洪 俊，饒永彩

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060；2.武漢生物制品所，湖北 武漢 430060）

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種罕見的獲得性造血干細(xì)胞疾病，由X連鎖磷脂酰肌醇聚糖A類（phosphatidylinositol glycan-class A，PIG-A）基因的體細(xì)胞突變引起；該突變導(dǎo)致部分或完全不能生物合成糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨定蛋白；PNH的臨床特征主要有血管內(nèi)溶血、骨髓發(fā)育不良和異常部位形成血栓風(fēng)險(xiǎn)升高[1-2]。1996年以來，流式細(xì)胞術(shù)已成為檢測(cè)GPI缺陷細(xì)胞的首選方法[3]。2010年，國(guó)際臨床細(xì)胞計(jì)量學(xué)會(huì)發(fā)布了第1個(gè)通過流式細(xì)胞儀診斷和監(jiān)測(cè)PNH的指南[4]，Sutherland等于2012年發(fā)表了后續(xù)實(shí)用指南[5]，闡述了PNH中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞高靈敏度檢測(cè)的詳細(xì)方案和分析策略，PNH中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞測(cè)定均采用基于熒光Aerolysin的方法——FLAER法。FLAER是Alexa-488標(biāo)記的無活性氣單胞菌溶素前體的變異體，可以直接結(jié)合白細(xì)胞上所有GPI連接結(jié)構(gòu)的GPI部分，大量研究結(jié)果表明，F(xiàn)LAER法是檢測(cè)PNH和相關(guān)疾病中GPI缺陷白細(xì)胞最為可靠的方法[4-6]。

腺苷二磷酸-核糖基環(huán)化酶2（CD157）是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原-1基因編碼的GPI錨定細(xì)胞表面酶。有研究結(jié)果表明，CD157可能具備與FLAER類似的潛在PNH克隆檢測(cè)性能[11-12]。由于FLAER非常稀少，且價(jià)格昂貴，如何采用流式細(xì)胞儀快速、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)PNH中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞PNH克隆，是當(dāng)前困擾流式細(xì)胞術(shù)PNH檢測(cè)更廣泛開展的一個(gè)難題。目前，四色流式細(xì)胞術(shù)在我國(guó)的使用最廣泛，建立可與FLAER法媲美的非FLAER四色法流式細(xì)胞術(shù)PNH克隆檢測(cè)法，顯然對(duì)于我國(guó)PNH克隆檢測(cè)具有更現(xiàn)實(shí)的意義。本研究基于CD157、CD14、CD33、CD15、CD24建立非FLAER法的PNH四色流式測(cè)定方案（簡(jiǎn)稱CD157流式法），并驗(yàn)證CD157用于PNH克隆檢測(cè)的可行性，以尋找FLAER法PNH克隆檢測(cè)的替代方法。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014年1月—2018年9月武漢大學(xué)人民醫(yī)院45例PNH患者外周血樣本，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）稀釋，獲得中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞大克?。ǎ?0%）、中等克?。?%～40%）、小克?。ǎ?%）的PNH克隆。PNH診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[1]。因目前PNH相關(guān)指南和專家共識(shí)中均沒有將PNH基因檢測(cè)結(jié)果納入PNH診斷依據(jù)，所以本研究中的病例均未進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)。本研究經(jīng)武漢大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本處理具體方法參考文獻(xiàn)[8]，將100 μL充分混合的乙二胺四乙酸抗凝外周血與適量預(yù)滴定的MoAb在室溫下避光孵育30 min。室溫避光條件下，用2 mL稀釋至1×的新鮮氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞10 min，然后采用含1%牛血清白蛋白的PBS洗滌白細(xì)胞2次，在獲得之前重懸于0.5～1.0 mL PBS。采用FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）及配套試劑進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析采用FACS-Diva軟件。檢測(cè)前，對(duì)于初始設(shè)置和光電倍增管進(jìn)行優(yōu)化，使用在不改變光電倍增管的情況下獲得的單染色補(bǔ)償管生成計(jì)算機(jī)輔助補(bǔ)償矩陣。使用CST校準(zhǔn)微球校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀的電壓及增益。每個(gè)樣品測(cè)定管至少取200 000個(gè)細(xì)胞。采用Boolean設(shè)門策略分析白細(xì)胞，CD157流式法用FSC/SSC、CD45、CD15、CD157和CD24分析中性粒細(xì)胞PNH克隆，用FSC/SSC、CD45、CD33、CD157和CD14分析單核細(xì)胞PNH克?。籆D55/CD59流式法用FSC / SSC、CD45 、CD55、CD59和CD24用于分析中性粒細(xì)胞PNH克隆，使用FSC / SSC，CD45、CD55、CD59和CD14用于分析單核細(xì)胞PNH克??；FLAER法參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行操作。采用FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測(cè)以下熒光標(biāo)記單克隆抗體組合：CD14-APC-cy7、CD33-APC、CD157-FITC、CD15-APC、CD24-PE、CD45-PECy7、FLAER-Alexa 488（Cedarlane）、CD24-PE、CD15-PECy5、CD45-PECy7、CD14-PE、CD64-PECy5和CD45-PECy7，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，取均值。

