后，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。目的條帶大小均約為430 bp，分別從2份AA染色體組野生種花生材料中分離到32、33條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，對(duì)于65條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，其長(zhǎng)度變化范圍為 397～440 bp，A+T所占比例范圍為56.48%～68.14%，（A+T）/（G+C）為1.3～2.13，核苷酸序列間相似性范圍為 62.6%～97.9%;65條逆轉(zhuǎn)錄酶序列被劃分為9個(gè)家族，其中家族Ⅰ為主要成分;翻譯成氨基酸后，序列間相似性范圍為12.4%～98.6%，相比核苷酸序列，氨基酸序列表現(xiàn)出更高的異質(zhì)性;65條逆轉(zhuǎn)錄酶序列中有26條發(fā)生了無(wú)義突變，2份野生種花生材料的無(wú)義突變發(fā)生率相當(dāng);序列間保守基序大體一致，但也發(fā)生了一定的變異，呈現(xiàn)出一定的異質(zhì)性;9個(gè)家族所選代表序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)總體類(lèi)似，但也在螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)、折疊結(jié)構(gòu)數(shù)、轉(zhuǎn)角數(shù)、氫鍵數(shù)、α-螺旋數(shù)、β-折疊數(shù)上存在差別;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，所有逆轉(zhuǎn)錄酶序列被分為13類(lèi)，A類(lèi)和B類(lèi)中包含大部分逆轉(zhuǎn)錄酶序列，E類(lèi)中的5條AA染色體組野生種花生與其他物種植物的逆轉(zhuǎn)錄酶序列具有較高相似性，表明這些序列在進(jìn)化過(guò)程中有可能發(fā)生了橫向傳遞;通過(guò)比對(duì)花生EST數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)3條來(lái)自Archis duranensis（PI262133）和2條來(lái)自A.duranensis（PI219823）的Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子具有轉(zhuǎn)錄活性，本研究為下一步分離Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)序列、研究其轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性和功能提供序列基礎(chǔ)，也為基于Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的花生屬分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生種花生;Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子;逆轉(zhuǎn)錄酶;多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.201 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0043-12

花生被譽(yù)為“長(zhǎng)生果”，是世界上最重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，也是最重要的植物食用油來(lái)源之一[1]。我國(guó)是世界花生生產(chǎn)第一大國(guó)，種植面積達(dá)500萬(wàn)hm2/年以上，約占全球的20%;我國(guó)花生產(chǎn)量達(dá)1 700萬(wàn)t/年，約占全球的40%，居全球首位，花生占我國(guó)油料作物總產(chǎn)（不包括大豆）的46%;花生油約占國(guó)產(chǎn)植物油的25%，僅次于菜籽油，是國(guó)產(chǎn)植物油的第二大來(lái)源[2]。

轉(zhuǎn)座子是指能從同一條染色體或不同染色體上的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)位點(diǎn)的可移動(dòng)DNA序列[3]。轉(zhuǎn)座子分為逆轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分為長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）逆轉(zhuǎn)座子和非LTR逆轉(zhuǎn)座子，Ty1-copia和Ty3-gypsy是LTR逆轉(zhuǎn)座子的主要兩大類(lèi)型[4-6]，這兩大類(lèi)LTR逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶序列可以利用簡(jiǎn)并PCR技術(shù)擴(kuò)增出來(lái)。LTR逆轉(zhuǎn)座子非常適合用來(lái)開(kāi)發(fā)成分子標(biāo)記，序列特異擴(kuò)增多態(tài)性（S-SAP）、逆轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)間擴(kuò)增多態(tài)性（IRAP）和逆轉(zhuǎn)座子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性（REMAP）是目前基于LTR逆轉(zhuǎn)座子的主要分子標(biāo)記技術(shù)[7-8]。

