楊波 姜彩鴿 宋雙 張華普 張怡

摘要：為篩選對寧夏葡萄霜霉病防治有效、環(huán)境友好型的藥劑以及明確施藥后葡萄果面微生物群落的結(jié)構(gòu)，采用田間藥效試驗(yàn)和Illumina高通量測序的方法，比較7種藥劑對葡萄霜霉病的田間防效及施藥后葡萄果面真菌和細(xì)菌群落組成、結(jié)構(gòu)以及多樣性。結(jié)果表明，7種藥劑中47%春雷王銅對葡萄霜霉病的防治效果最好，在調(diào)查的3個時間段中，防效均在82.17%～91.56%之間，其次防效較好的是生物源農(nóng)藥0.3%苦參堿，防效均在80%以上。不同藥劑處理后葡萄果面微生物的優(yōu)勢屬種主要有枝孢屬、鏈格孢屬、線黑粉酵母屬、馬賽菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等，但各處理間微生物的豐富度、多樣性、均勻度、結(jié)構(gòu)相似性存在明顯差異，微生物物種多樣性較高、分布均勻的組分別為EU組和PO組，而微生物豐度較高的組分別為PO組和BS組;基于加權(quán)UniFrac距離矩陣的主坐標(biāo)分析（PCoA）發(fā)現(xiàn)PO組、PF組和MA組之間真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，而細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相似的組分別為KC組、EU組和CK組。通過對不同藥劑的田間防效及施藥后葡萄果面微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的初步研究，對微生物群落結(jié)構(gòu)、種類和多樣性有了一定的了解，為防治寧夏葡萄霜霉病提供了理論依據(jù)，及揭示施藥后葡萄果面微生物多樣性，提高葡萄酒品質(zhì)提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：葡萄;葡萄霜霉病;藥劑篩選;微生物多樣性;主坐標(biāo)分析

中圖分類號：S436.631.1+9 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0103-08

葡萄霜霉病 （grape downy mildew）是由葡萄生單軸霜霉（Plasmopara viticola）引起的一種世界性專性寄生病害，各葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重危害葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]，制約著葡萄產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展。寧夏回族自治區(qū)（簡稱寧夏）因獨(dú)特的地理位置及適宜葡萄生長的氣候特點(diǎn)，被公認(rèn)為是我國釀酒葡萄的最佳產(chǎn)地[3]。隨著寧夏葡萄酒產(chǎn)業(yè)的欣欣發(fā)展，葡萄種植面積也在逐年增加，葡萄霜霉病作為寧夏葡萄產(chǎn)區(qū)最主要的病害，嚴(yán)重影響著葡萄種植業(yè)和葡萄酒釀造業(yè)[4]。目前，在葡萄霜霉病的防治中，藥劑防治是最直接有效的防治方法，但隨著化學(xué)藥劑“3R”問題的日趨嚴(yán)重，化學(xué)藥劑對環(huán)境破壞等問題凸顯，化學(xué)農(nóng)藥造成的食品安全事件、農(nóng)藥殘留超標(biāo)事件時有發(fā)生，已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、不能保證葡萄生產(chǎn)的正常進(jìn)行，新型高效環(huán)保的殺菌劑及合理安全的用藥技術(shù)在葡萄生產(chǎn)中迫切需求。

葡萄霜霉病的生物防治近些年成為研究的熱點(diǎn)之一，已開發(fā)與篩選出一些對葡萄霜霉病有效的生物藥劑[5]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）是國內(nèi)外開發(fā)微生物源農(nóng)藥的重要資源，因其低毒、低污染的特點(diǎn)，在生物防治中得到廣泛研究和應(yīng)用[6-7]，是目前較為理想的微生物農(nóng)藥，研究較多的是枯草芽孢桿菌。陳浩等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B-FS01在室內(nèi)和田間，對葡萄霜霉病均具有優(yōu)良的防效[8]。岳憲化等報道，哈茨木霉菌可濕性粉劑對葡萄霜霉病具有較好的防效[9]。臧超群等分離的細(xì)菌菌株SY286對葡萄霜霉病有較好的防治效果，有望在葡萄霜霉病的生物防治中發(fā)揮更大作用[10]。但對寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)來說，防治霜霉病的藥劑仍相對單一，且化學(xué)藥劑居多，生物藥劑防治葡萄霜霉病研究明顯不足，是制約該地區(qū)葡萄產(chǎn)業(yè)綠色、健康、高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。

寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)多為釀酒葡萄，種植面積達(dá)到3.28萬hm2，是全國最大的釀酒葡萄集中連片種植區(qū)，年產(chǎn)葡萄酒1.3億瓶，出口20多個國家和地區(qū)，綜合產(chǎn)值達(dá)到了261億元。據(jù)報道，釀酒葡萄漿果表面微生物包括絲狀真菌、酵母菌、細(xì)菌，優(yōu)勢菌群酵母菌、乳酸菌和醋酸菌是葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)鍵菌群[11-12]。但由于種植模式、葡萄品種、殺菌劑、溫濕度等的顯著差異，導(dǎo)致微生物（尤其土著菌群）種類和數(shù)量有明顯差異[13]。近年來，國外相關(guān)學(xué)者在天然土著菌群對葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)影響方面做了大量的研究工作，相關(guān)研究成果充分表征了土著菌群在釀酒過程中起到的關(guān)鍵作用及對香氣物質(zhì)富集與酒品整體風(fēng)味呈現(xiàn)的影響力[14]。殺菌劑作為影響葡萄果面微生物群落的關(guān)鍵因子，Cˇade等研究表明，殺菌劑的使用使釀酒葡萄在成熟過程中土著菌群種類和群體數(shù)量大幅減少，不使用殺菌劑的釀酒葡萄表面優(yōu)勢菌群為假絲酵母屬（Candida）、德巴利（氏）酵母（Debaryomyces）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）[15]。因此，掌握和了解施用生物殺菌劑后葡萄果面微生物的多樣性，對葡萄霜霉病的防治以及葡萄酒的品質(zhì)都具有重要意義。

本研究通過田間藥效試驗(yàn)，比較7種生物源殺菌劑對葡萄霜霉病的田間防治效果，以期為寧夏地區(qū)防治葡萄霜霉病篩選出防效較好的生物殺菌劑，解決化學(xué)藥劑污染等問題。以及分析施用不同生物菌劑后葡萄果面真菌、細(xì)菌的群落組成、結(jié)構(gòu)以及多樣性，旨在為研究使用不同殺菌劑防治葡萄霜霉病對釀酒品質(zhì)的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)共選擇6種植物源、微生物源農(nóng)藥及1種環(huán)境友好型高效肥料為試驗(yàn)研究對象，藥劑分別為1 000億個孢子/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，山東省乳山韓威生物科技有限公司生產(chǎn);5%多抗霉素水劑，山東省乳山韓威生物科技有限公司生產(chǎn);0.3%苦參堿水劑，北京三浦百草綠色植物制劑有限公司生產(chǎn);47%春雷王銅可濕性粉劑，山東省乳山韓威生物科技有限公司生產(chǎn);0.3%丁子香酚可溶液劑，南通神雨綠色藥業(yè)有限公司生產(chǎn);3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑，美國拜沃生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);亞磷酸鉀，寧夏榮和綠色科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間藥效試驗(yàn) 試驗(yàn)于2020年7月進(jìn)行，試驗(yàn)地點(diǎn)位于寧夏回族自治區(qū)寧夏農(nóng)墾玉泉營農(nóng)場葡萄園內(nèi)，該地為霜霉病常年發(fā)病區(qū)，風(fēng)沙土壤，在病害發(fā)病前期進(jìn)行藥劑防治試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計及調(diào)查方法 試驗(yàn)設(shè)8個處理，分別為1 000億個孢子/g枯草芽孢桿菌（BS）、5%多抗霉素（PD）、0.3%苦參堿（MA）、47%春雷王銅（KC）、0.3%丁子香酚（EU）、3億CFU/g哈茨木霉（TR）、亞磷酸鉀（PF）處理，以清水作對照（CK）。每個處理30棵葡萄樹，每10棵樹為1個小區(qū)，每個處理重復(fù)3次，共24個小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列。

