李可可，肖 揚

（1.東莞東華醫(yī)院，廣東 東莞 523129；2.深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院，深圳 518067）

凝血因子（coagulation factor，F(xiàn)）Ⅴ也被稱為促凝血球蛋白原或易變因子。FⅤ作為凝血酶原復合物中活化的FⅩ（activated coagulation factor Ⅹ，F(xiàn)Ⅹa）的輔因子，對促進“凝血級聯(lián)”反應的凝塊形成極為重要。除了促凝活性外，F(xiàn)Ⅴ還可作為活化蛋白C（activated protein C，APC）的輔因子參與FVⅢa滅活，發(fā)揮其抗凝作用，并作為組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的輔因子，和TFPI/S蛋白（protein S，PS）形成三聯(lián)復合物（TFPI/PS/FⅤ），通過抑制FⅩa活性發(fā)揮其抗凝作用[1]。遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥（hereditary coagulation factor Ⅴ deficiency，F(xiàn)ⅤD）是一種罕見的出血性疾病，但患者出血嚴重程度不等，很少出現(xiàn)危及生命的大出血[2]。F5基因功能缺陷型突變會導致FⅤD，重型FⅤD患者出血嚴重程度存在差異，有可能和基因突變類型有關(guān)[3-4]。F5功能獲得型突變則與血栓發(fā)生有關(guān)。本文對FⅤ的生物學特性進行概述，并介紹F5功能缺陷型突變與出血和F5功能獲得型突變與血栓的關(guān)系。

1 FⅤ的生物學特性

正常人體中，約80%的FⅤ存在于血漿中，20%存在于血小板α顆粒中。血漿FⅤ主要由肝臟合成，雖然巨核細胞也能夠合成FⅤ，但血小板FⅤ主要來源于血漿池。骨髓巨核細胞通過類似胞吞的機制將血漿FⅤ轉(zhuǎn)化為血小板FⅤ，并將其儲存在α顆粒中[5]。

血漿FⅤ是一種相對分子質(zhì)量約為330 000的多結(jié)構(gòu)域的單鏈糖蛋白（A1-A2-B-A3-C1-C2），以酶原形式在血漿中循環(huán)。B結(jié)構(gòu)域中含有高度保守的堿性區(qū)域（aa963-aa1008）和酸性區(qū)域（aa1493-aa1537），二者的高親和力結(jié)合使FⅤ形成一個球狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可保護FⅤ的裂解位點不暴露，從而使FⅤ維持其酶原形式[6]。在FⅩa或凝血酶的作用下，血漿FⅤ于Arg709、Arg1018和Arg1545位點水解，釋放B結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)化為有活性的FⅤ（FⅤa），其中Arg1545是關(guān)鍵切點[7]。血漿FⅤa由1條重鏈（A1-A2）和1條輕鏈（A3-C1-C2）組成，由Ca2+連接在一起。在凝血級聯(lián)反應中，在存在Ca2+的條件下，F(xiàn)Ⅴa作為FⅩa的輔因子，通過與FⅩa高親和力結(jié)合，于活化血小板的磷脂膜上形成凝血酶原復合物（FⅤa/FⅩa/PL），高效加速凝血酶原的激活，發(fā)揮促凝作用[8]。FⅤa在APC/PS復合體的作用下，于Arg306、Arg506和Arg679位點裂解滅活[9]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，與血漿FⅤ相比，血小板FⅤ具有更強的促凝活性[10]?？赡艿脑驗椋海?）血小板FⅤ在被FⅩa或凝血酶激活為FⅤa之前，就已經(jīng)以部分活化的形式存在；（2）相比于血漿FⅤ，血小板FⅤ可更快地被FⅩa激活[11]；（3）血小板聚集于血管受損處，活化的血小板從α顆粒中釋放FⅤ，導致血小板膜表面局部FⅤ濃度偏高[12-13]；（4）血小板FⅤa和血漿FⅤa被APC在相同的識別位點裂解，但血小板FⅤa的蛋白水解速度較慢，不能被APC完全滅活[14]。