MITEs轉(zhuǎn)座子已在花生上被較廣泛地研究和應(yīng)用[9-23]，而花生LTR逆轉(zhuǎn)座子的研究報(bào)道較少[24-25]。Nielen等先后分離出花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的FIDEL和Ty1-copia類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的Matita，對(duì)其特性和作用進(jìn)行分析[24-25]。

筆者曾系統(tǒng)對(duì)花生LTR逆轉(zhuǎn)座子和MITE轉(zhuǎn)座子的分離及其應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了歸納[1]，也對(duì)四倍體野生種花生（Arachis monticola）的Ty1-copia類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因進(jìn)行克隆與分析[26]，但尚未見(jiàn)對(duì)AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行分離和多樣性分析的報(bào)道。

本研究擬分離AA染色體組野生種花生A.duranensis的Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，分析其序列特征和多樣性，弄清其序列組成和變異模式及其與其他物種植物之間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步分離其全長(zhǎng)序列、研究其轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性和功能提供序列基礎(chǔ)，也為基于Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的花生屬分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2份AA染色體組野生種花生材料分別為A.duranensis（PI262133）和A.duranensis（PI219823）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用改良過(guò)的CTAB法[27]提取高質(zhì)量花生基因組DNA。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR擴(kuò)增 Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR擴(kuò)增采用前人設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，上下游引物序列分別為：Gyrt1，5′-AGMGRTATGTGYGTSGAYTAT-3′;Gyrt2，5′-CAMCCMRAAMWCACAMTT-3′。其中，R=A/G，Y=C/T，M=A/C，S=C/G，W=A/T，N=A/T/C/G[27]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序以及PCR產(chǎn)物的分離檢測(cè)參考文獻(xiàn)[26]。

1.2.3 目的條帶的克隆和測(cè)序 具體操作參考文獻(xiàn)[26]。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄酶序列分析 序列相似性檢索、序列統(tǒng)計(jì)分析、序列圖及Logo圖生成、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)統(tǒng)計(jì)、保守基序預(yù)測(cè)等參考文獻(xiàn)[26]。運(yùn)用MEGA 6.0軟件的鄰接法（No. of differences模型）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展值設(shè)置為1 000。與花生EST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定具有轉(zhuǎn)錄活性的Ty3-gypsy類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。B5F2FA2E-8CD4-41A0-93B1-4A7CB397A425

2 結(jié)果與分析

2.1 逆轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

對(duì)2份AA染色體組野生種花生材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，2份材料均擴(kuò)增出了1條約430 bp大小的目的條帶。對(duì)目的條帶進(jìn)行回收、克隆和測(cè)序，從A.duranensis（PI262133）和A.duranensis（PI219823）中均獲得了34條序列。去除重復(fù)序列和非目標(biāo)序列后，分別從A.duranensis（PI262133）和A.duranensis（PI219823）中獲得了32、33條逆轉(zhuǎn)錄酶序列（分別命名為AdRT3-X和AdRT4-X），對(duì)65條序列進(jìn)行多重比對(duì)分析并生成序列l(wèi)ogo（圖2、圖3）。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄酶序列分析