于葡萄霜霉病發(fā)病前第1次施藥，施藥方式為噴霧，用電動噴霧器分別將7種藥劑及清水均勻噴施到葡萄葉片的正反面，以藥液不下淌為止，施藥前進(jìn)行葡萄霜霉病病害等級調(diào)查，后期再噴施2次，每隔7 d噴1次，共噴3次。第3次藥后14、21、28 d進(jìn)行調(diào)查，每株樹調(diào)查10張葉片，采用9 級分級法調(diào)查發(fā)病情況，葡萄霜霉病葉片分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，無病斑;1級，病斑面積占整個葉片面積的5%及以下;3級，病斑面積占整個葉片面積的6%～25%;5級，病斑面積占整個葉片面積的26%～50%;7級，病斑面積占整個葉片面積的51%～75%;9級，病斑面積占整個葉片面積的76%及以上。計算病情指數(shù)，求出防效，并對各小區(qū)的防效進(jìn)行方差分析，用最小顯著極差法（LSR法）進(jìn)行多重比較。公式[16]如下。

病情指數(shù)=∑（各級發(fā)病葉片數(shù)×相應(yīng)發(fā)病級數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×9）×100;

防治效果=[1-（噴藥前空白區(qū)病情指數(shù)×噴藥后處理區(qū)病情指數(shù)）/（噴藥后空白區(qū)病情指數(shù)×噴藥前處理區(qū)病情指數(shù)）]× 100%。

1.2.3 樣品采集及處理 葡萄果實(shí)采收前采集各處理小區(qū)葡萄2～3串，進(jìn)行保鮮處理后送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16S 擴(kuò)增子測序，送樣編號如表1所示。

1.2.4 基因組DNA的提取 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取總基因組DNA。DNA在1%瓊脂糖凝膠上檢測其濃度和純度。根據(jù)濃度，使用無菌水將DNA稀釋至 1 ng/μL。

1.2.5 細(xì)菌16Sr RNA、真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）區(qū)域的擴(kuò)增測序 取適量的樣本 DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至 1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域18S V3-V4 選擇特異引物 341F （5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）與806R （5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′），真菌ITS1區(qū)域采用真菌特異引物ITS 1F（5′-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3′）和ITS 2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增 。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)30個循環(huán);72 ℃延伸 5 min。-20 ℃保存。

PCR產(chǎn)物使用 2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測后使用 GeneJET 試劑盒純化回收目標(biāo)條帶。使用TruSeqDNA PCR免費(fèi)樣品制備試劑盒生成測序文庫。使用TruSeq TM DNA Sample Prep Kit（Illumina，CA，USA）構(gòu)建PE文庫，使用Illumina Nova Seq進(jìn)行上機(jī)測序，測序長度為250 bp。測序工作由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.6 測序數(shù)據(jù)處理 根據(jù)雙末端測序序列（PE reads）之間的重疊（Overlap）關(guān)系，將測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列（Tags），同時對reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。利用軟件Flash v1.2.7通過 Overlap對每個樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）;使用 Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù) （Clean Tags）;使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，最終得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。

1.2.7 多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析 默認(rèn)以 97%的一致性對Clean Reads進(jìn)行操作分類單元（OTUs）聚類，然后通過與數(shù)據(jù)庫 Silva132（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。分析微生物群落結(jié)構(gòu)差異并繪制差異 OTU韋恩圖、非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類樹及屬水平上物種相對豐度柱形圖。α多樣性指數(shù)采用Qiime軟件進(jìn)行計算，包括OTU指數(shù)、 Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和ACE指數(shù)。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落的豐富度，而Shannon指和Simpson指數(shù)數(shù)則綜合考慮群落的豐富度和均勻度。多樣品比較分析主坐標(biāo)分析（PCoA）圖以及聚類分析的群落組成熱圖采用R軟件（v2.15.3）進(jìn)行繪制，PCoA基于由樣本組成計算得到的距離矩陣進(jìn)行特征向量降維排序，從均一化的 OTU矩陣中計算加權(quán)和未加權(quán)的UniFrac距離矩陣，其中加權(quán)考慮物種的豐度，未加權(quán)則沒有對物種豐度進(jìn)行加權(quán)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間藥效試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，不同藥劑對葡萄霜霉病的田間防效存在明顯差異。在3次藥后14 d時，各處理防效之間均無明顯差異，但47%春雷王銅的防效最高，為82.17%，其次是防效為81.32%的0.3%苦參堿，而3億CFU/g哈茨木霉的防效最低，為58.39%;從藥后21 d來看，各處理間存在顯著的差異性，47%春雷王銅的防效最高，為91.56%，明顯高于其余6種藥劑的防效，0.3%苦參堿的防效次之，為87.60%，3億CFU/g哈茨木霉的防效最低，僅為39.06%，防治效果明顯低于其他幾種藥劑;從藥后28 d的防治效果看，47%春雷王銅的防治效果仍然是最高的，為89.33%，0.3%苦參堿次之，防效為83.83%，高于其他5種藥劑的防效，3億CFU/g哈茨木霉的防效依然是7種藥劑中防效最低的，為63.33%，顯著低于其他6種藥劑的防效。