FⅤ除了以FⅤa形式作為FⅩa的輔因子發(fā)揮促凝作用外，也具有抗凝作用[15]。其抗凝作用主要包括以下2個方面：（1）FⅤ可作為APC/PS復合物的輔因子，參與FⅧa的滅活[16]；但FⅤ只有在Arg506位點被APC剪切后，將FⅤ轉(zhuǎn)化為幾乎沒有任何促凝特性的抗凝蛋白，才發(fā)揮其輔因子的抗凝特性；FⅤ在Arg1545位點被凝血酶剪切后，失去了其作為APC/PS復合物的輔因子抗凝功能，但在Arg709和Arg1018位點上的剪切則不會影響其抗凝功能[17]；（2）作為TFPI的輔因子，F(xiàn)Ⅴ可與TFPI/PS形成三聯(lián)復合物——TFPI/PS/FⅤ，發(fā)揮抑制FXa的作用[18]。

2 F5功能缺陷型突變與出血

FⅤD是一種罕見的常染色體隱性遺傳性出血性疾病，是由F5功能缺陷導致的[19]；在人群中的發(fā)病率約為百萬分之一[20]。迄今為止，有180多種與FⅤD相關(guān)的突變（人類基因組突變數(shù)據(jù)庫www.hgmd.cf.ac.uk）被報道，類型有同義突變、錯義突變、無義突變、剪接位點突變、缺失和插入等[21]。FⅤD患者的臨床出血表現(xiàn)不一，從無癥狀到危及生命的出血都有發(fā)生[22]。輕度（FⅤ：C≥10%）和中度（FⅤ：C＜10%）FⅤD通常無臨床癥狀，重度（FⅤ：C＜1%）FⅤD患者的臨床表型具有一定的異質(zhì)性，部分重度FⅤD患者一般只表現(xiàn)為皮膚瘀斑、鼻衄、月經(jīng)過多和術(shù)后出血增多等輕、中度出血，但也有重度FⅤD患者表現(xiàn)為顱內(nèi)出血、消化道出血、臍帶出血等危及生命的出血。推測這種異質(zhì)性或與FⅤD患者的F5突變類型有關(guān)[10，22]。輕、中度出血多見于F5突變類型為錯義突變、無義突變、小的缺失和插入的重型FⅤD患者[21，23-24]；而危及生命的出血則常見于F5突變類型為剪切位點突變、大段缺失以及深部內(nèi)含子變異的重型FⅤD患者[25-27]。這可能是因為無義突變、錯義突變、小的缺失和插入等突變類型只影響FⅤ蛋白的局部功能，對其促凝結(jié)構(gòu)域的影響不大，但大段缺失、剪切位點突變以及深部內(nèi)含子變異這些突變類型會導致FⅤ蛋白缺失。

可能是因為微量的FⅤ即可產(chǎn)生足量凝血酶，部分重度FⅤD患者的出血并沒有想象中的那么嚴重[28]。DUCKERS等[29]通過凝血酶生成試驗（thrombin generation assay，TGA）發(fā)現(xiàn)，在乏血小板血漿中，10%的FⅤ即可產(chǎn)生正常量的凝血酶。TGA是一個可系統(tǒng)監(jiān)測待測標本中凝血酶生成總潛力的試驗，采用TGA實時監(jiān)測凝血酶的含量可以有效地評價出血或血栓形成的風險[30]，尤其是對于輕、中度出血的重型FⅤD患者[31]而言，TGA有助于預測其出血風險。DUCKERS等[32]對重型FⅤD患者的富血小板血漿進行TGA，發(fā)現(xiàn)即使使用高濃度的組織因子觸發(fā)凝血酶生成，在重度FⅤD患者的乏血小板血漿中也未觀察到凝血酶產(chǎn)生，但在相應的富血小板血漿中則觀察到在低濃度組織因子中已產(chǎn)生可觀的凝血酶。這一現(xiàn)象可能是因為重度FⅤD患者雖然血漿FⅤ含量極低，但其血小板中仍含有一定量的FⅤ，可以代償血漿中減少的FⅤ，發(fā)揮促凝功能。雖然FⅤD患者血漿FⅤ水平和血小板FⅤ水平同步降低，但因為血小板FⅤ比血漿FⅤ具有更強的促凝活性，而且血小板在受損部位可以快速釋放FⅤ，形成局部高濃度，所以血小板FⅤ比血漿FⅤ促凝活性更高，極大地降低了FⅤD患者的出血風險。此外，F(xiàn)Ⅴ和生理抗凝物質(zhì)TFPI可在血漿中形成復合物[33]，二者水平高度相關(guān)，從正常人群到部分（雜合子）再到嚴重（純合子）的FⅤD患者，TFPI水平逐漸降低。TFPI的減少，也間接促進了凝血酶的產(chǎn)生[32，34]。