1.3 CD157流式法精密度評(píng)估

1.3.1 批內(nèi)精密度 對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞PNH大、中、小克隆連續(xù)重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算、s和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.3.2 批間精密度 在24 h內(nèi)對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞PNH大、中、小克隆進(jìn)行10次單獨(dú)檢測(cè)(儀器斷電、重新校準(zhǔn))，計(jì)算、s和CV。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用線性回歸和Pearson相關(guān)分析評(píng)價(jià)不同流式檢測(cè)方法批內(nèi)和批間測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Wilcoxon秩檢驗(yàn)進(jìn)行配對(duì)樣本比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過Bland-Altman分析評(píng)估2種方法檢測(cè)性能的一致性，以平均偏差為零表示2種方法絕對(duì)性能一致。率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD157流式法PNH中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

CD157流式法PNH中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 CD157流式法中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞PNH克隆流式散點(diǎn)圖

2.2 批內(nèi)、批間精密度

（1）批內(nèi)精密度。對(duì)于PNH大克隆，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的CV分別為0.07%、0.28%；對(duì)于PNH中等克隆，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞的CV分別為0.71%和0.78%；對(duì)于PNH小克隆，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的CV分別為3.01%和4.95%。見表1。

表1 批內(nèi)精密度 %

（2）批間精密度。在24 h內(nèi)對(duì)所有PNH克隆進(jìn)行連續(xù)10次的單獨(dú)分析運(yùn)行測(cè)定（儀器斷電和重新校準(zhǔn)）。對(duì)于PNH大克隆，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的CV分別為0.19%和0.27%；對(duì)于PNH中等克隆，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞的CV分別為1.30%和2.84%；對(duì)于PNH小克隆，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的CV分別為7.19%和7.98%。見表2。

表2 批間精密度 %

2.3 CD157流式法和FLAER法單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性和一致性分析

采用CD157流式法和FLAER法[11-12]對(duì)45份PNH患者的外周血樣本進(jìn)行平行分析。PNH中性粒細(xì)胞的線性回歸分析結(jié)果顯示，2種方法相關(guān)性良好[Y=0.98X-0.058（r2=0.998）]。Wilcoxon秩檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Bland-Altman分析結(jié)果顯示，2種方法的一致性較好（平均偏差為0.13%）。PNH單核細(xì)胞的線性回歸分析結(jié)果顯示，2種方法相關(guān)性良好[Y=0.99X+0.089（r2=0.996）]。Wilcoxon秩檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Bland-Altman分析結(jié)果顯示，2種方法一致性較好（平均偏差為0.07%）。見圖2、表3。