綜合比較7種藥劑對葡萄霜霉病的防治效果可以看出，47%春雷王銅和0.3%苦參堿對葡萄霜霉病具有良好的防治效果，在調(diào)查的3個時間段中，防治效果在81.32%～91.56%之間，可在實(shí)際生產(chǎn)中合理使用上述殺菌劑防治葡萄霜霉病。

2.2 不同藥劑處理對果面微生物群落的影響

2.2.1 不同藥劑處理對葡萄果面微生物群落結(jié)構(gòu)

組成分析 為分析不同生物藥劑處理下果面微生物的群落結(jié)構(gòu)，研究不同處理間的相似性，本研究通過對樣本以Binary Jaccard 距離矩陣進(jìn)行UPGMA等級聚類，構(gòu)建了8個樣本的聚類樹，并且根據(jù)聚類得到的OTU分析不同樣本間共有及特有的OTU，繪制成韋恩圖，如圖1和圖2所示。根據(jù)圖1-A可以看出，真菌中共有OTU為56個，8種藥劑處理下的果面真菌的OTU存在明顯差異，其中PF組特有42個差異OTU，BS組特有40個差異OTU，MA組的特有OTU最少，為13個;從圖2-A可以看出，細(xì)菌中共有OTU為140個，不同處理果面細(xì)菌共有OTU明顯多于真菌，其中PO組特有69個差異OTU，是8個處理中差異OTU最多的，BS組特有66個差異OTU，差異OTU最少的組為CK，有33個。

選取不同藥劑處理下各樣品組在屬分類水平上相對豐富度排名前10的物種繪制物種相對豐度柱形圖，以便查看各樣品組中相對豐度較高的優(yōu)勢物種及其所占比例（圖3）。從圖3-A排名前10（Top10）的真菌屬中可以看出，BS樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）等;PO和MA樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、短柄霉屬（Aureobasidium）等;KC樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）等;EU樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、（Vishniacozyma）等;TR樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、短柄霉屬（Aureobasidium）等;PF樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、鏈格孢屬（Alternaria）、孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）等;CK樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、短柄霉屬（Aureobasidium）等。綜合各處理樣品組可以看出，葡萄果面真菌中枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高。

從圖3-B排名前10的細(xì)菌屬中可以看出，BS樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等;PO樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等;MA樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、弧形菌屬（Vibrio）等;KC樣品組優(yōu)勢菌屬有鏈球菌屬（Streptococcus）、弧形菌屬（Vibrio）、短桿菌屬（Curtobacterium）等;EU樣品組優(yōu)勢菌屬有弧形菌屬（Vibrio）、鏈球菌屬（Streptococcus）、馬賽菌屬（Massilia）等;TR樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等;PF樣品組優(yōu)勢菌屬有鏈球菌屬（Streptococcus）、弧形菌屬（Vibrio）、馬賽菌屬（Massilia）等;CK樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）等。綜合各處理樣品組可以看出，葡萄果面細(xì)菌中除了2個未鑒定出的屬外，在其余8個屬中，馬賽菌屬（Massilia）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高。

2.2.2 不同藥劑處理對葡萄果面微生物多樣性分析 α多樣性主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)量，因此也被稱為生境內(nèi)的多樣性。而OTU數(shù)量、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和ACE指數(shù)均是Alpha多樣性指數(shù)，以表征樣品中物種分布的豐富度、多樣性和均勻度，并且可以直觀展示測序深度和數(shù)據(jù)量情況。從表3可以看出，不同處理中真菌群落和細(xì)菌群落的OTU數(shù)量存在明顯差異，而各處理中細(xì)菌群落的OTU數(shù)量明顯高于真菌的OTU數(shù)量。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)越高，表明群落的多樣性越高，物種分布越均勻。從真菌群落看，樣品EU組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均最高，分別為2.86和0.81，說明樣品EU組果面真菌多樣性較高，物種分布較均勻;Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最大的為樣品PO組，分別為162.86和172.88，其次是樣品BS組的153.34和139.97，說明樣品PO組和BS組真菌群落的豐度較高。從細(xì)菌群落看，樣品PO組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均最高，分別為2.26和0.59，其次是樣品MA組，分別為1.88和0.57，說明樣品PO組和MA組果面細(xì)菌多樣性較高，物種分布均勻;樣品BS組的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均最大，分別為461.29和478.19，其次是樣品PO組的454.48和464.09，說明這2個樣品組果面中細(xì)菌群落的豐度較高。本試驗(yàn)中，樣本測序深度值均在95%以上，說明測序覆蓋率較高，測序深度良好，測序結(jié)果合理可靠。

