◎ 楊飛帆，趙舒景

（上海市崇明食品藥品檢驗(yàn)所，崇明食品安全檢測中心，上海 202150）

新鮮安全的食品是保障人們健康的基本條件，食品的保鮮和防腐是食品生產(chǎn)加工的首要問題，食品防腐劑的選擇及其有效檢測也是社會關(guān)注的熱點(diǎn)問題[1]。食品防腐劑是指能有效防止微生物引起的腐敗變質(zhì)，延長保質(zhì)期的添加劑，我國規(guī)定使用的防腐劑有山梨酸、苯甲酸、丙酸等共30多種。對羥基苯甲酸酯具有酚羥基結(jié)構(gòu)，能夠破壞微生物的細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，并可抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，從而起到防腐保鮮的作用。防腐效果優(yōu)于苯甲酸鈉、山梨酸鉀，而且其使用量和毒性均低于苯甲酸鈉、山梨酸鉀，所以廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域[2]。

對羥基苯甲酸酯包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯和庚酯等，隨著烷基碳鏈的增大，其毒性降低，抗菌作用增加。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定，按照標(biāo)準(zhǔn)使用，對羥基苯甲酸甲酯鈉、對羥基苯甲酸乙酯鈉和對羥基苯甲酸丙酯鈉作為食品防腐劑應(yīng)用于醬油、果醬、水產(chǎn)品、飲料、新鮮水果和蔬菜等產(chǎn)品。

食品中的對羥基苯甲酸酯類的檢測方法較多，如高效液相色譜法[3-4]、高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、氣相色譜法[6-7]。本次對醬油中羥基苯甲酸脂類含量測定采用的是氣相色譜法，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對羥基苯甲酸脂類的測定》（GB 5009.31—2016）[8]中推薦使用的為氣相色譜法，但整個方法中所需用到的有機(jī)溶劑用量大、前處理復(fù)雜、精密度和準(zhǔn)確度低。通過試驗(yàn)，簡化了醬油基質(zhì)的樣品前處理，優(yōu)化了分析條件，建立了醬油中對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯及丁酯的準(zhǔn)確、快速、有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用醬油為市售產(chǎn)品。

對羥基苯甲酸甲酯（DR.E，CAS號94-26-8，純度99.90%）；對羥基苯甲酸乙酯（DR.E，CAS號120-47-8，純度99.02%）；對羥基苯甲酸丙酯（DR.E，CAS號94-13-3，純度98.70%）；對羥基苯甲酸丁酯（DR.E，CAS號99-76-3，純度99.73%）；無水乙醚（色譜純）；無水乙醇（色譜純）；鹽酸（1∶1）；飽和氯化鈉溶液；碳酸氫鈉溶液（10 g·L-1）；50 mL離心管；150 mL梨形瓶；一次性吸管；0.22 μm有機(jī)相濾膜；一次性無菌注射器。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜儀，配有FID檢測器：美國Agilent；ME104E電子天平：瑞士METTLER TOLEDO；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi；渦旋混合儀、氮吹儀、低溫高速離心機(jī)：美國Thermo Scientific；HP-5MS毛細(xì)管柱：美國Agilent。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

以醬油作為基質(zhì)，稱取5 g試樣（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，加入1 mL鹽酸（1∶1），混合均勻。分別以15 mL、10 mL、10 mL無水乙醚提取3次，渦旋提取后，4 000 r·min-1離心5 min，提取有機(jī)相，合并于50 mL離心管中，加入10 mL碳酸氫鈉溶液進(jìn)行洗滌一次，棄去水相，提取有機(jī)相至150 mL梨形瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮近干，用氮吹儀吹干，準(zhǔn)確加入2 mL無水乙醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行氣相色譜測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

參照GB 5009.31—2016[8]的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制要求，準(zhǔn)確配制1 mg·mL-1的單個對羥基苯甲酸酯類的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。置于4 ℃冰箱冷藏保存，有效期1個月。

分別吸取對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備 液 各 40 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1 000 μL于10 mL容量瓶，定容至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)工作系列，具體濃度見表1，標(biāo)準(zhǔn)工作液應(yīng)臨用現(xiàn)配。