表3 CD157流式法和FLAER法對(duì)45份PNH克隆樣本的分析數(shù)據(jù) %

圖2 CD157流式法與FLAER法的相關(guān)性和一致性分析結(jié)果

2.4 3種流式細(xì)胞檢測(cè)方法診斷PNH的效能

對(duì)CD157流式法、FLAER法和CD55/CD59流式法診斷PNH的效能進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，CD157流式法和FLAER法診斷PNH的效能優(yōu)于CD55/CD59流式法。見表4。

表4 3種流式法診斷PNH的效能

3 討論

有研究結(jié)果顯示，35%的PNH患者在診斷后5年內(nèi)因相關(guān)并發(fā)癥死亡[1]。對(duì)骨髓衰竭患者進(jìn)行早期PNH克隆檢測(cè)可能會(huì)影響治療決策和結(jié)果，出現(xiàn)PNH微小克隆通常預(yù)示患者對(duì)免疫抑制療法反應(yīng)良好[2]。因此，有效檢測(cè)GPI缺陷細(xì)胞是診斷PNH和治療骨髓衰竭的關(guān)鍵。

SUTHERLAND等[5]制定了利用特定試劑測(cè)定PNH的標(biāo)準(zhǔn)化程序，以及PNH中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞高靈敏度檢測(cè)的詳細(xì)方案和分析策略。該方案基于熒光Aerolysin（FLAER）的方法，包括針對(duì)中性粒細(xì)胞的FLAERAlexa488、CD24-PE、CD15-PECy5、CD45-PECy7和針對(duì)單核細(xì)胞的FLAERAlexa488、CD14-PE、CD64-PECy5、CD45-PECy7。有多中心研究結(jié)果顯示，基于2管/四色流式細(xì)胞檢測(cè)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞PNH克隆的FLAER法是通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化PNH測(cè)定的良好基礎(chǔ)[7-9]。毫無疑問，F(xiàn)LAER法是GPI缺陷型中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的高靈敏度檢測(cè)方法[4-9，11-14]。然而，作為近年來新開發(fā)的流式細(xì)胞檢測(cè)非單克隆抗體試劑，F(xiàn)LAER的產(chǎn)量非常少，目前全球僅1家公司生產(chǎn)，且價(jià)格高昂。因此，如何采用流式細(xì)胞儀快速和經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞PNH克隆，是當(dāng)前PNH流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)更廣泛開展面臨的難題。

CD157是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原-1基因編碼的GPI錨定細(xì)胞表面酶，主要在前B細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮作用[10]。在造血系統(tǒng)內(nèi)，CD157在正常中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上高表達(dá)[15]。有研究結(jié)果表明，CD157可能具備與FLAER類似的潛在PNH克隆檢測(cè)性能[11-12]。本研究參考相關(guān)指南[4-5，13-14]，使用CD24、CD15、CD45、CD157（中性粒細(xì)胞）和CD14、CD33、CD157（單核細(xì)胞）建立了基于CD157的非FLAER法流式細(xì)胞術(shù)PNH檢測(cè)方案，并與經(jīng)典的FLAER法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，CD157流式法與FLAER法中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞PNH克隆的檢測(cè)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2種方法的相關(guān)性良好（r2＞0.99），一致性良好（中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞PNH克隆的平均偏差分別為0.13%、0.07%）；CD157流式法的批內(nèi)和批間精密度分別低于5%和8%，檢測(cè)單核細(xì)胞PNH克隆的批內(nèi)、批間精密度均高于檢測(cè)中性粒細(xì)胞PNH克隆；這可能與單核細(xì)胞數(shù)量較少，獲得性事件顯著少于中性粒細(xì)胞而具有更多的異質(zhì)性結(jié)果有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD157流式法和FLAER法診斷PNH的敏感性均為100%，高于CD55/CD59流式法（94.0%）。

綜上所述，基于CD157的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞PNH克隆檢測(cè)方法具有良好的檢測(cè)性能，CD157流式法檢測(cè)結(jié)果與FLAER法一致性良好，基于CD157的非FLAER法可以作為無法使用FLAER法的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PNH克隆檢測(cè)的替代方案。