2.2.3 不同藥劑處理對葡萄果面微生物群落結(jié)構(gòu)相似性分析 基于加權(quán)UniFrac 距離的 PCoA 分析了不同藥劑處理后微生物群落結(jié)構(gòu)相似性。真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4-A）顯示，PC1 和 PC2 解釋率分別為 61.84% 和9.39%，BS、CK、EU分布于第一、第二、第四象限，三者距離較遠(yuǎn)，而PO、PF、MA在中心位置，說明 BS、EU和CK之間真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，而PO、PF、MA之間真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4-B）顯示，PC1 和 PC2 解釋率分別為54.72%和17.66%，BS和TR均分布于第一象限，說明BS和TR之間細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相似，KC、EU和CK則分布于第四象限，說明這3組之間細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相似，而PO分布于第二象限，MA分布于第三象限，與其他幾組距離較遠(yuǎn)，結(jié)構(gòu)差異較大。

3 結(jié)論與討論

葡萄霜霉病主要危害葡萄葉片，但對新梢、葉柄、花序、穗軸、果柄和果實(shí)等幼嫩組織也會造成危害[17]。葡萄種植業(yè)中霜霉病的防治主要采用化學(xué)防治措施，常用的化學(xué)藥劑包括氨苯甲基酰胺類[18]、氨基甲酸酯類、嗎啉類[19]、甲氧基丙烯酸酯類等藥劑[20-21]，但由于近些年化學(xué)藥劑的單一、盲目使用，導(dǎo)致葡萄霜霉病病菌對大多數(shù)的藥劑都出現(xiàn)了不同程度的抗藥性，防治效果顯著降低，而化學(xué)藥劑的過量、頻繁使用，又導(dǎo)致了葡萄農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等一系列安全和環(huán)保問題。近些年，隨著人們生活水平的不斷提高，對健康綠色食品的要求也越來越高，加之國家大力支持和鼓勵植物病害的防治要朝綠色環(huán)保方向發(fā)展，因此，篩選對環(huán)境友好、安全、高效的生物殺菌劑對防治葡萄霜霉病，提高葡萄品質(zhì)具有重要的意義。

因生物防治具有高效、環(huán)保、安全、無副作用等優(yōu)點(diǎn)，是植物病害防治的發(fā)展趨勢。植物內(nèi)生真菌、細(xì)菌、芽孢桿菌、木霉菌都是生物防治的研究熱點(diǎn)，吉沐祥等研究發(fā)現(xiàn)黃麻鏈霉菌NF0919 菌株和枯草芽孢桿菌 DJ-6 WP 對葡萄霜霉病具有一定防效，認(rèn)為這2株菌株具備一定的生防潛力與開發(fā)的價值[22];康興嬌等研究發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌T3對葡萄霜霉病病菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，并具有較好的防治效果[23];曹輝等在葡萄霜霉病生物防治試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉菌可濕性粉劑對葡萄霜霉病的防效較好，且適宜使用濃度為300倍液[24]。本研究中也對3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑的田間防效進(jìn)行了研究，但其防治效果較差。包巖在4種藥劑對葡萄霜霉病的防治效果試驗(yàn)中認(rèn)為，0.3%丁子香酚可溶性液劑對葡萄霜霉病具有顯著的防效，防效達(dá)到83.8%[25]，而本研究中0.3%丁子香酚可溶性液劑對葡萄霜霉病的防效最高為72.36%，防效一般，導(dǎo)致防治效果存在差異可能是由于不同的地理環(huán)境、氣候等因素造成的;曹依靜等在研究1%苦參堿水乳劑防治葡萄霜霉病試驗(yàn)中表明，該生物藥劑可有效防治葡萄霜霉病的發(fā)生，防效達(dá)90%以上，防效明顯高于常規(guī)殺菌劑 70%丙森鋅和80%代森錳鋅[26]，本研究結(jié)果與之一致，在本研究中0.3%苦參堿水劑對葡萄霜霉病的防效僅次于47%春雷王銅。春雷王銅屬于復(fù)合型低毒殺菌劑，具有保護(hù)和治療雙重作用，被廣泛用于防治各種由真菌、細(xì)菌引起的病害，如核桃細(xì)菌性黑斑病[27]、黃瓜靶斑病[28]、生姜青枯病[29]等，針對不同作物不同病害其防治效果也存在顯著差異，本研究中47%春雷王銅防治葡萄霜霉病防效最好，防效在82.17%～91.56%之間，明顯優(yōu)于其他生物藥劑，說明47%春雷王銅可作為防治寧夏葡萄霜霉病的低毒、環(huán)保型藥劑使用。