表1 對羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)工作系列表

1.3.3 儀器參考條件

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱，柱長30 m，柱內(nèi)徑0.32 mm，固定液膜厚度0.25 μm；載氣恒流模式：2 mL·min-1；氫氣：30 mL·min-1；空氣：300 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；分流比：5∶1；氣相升溫程序見表2。

表2 對羥基苯甲酸酯程序升溫條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇

分別對DB-FFAP、HP-FFAP、HP-Innowax、HPWAX和HP-5MS等柱子進(jìn)行測試分析發(fā)現(xiàn)，HP-5MS擁有非常好的重現(xiàn)性和非常高的柱效，且分析完成的時(shí)間短，所以選定弱極性的HP-5MS柱子，克服了極性柱無法分離對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯以及拖尾嚴(yán)重的缺點(diǎn)，同時(shí)提高了分析速度。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化

氣相色譜（Gas Chromatography，GC）分析中柱溫的選擇是一個重要的因素。筆者對初始溫度和升溫速率進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)柱溫程序升溫為初始柱溫60 ℃，保持2 min后以10 ℃·min-1速率升溫至170 ℃，再以12 ℃·min-1速率升溫至220 ℃保持1 min后，以10 ℃·min-1速率升溫到250 ℃保持6 min時(shí)，4種防腐劑可在4 min內(nèi)完全分離，且峰型較好。

在選定的儀器條件下，對羥基苯甲酸甲酯（11.799 min）、對羥基苯甲酸乙酯（12.627 min）、對羥基苯甲酸丙酯（13.742 min）、對羥基苯甲酸丁酯（14.795 min）完全分離，峰型完整，試劑空白沒有干擾，結(jié)果見圖1。由于醬油基質(zhì)復(fù)雜，干擾峰雜多，在用電腦軟件進(jìn)行校正時(shí)，應(yīng)將校正設(shè)置中的參比峰時(shí)間設(shè)置為±1%，以減少雜峰對結(jié)果的干擾。結(jié)果見圖2。

圖1 4組分對羥基苯甲酸酯色譜圖

圖2 醬油中4組分對羥基苯甲酸酯色譜圖

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑及用量的選擇

根據(jù)待測組分的極性與溶解性特征，比較了三氯甲烷、二氯甲烷及無水乙醚的提取效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用三氯甲烷、二氯甲烷進(jìn)行提取，各組分回收率低于50%，使用無水乙醚進(jìn)行提取時(shí)，各組分回收率在87.5%～110.8%。故選擇無水乙醚作為提取溶劑。

試驗(yàn)考察了提取溶劑加入量為以下兩種情況的提取效果。①一次性加入無水乙醚50 mL進(jìn)行提取。②分別以15 mL、10 mL、10 mL無水乙醚提取3次。試驗(yàn)結(jié)果表明，一次性加入無水乙醚50 mL進(jìn)行提取得到的有機(jī)相較少；故選擇提取溶劑用量為35 mL，分別以15 mL、10 mL、10 mL提取3次。

2.2.2 提取溶劑的毒性及環(huán)保污染比較

本試驗(yàn)中所采用的3種有機(jī)試劑（三氯甲烷、二氯甲烷及無水乙醚）為有機(jī)分析前處理中常用的3種提取試劑。在保證試驗(yàn)過程及結(jié)果準(zhǔn)確、高效、快速的前提下，筆者還應(yīng)考慮試劑本身產(chǎn)生的毒性及帶來的環(huán)保污染。3種有機(jī)試劑的沸點(diǎn)及毒性見表3。

由表3可知，二氯甲烷、三氯甲烷以及無水乙醚3種有機(jī)試劑的極性大小順序?yàn)槎燃淄椋既燃淄椋紵o水乙醚；而3種有機(jī)試劑的毒性大小順序則為三氯甲烷＞二氯甲烷＞無水乙醚。

表3 3種有機(jī)試劑的沸點(diǎn)及相關(guān)毒性表

綜上所述，本試驗(yàn)從溶劑的提取效率、溶劑的溶解性強(qiáng)弱、提取溶劑的毒性和環(huán)保污染3方面進(jìn)行綜合考慮，最終選定無水乙醚作為本試驗(yàn)所使用的提取有機(jī)溶劑。