所有序列長(zhǎng)度都在397～440 bp之間。在A.duranensis（PI262133）的32條序列中，AdRT3-23的序列長(zhǎng)度最短，為397 bp，AdRT3-27的序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為440 bp，有26條序列的長(zhǎng)度均為432 bp，占所克隆序列的81.25%（表1）;A、T、C、G數(shù)量變化范圍分別為109～140、107～153、56～86、71～114個(gè)，A+T所占比例范圍為56.48%～65.97%，A+T與G+C比例為1.3～1.94（表1）;核苷酸序列間相似性范圍為63.7%～99.3%，其中AdRT3-15與AdRT3-24以及AdRT3-20與AdRT3-30之間的相似性最高，達(dá)99.3%，AdRT3-12 與AdRT3-14之間的相似性最低，為63.7%;氨基酸序列間相似性范圍為10.9%～99.3%（表2）。在A.duranensis（PI219823）的33條序列中，AdRT4-27的序列長(zhǎng)度最短，為428 bp，AdRT4-28的序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為440 bp，有27條序列的長(zhǎng)度均為432 bp，占所克隆序列的81.82%（1）;A、T、C、G數(shù)量變化范圍分別為117～139、108～157、51～85、77～114個(gè)，A+T所占比例范圍為56.48%～68.14%，（A+T）/（G+C）為1.3～2.13（表1）;核苷酸序列間相似性范圍為62.8%～99.3%，其中，AdRT4-5與AdRT4-28之間的相似性最高，達(dá)99.3%，AdRT4-1 與AdRT4-23之間的相似性最低，為62.8%，氨基酸序列間相似性范圍為31.5%～99.3%（表2）;將2份花生材料的65條序列合并進(jìn)行分析，核苷酸序列間相似性范圍為62.6%～97.9%，氨基酸序列間相似性范圍為12.4%～98.6%。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列聚類(lèi)分析

遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖4）顯示，65條序列被劃分為9個(gè)家族。家族Ⅰ包含20條序列，占總序列數(shù)的30.80%，該家族只有2條序列來(lái)自A.duranensis（PI262133）;家族Ⅱ包含7條序列，只有1條來(lái)自A.duranensis（PI219823）;家族Ⅲ和家族Ⅳ均只包含1條來(lái)自A.duranensis（PI262133）的序列，這2條序列與家族Ⅰ親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而單獨(dú)聚為一類(lèi);家族Ⅴ包含7條序列，有1條來(lái)自A.duranensis（PI219823）;家族Ⅵ包含9條序列，有2條來(lái)自A.duranensis（PI262133）;家族Ⅶ包含7條來(lái)自A.duranensis（PI262133）和1條來(lái)自A.duranensis（PI219823）的序列;家族Ⅷ包含5條序列;家族Ⅸ包含7條序列;除家族Ⅲ和家族Ⅳ外，其他每個(gè)家族中都存在來(lái)自這2份野生種花生材料的序列。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列分析

65條序列中有26條存在無(wú)義突變，其中有12條序列來(lái)自A.duranensis（PI262133），占該材料序列總數(shù)的37.5%，有14條序列來(lái)自A.duranensis（PI219823），占該材料序列總數(shù)的42.42%（圖5）。無(wú)義突變?cè)?份野生種花生材料序列中的具體表現(xiàn)為AdRT3-7突變數(shù)最多，存在14個(gè)，分別在第36、第38、第49、第51、第63、第76、第87、第95、第103、第109、第113、第128、第136、第138個(gè)氨基酸處;AdRT4-23存在12個(gè)無(wú)義突變，分別在第32、第59、第72、第77、第87、第88、第96、第100、第108、第121、第128、第138個(gè)氨基酸處;AdRT3-3存在9個(gè)無(wú)義突變，分別在第30、第77、第78、第88、第100、第104、第108、第121、第128個(gè)氨基酸處;AdRT4-27存在9個(gè)無(wú)義突變，分別在第32、第38、第42、第99、第103、第113、第120、第122、第127個(gè)氨基酸處;AdRT4-11存在8個(gè)無(wú)義突變，分別在第8、第77、第88、第101、第104、第108、第121、第128個(gè)氨基酸處;AdRT4-30存在8個(gè)無(wú)義突變，分別在第8、第77、第88、第101、第104、第108、第121、第128個(gè)氨基酸處;AdRT3-26存在7個(gè)無(wú)義突變，分別在第第52、第54、第80、第91、第111、第124、第131個(gè)氨基酸處;AdRT3-33存在5個(gè)無(wú)義突變，分別在第96、第101、第104、第121、第128個(gè)氨基酸處;AdRT3-23存在4個(gè)無(wú)義突變，分別在第86、第93、第102、第127個(gè)氨基酸處;AdRT3-6存在4個(gè)無(wú)義突變，分別在第98、第105、第114、第139個(gè)氨基酸處;AdRT4-5（第106、第112、第136個(gè)氨基酸處）、AdRT4-17（第62、第105、第106個(gè)氨基酸處）和AdRT4-28（第106、第112、第136個(gè)氨基酸處）各存在3個(gè)無(wú)義突變;AdRT3-14（第9、第115個(gè)氨基酸處）和AdRT4-14（第32、第129個(gè)氨基酸處）各存在2個(gè)無(wú)義突變;AdRT3-11（第48個(gè)氨基酸處）、AdRT3-13（第43個(gè)氨基酸處）、AdRT3-17（第130個(gè)氨基酸處）、AdRT3-21（第32個(gè)氨基酸處）、AdRT3-32（第30個(gè)氨基酸處）、AdRT4-12（第131個(gè)氨基酸處）、AdRT4-15（第30個(gè)氨基酸處）、AdRT4-16（第48個(gè)氨基酸處）、AdRT4-18（第9個(gè)氨基酸處）、AdRT4-29（第43個(gè)氨基酸處）、AdRT4-36（第45個(gè)氨基酸處）各存在1個(gè)無(wú)義突變;部分序列存在連續(xù)無(wú)義突變的現(xiàn)象。無(wú)義突變導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)座子失去轉(zhuǎn)錄活性。B5F2FA2E-8CD4-41A0-93B1-4A7CB397A425