微生物群落對葡萄酒的風(fēng)味及品質(zhì)都有很大影響，其中酵母菌又是葡萄酒釀造的關(guān)鍵因素，直接決定了葡萄酒的風(fēng)味及感官品質(zhì)。而殺菌劑的使用又能夠改變葡萄果面微生物群落結(jié)構(gòu)，只有了解不同殺菌劑使用后葡萄果面微生物群落結(jié)構(gòu)，才能保證葡萄酒的口感以及風(fēng)味。近些年，對葡萄根際土壤、葉片、漿果表面等的微生物群落結(jié)構(gòu)研究的較多，馬勉娣等在對釀酒葡萄“赤霞珠”葉內(nèi)生真菌多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬和黑孢屬為優(yōu)勢屬，認(rèn)為釀酒葡萄赤霞珠葉片內(nèi)生真菌菌群豐富，存在一定的宿主專一性，但多樣性偏低[30]。王志恒等在研究寧夏賀蘭山東麓釀酒酵母分離篩選及菌株鑒定試驗(yàn)中，共鑒定出克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隱球酵母（Cryptococcus magnus）共5種酵母菌[31]。魏玉潔等在應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實(shí)、葉片及果園土壤微生物多樣性中檢測到了酵母屬（Saccharomyces）真菌，認(rèn)為該菌可以將葡萄漿果中的糖轉(zhuǎn)化成乙醇、CO 2及其他代謝產(chǎn)物[32]，在葡萄汁發(fā)酵過程中生成并釋放多種香氣物質(zhì)，同時還對葡萄果實(shí)表面的細(xì)菌有一定的生物抑制作用[33]，而相比于真菌，除少數(shù)乳酸菌外，大多數(shù)細(xì)菌微生物對葡萄酒來說都是有害菌，會不同程度對葡萄酒的品質(zhì)造成影響，如變形菌門（Proteobacteria）的醋酸菌在釀酒中屬于典型的有害菌[34]。因此，在釀造過程的各個階段都應(yīng)該盡可能避免或減少細(xì)菌侵染。有關(guān)使用殺菌劑后對葡萄果面微生物群落結(jié)構(gòu)影響的報道較少，國外Noguerol-Pato等選用了10種不同殺菌劑處理過的釀酒葡萄，對酵母菌群落進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)普通表面酵母群落生物量均低于用殺菌劑處理的葡萄，而且研究發(fā)現(xiàn)殺菌劑還降低了酵母菌的發(fā)酵能力、乙醇生產(chǎn)量和香氣物質(zhì)含量[35]。本研究中對使用7種殺菌劑后的果面微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果面真菌中枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高;葡萄果面細(xì)菌中馬賽菌屬（Massilia）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高。

本研究對7種低毒、生物型農(nóng)藥進(jìn)行了田間藥效試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)47%春雷王銅和0.3%苦參堿對葡萄霜霉病具有良好的防治效果，在調(diào)查的3個時間段中，防治效果在81.32%～91.56%之間，可在實(shí)際生產(chǎn)中合理使用上述殺菌劑防治葡萄霜霉病。并通過對施藥后葡萄果面微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行了初步研究，對其真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、種類和多樣性都有了一定的了解，為安全、高效、環(huán)境友好地防治葡萄霜霉病提供了理論依據(jù)，及為揭示施藥后葡萄果面微生物多樣性，提高葡萄酒品質(zhì)提供了理論支持。

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