2.2.3 鹽效應(yīng)影響

已有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，當(dāng)溶液中無機(jī)鹽濃度增大時(shí)，有機(jī)溶劑與水的互溶比改變，組分在水中的溶解度降低。試驗(yàn)考察了不同氯化鈉濃度對提取效果的影響，結(jié)果表明，隨著氯化鈉濃度的增加，對羥基苯甲酸甲酯的提取量逐漸增大，對羥甲苯甲酸乙酯、對羥甲苯甲酸丙酯、對羥甲苯甲酸丁酯的提取量卻減少，這說明不同組分受氯化鈉的影響不同。當(dāng)使用飽和氯化鈉溶液時(shí)，各組分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，回收率為80%～120%。但使用不飽和氯化鈉溶液時(shí)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＞11%，回收率為60%～150%。故選擇飽和氯化鈉溶液。

2.2.4 提取、離心的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若選用液液萃取方式，形成的體系的渾濁度不同，并且易有乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，故采用渦旋離心的前處理方法，該方法方便、快速、高效。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)、檢出限

標(biāo)準(zhǔn)工作系列分別通過氣相色譜分析，4組分的對羥基本甲酸酯類線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，校準(zhǔn)曲線及相關(guān)性系數(shù)見表4，同時(shí)4組分的對羥基本甲酸酯類的檢出限也較低，符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對羥基苯甲酸脂類的測定》（GB 5009.31—2016）檢測要求。

表4 4種對羥基苯甲酸脂類的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)、檢出限表

2.4 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確在醬油基質(zhì)中添加檢出限、定量限、最高添加限量的濃度點(diǎn)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)進(jìn)行6份平行試樣，按照1.3.1樣品處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)行3濃度6平行的加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果見表5。

由表5可知，醬油中4種對羥基苯甲酸酯3個濃度點(diǎn)6個平行的加標(biāo)回收率平均值在87.5%～111.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%～8.30%，其回收率和精密度均滿足測定要求，證明該方法重現(xiàn)性好。

表5 醬油基質(zhì)中4種對羥基苯甲酸脂類加標(biāo)試驗(yàn)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果表（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的測定

根據(jù)上述試驗(yàn)條件，對經(jīng)提取、凈化的醬油樣品進(jìn)行測定分析，得到樣品色譜圖，見圖2。經(jīng)計(jì)算該醬油中對羥基苯甲酸甲酯的含量為0.007 g·kg-1，對羥基苯甲酸乙酯的含量為0.008 g·kg-1，對羥基苯甲酸丙酯的含量為0.007 g·kg-1，對羥基苯甲酸丁酯的含量為0.008 g·kg-1。其中《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定對羥基苯甲酸酯類的用量不大于0.25 g·kg-1。說明本試驗(yàn)方法檢測醬油中對羥基苯甲酸酯類的靈敏度更好，準(zhǔn)確度更高，推廣實(shí)用性更強(qiáng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了醬油中4種對羥基本甲酸酯類的氣相色譜法，與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對羥基苯甲酸脂類的測定》（GB 5009.31—2016）相比較，不僅對儀器分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，還優(yōu)化了前處理過程，將分液漏斗的提取方式改進(jìn)為離心管分離提取，快速、高效、操作方便；該方法能有效去除基質(zhì)干擾、分離度高、回收率和精密度高，在檢測結(jié)果的回收率和精密度都符合實(shí)驗(yàn)室要求的前提下，有機(jī)試劑用量僅是標(biāo)準(zhǔn)方法推薦使用量的20%，有效地減少了廢液的產(chǎn)生。

在上述試驗(yàn)分析討論中，筆者從一系列數(shù)據(jù)可以看出無水乙醚既能達(dá)到很好的提取效果，滿足試驗(yàn)檢測所需的要求，同時(shí)從試驗(yàn)人員人身健康及環(huán)保角度方面來看，無水乙醚優(yōu)于二氯甲烷和三氯化碳。故本試驗(yàn)從溶劑的提取效率、溶劑的溶解性強(qiáng)弱、提取溶劑的毒性及環(huán)保污染3方面進(jìn)行綜合考慮，最終選擇使用無水乙醚作為提取試劑。