2.5 逆轉(zhuǎn)錄酶的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

翻譯成氨基酸后，根據(jù)核苷酸聚類(lèi)結(jié)果，選擇2份AA染色體組野生種花生材料中每個(gè)家族中的代表序列各1條，家族Ⅲ和家族Ⅳ均只包含1條序列，其選擇均來(lái)自A.duranensis（PI262133）。利用在線軟件Phyre2預(yù)測(cè)AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，代表序列蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)匹配覆蓋度最高的模板為c2opqA、c5dmqA、d2zd1b1和c3kk1B，置信度均為100，都屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族。二級(jí)結(jié)構(gòu)包含4～6個(gè)α-螺旋和6～9個(gè)β-折疊;三級(jí)結(jié)構(gòu)包含 14～19個(gè)轉(zhuǎn)角、70～96個(gè)氫鍵，還存在6個(gè)明顯的螺旋結(jié)構(gòu)和7個(gè)明顯的折疊結(jié)構(gòu)（表3）。其中，家族Ⅰ代表序列AdRT3-10和AdRT4-18，其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。

2.6 逆轉(zhuǎn)錄酶保守基序預(yù)測(cè)

65條序列共存在10種保守基序（圖7），其中有57條序列包含motif 1，占序列總數(shù)的87.69%;除AdRT3-26外，剩余的64條序列均包含motif 2，占序列總數(shù)的98.46%;52條序列包含motif 3，占序列總數(shù)的80%;62條序列包含motif 4，占序列總數(shù)的95.38%;4條序列包含motif 5，5條序列包含motif 6，4條序列包含motif 7，3條序列包含motif 8，7條序列包含motif 9，3條序列包含motif 10。AdRT3-26序列存在7個(gè)終止密碼子突變，只包含motif 5和motif 9，該序列上游部分無(wú)保守基序且與其他序列差異較大，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中與其他序列遺傳距離最遠(yuǎn)，單獨(dú)歸為一類(lèi);AdRT3-3、AdRT4-11和AdRT4-30同時(shí)包含motif 5和motif 7，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中為同一類(lèi);AdRT3-6、AdRT3-7、AdRT3-23同時(shí)包含motif 6和motif 8，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中為同一類(lèi)。