目前，治療FⅤD的方法主要是輸注新鮮冰凍血漿（fresh frozen plasma，F(xiàn)FP）和血小板[35-36]，使FⅤ水平維持在＞20%[37]。近年來，也有新興技術(shù)被逐漸應用于FⅤD的治療，如一種新型血漿衍生FⅤ濃縮物可在體外有效糾正FⅤ缺陷血漿的活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間，或可成為FⅤD治療的有效藥物[38-39]。令人驚喜的是，目前已經(jīng)有新技術(shù)通過F5修復來治療FⅤD患者，有學者通過對FⅤD患者生成誘導多能干細胞iPSCs，并應用CRISPR相關(guān)技術(shù)修復了F5的突變，恢復了FⅤD患者的FⅤ活性水平[40]。

3 F5功能獲得型突變與血栓

F5還有一些突變是功能獲得型突變，這些突變常與血栓相關(guān)。FⅤLeiden是最常見的F5功能獲得型突變，其是高加索人群靜脈血栓形成最常見的遺傳危險因素；在雜合狀態(tài)下，靜脈血栓栓塞的風險可增加5～7倍，純合子的風險甚至更高[41]。FⅤLeiden使FⅤ蛋白第506位精氨酸被谷氨酸取代，F(xiàn)Ⅴa失去1個關(guān)鍵的APC剪切位點Arg506，導致APC抵抗，即APC無法有效滅活FⅤa和FⅧa，導致體內(nèi)抗凝不足[42]。另1個APC的剪切位點突變也與血栓發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)，即FⅤ Arg306Thr（FⅤ Cambridge）[43]。臨近Arg506剪切位點的突變亦可產(chǎn)生APC抵抗，如FⅤBonn（Ala512Val）[44]。除此之外，氨基酸序列上遠離APC經(jīng)典剪切位點的功能獲得型突變也可導致APC抵抗，如日本學者發(fā)現(xiàn)的純合突變FⅤNara（Trp1920Arg/W1920R）[45]與嚴重的深靜脈血栓有關(guān)，該突變在一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列上與APC的剪切位點相距較遠，但其可能通過影響FⅤ與APC的結(jié)合或FⅤ與磷脂的結(jié)合，進而影響APC的剪切效率。TGA同樣可以應用于預測F5功能獲得型突變血栓的形成。

目前，雖尚未見此類病例報道，但有理由推測F5功能獲得型突變或可通過影響其TFPI的輔因子活性來減弱TFPI抗凝功能，進而導致血栓。有關(guān)F5突變與血栓之間的關(guān)聯(lián)有待進一步研究加以證實。

4 總結(jié)

FⅤ具有促凝和抗凝雙重作用，在止血和血栓的形成中均發(fā)揮重要作用。本文著重介紹了F5突變與出血和血栓之間的關(guān)聯(lián)，該領域主要研究方向是通過研究F5的不同突變，以及對突變基因進行體外表達并對其進行TGA檢測，從而更好地預測攜帶F5突變患者的出血風險或血栓形成的風險。尤其是FⅤD患者，由于FⅤ的活性水平與疾病的嚴重程度無明顯關(guān)系，且其臨床出血表現(xiàn)呈現(xiàn)一定的異質(zhì)性，故對FⅤD患者進行F5突變檢測和TGA檢測，盡早預測出血風險尤為重要，特別是對于有手術(shù)需要的FⅤD患者，可以在很大程度上規(guī)避風險。此外，對于輕、中度FⅤD患者，雖然無明顯出血傾向，但一旦患者合并病毒感染等其他突發(fā)事件，依然會增加出血風險，故需對此類情況予以足夠的重視[46]。

對于一些有血栓形成風險的F5突變或不明類型的突變，采用TGA檢測進行血栓或出血風險預測非常有必要。但目前基因檢測成本較高，普及有一定的困難，而且FⅤ蛋白的體外表達較為困難，無法更好地研究某些突變所造成的影響，而且凝血酶生成儀器我國目前也僅有幾臺，對于采用TGA預測出血或血栓形成風險有很大的不便。FⅤ作為具有促凝和抗凝雙重作用的凝血因子，對于闡明機體促凝與抗凝相互作機制有重要意義。隨著科技的發(fā)展，基因檢測技術(shù)和TGA檢測將廣泛應用于臨床，為FⅤD患者或F5功能獲得型突變患者帶來福音。