2.7 逆轉(zhuǎn)錄酶序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已登錄的來(lái)源于其他物種植物的Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列（表4），與本研究中克隆所獲得的65條逆轉(zhuǎn)錄酶序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析物種以及序列之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖8）。進(jìn)化樹(shù)顯示，所有逆轉(zhuǎn)錄酶序列可分為13類(lèi)。A類(lèi)和B類(lèi)中包含大部分AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，不包含來(lái)自其他物種植物的逆轉(zhuǎn)錄酶序列;C類(lèi)只有AdRT3-17，D類(lèi)也只有AdRT4-7。E類(lèi)包含5條來(lái)自A.duranensis（PI262133）和1條來(lái)自A.duranensis（PI219823）的逆轉(zhuǎn)錄酶序列，其與來(lái)自綠豆（Vigna radiata，AAT85841.1）、黃瓜（Cucumis sativus，ADD83121.1）、山桑（Morus bombycis，BAB40830.1）、落葉松（Larix gmelinii，BAQ22332.1）、牡丹（Paeonia suffruticosa，AFQ94056.1）、火龍果（Hylocereus undatus，AOS58468.1）、李子（Prunus salicina，AGX45501.1）、油棕（Elaeis guineensis，CAD45567.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，BAB40828.1）、棗（Ziziphus jujuba，AFR43612.1）、白皮松（Phelipanche bungeana，ABD43118.1）、多花黑麥草（Lolium multiflorum，BAB40827.1）、荸薺（Eleocharis uniglumis，ADF46121.1）、蘋(píng)果（Malus domestica，ABS11067.1）和銀杏（Ginkgo biloba，CAA12930.1）等15個(gè)物種植物的逆轉(zhuǎn)錄酶序列之間具有較高的相似性，親緣關(guān)系較近。Ⅰ類(lèi)包含來(lái)自大豆和菠菜的2條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，除Ⅰ類(lèi)外，F(xiàn)類(lèi)～M類(lèi)中均是來(lái)自2份AA染色體組野生種花生的逆轉(zhuǎn)錄酶序列。

2.8 逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性分析

將65條AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列提交到NCBI與花生EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)， 以檢測(cè)AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示，當(dāng)查詢覆蓋度都為97%時(shí)，AdRT3-7、AdRT3-13、AdRT3-36與花生EST數(shù)據(jù)庫(kù)中GO261148.1之間的一致性分別為85.48%、86.26%、85.99%;當(dāng)查詢覆蓋度分別為96%和93%時(shí)，AdRT4-7、AdRT4-28與花生EST數(shù)據(jù)庫(kù)中GO266033.1之間的一致性分別為88.22%和85.68%（表5）。說(shuō)明GO261148.1和GO266033.1這2條序列為AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的部分轉(zhuǎn)錄序列。

3 討論與結(jié)論

本研究首次PCR擴(kuò)增AA染色體組野生種花生中Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，結(jié)果從2份AA染色體組野生種花生材料中均擴(kuò)增出大小約430 bp的目的條帶，這與前人的研究結(jié)果[28-33]一致，最終也從2份AA染色體組野生種花生材料中分別獲得了32、33條逆轉(zhuǎn)錄酶序列。以上說(shuō)明 Ty3-gypsy 類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子廣泛存在于本研究AA染色體組野生種花生材料基因組中，當(dāng)然也證實(shí)了采用簡(jiǎn)并引物從本研究AA染色體組野生種花生材料中擴(kuò)增和克隆Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的策略是行之有效的[28]。

所有逆轉(zhuǎn)錄酶序列長(zhǎng)度在397～440 bp之間，存在缺失或插入突變;2份AA染色體組野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列的A+T所占比例范圍分別為56.48%～65.97%和56.48%～68.14%，（A+T）/（G+C）分別為1.3～1.94和1.3～2.13，均富含 A+T 堿基，A/T堿基含量的增加使序列呈現(xiàn)較高異質(zhì)性;2份AA染色體組野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列間相似性范圍分別為63.7%～99.3%和62.8%～99.3%，呈現(xiàn)較低異質(zhì)性;翻譯后65條逆轉(zhuǎn)錄酶序列中有26條發(fā)生了無(wú)義突變，其中有12條來(lái)自A.duranensis（PI262133），有14條來(lái)自A.duranensis（PI219823），2份材料的無(wú)義突變發(fā)生率相當(dāng)，無(wú)義突變導(dǎo)致產(chǎn)生較高的異質(zhì)性，無(wú)義突變也會(huì)使基因功能發(fā)生改變或喪失;2份AA染色體組野生種花生所有逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列間相似性范圍分別為10.9%～99.3%和31.5%～99.3%，呈現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，相比核苷酸序列，氨基酸序列表現(xiàn)出更高的異質(zhì)性。B5F2FA2E-8CD4-41A0-93B1-4A7CB397A425

9個(gè)家族所選代表序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)總體類(lèi)似，但也在螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)、折疊結(jié)構(gòu)數(shù)、轉(zhuǎn)角數(shù)、氫鍵數(shù)、α-螺旋數(shù)、β-折疊數(shù)上存在著差別，如家族Ⅵ中AdRT4-5和Ⅸ中AdRT4-23的α-螺旋數(shù)、β- 折疊數(shù)和氫鍵數(shù)少于其他代表序列，這些差異可能會(huì)影響AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄活性、轉(zhuǎn)座效率及拷貝數(shù)，也是AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子存在較高異質(zhì)性和多態(tài)性的體現(xiàn)。AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的主要保守基序是4種保守基序（motif 1～motif 4），motif 5～motif 10這6種保守基序在所克隆序列中出現(xiàn)的頻率較低，可能是這些序列在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了突變，各序列間保守基序的差異反映了AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列具有較高異質(zhì)性和多態(tài)性。

根據(jù)聚類(lèi)分析，所有逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列被劃分為9個(gè)家族，其中構(gòu)成AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子的主要成分是家族Ⅰ，表明AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列具有較高的保守性與相似性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，E類(lèi)中的5條AA染色體組野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列與綠豆、黃瓜、山桑、落葉松、牡丹、火龍果、李子、油棕、擬南芥、棗、白皮松、多花黑麥草、荸薺、蘋(píng)果和銀杏的逆轉(zhuǎn)錄酶序列之間具有較高的相似性，親緣關(guān)系較近，表明這些逆轉(zhuǎn)錄酶序列在進(jìn)化過(guò)程中有可能發(fā)生了橫向傳遞。A類(lèi)和B類(lèi)中包含大部分AA染色體組野生種花生Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，不包含來(lái)自其他物種植物的逆轉(zhuǎn)錄酶序列，C類(lèi)只有AdRT3-17，D類(lèi)也只有AdRT4-7，這4類(lèi)可能較為特異，有可能只存在于AA染色體組野生種花生中。F類(lèi)～M類(lèi)中的逆轉(zhuǎn)錄酶序列均來(lái)自AA染色體組野生種花生，這些逆轉(zhuǎn)錄酶序列不僅與其他物種植物的同源序列遺傳距離較遠(yuǎn)，也與本研究中AA染色體組野生種花生材料的逆轉(zhuǎn)錄酶序列遺傳距離較遠(yuǎn)，表明這些逆轉(zhuǎn)錄酶序列在起源和進(jìn)化上可能較為古老，特異性比較強(qiáng)，有可能是本研究AA染色體組野生種花生材料所特有。

通過(guò)比對(duì)花生EST數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)3條來(lái)自A.duranensis（PI262133）的逆轉(zhuǎn)錄酶序列與GO261148.1一致性高，發(fā)現(xiàn)2條來(lái)自A.duranensis（PI219823）的逆轉(zhuǎn)錄酶序列與GO266033.1一致性高，表明AA染色體組野生種花生材料中存在可轉(zhuǎn)錄的Ty3-gypsy類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子。結(jié)合核苷酸序列的聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)這2種來(lái)源的序列分別屬于家族Ⅴ和家族Ⅵ。

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