唐 潔，莫 緒，張啟韓

（桂林師范高等專(zhuān)科學(xué)校，廣西桂林 541199）

截止到2020年，包括中國(guó)、英國(guó)、歐盟、丹麥、俄羅斯及巴西等20多個(gè)國(guó)家已經(jīng)禁止或者嚴(yán)格限制使用百草枯。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用于禁用農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)為氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和免疫分析法等[1]。

色譜分析法由于檢測(cè)儀器體積龐大，對(duì)使用環(huán)境及操作者素質(zhì)都有非常高的要求，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，只適合在特定的實(shí)驗(yàn)室由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作，難以普及推廣應(yīng)用；免疫分析法主要根據(jù)體外生成原理，利用抗體作為生化探測(cè)器實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)殘的定性和定量分析；其中，采用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、熒光免疫分析（Fluorescence Immunoassay，F(xiàn)IA）進(jìn)行檢測(cè)都查到有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。但食品中農(nóng)藥殘留的量往往非常低，這些方法由于其檢測(cè)靈敏度和精密度偏低，因而檢測(cè)結(jié)果達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的檢出率。在免疫分析法中，利用磁微粒化學(xué)發(fā)光法技術(shù)檢測(cè)百草枯農(nóng)藥殘留還未見(jiàn)報(bào)道[2]。

本文采用單克隆抗體、AP酶標(biāo)記以及磁微粒分離技術(shù)，建立了百草枯的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)方法。該方法是在免疫分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的集化學(xué)發(fā)光、特異性免疫分析及磁微粒分離等技術(shù)于一體的新型檢測(cè)技術(shù)，相對(duì)于其他傳統(tǒng)分析方法，該技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)成本低及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等系統(tǒng)性?xún)?yōu)勢(shì)，最低可檢測(cè)到10-18g量級(jí)，能及時(shí)有效地為監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，為政府職能部門(mén)監(jiān)測(cè)和控制農(nóng)藥濫用提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)[3-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris），西隴化工股份有限公司；氯化鈉，西隴化工股份有限公司；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），Sigma有限公司；甘露醇，西隴化工股份有限公司；海藻糖，西隴化工股份有限公司；BRONIDOX-L，天津希恩思生化科技有限公司；吐溫20（Tween20），上海聯(lián)邁生物工程有限公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AR224CN（奧豪斯儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)：SF-TGL-20R（上海菲恰爾）；pH計(jì)：Sartoriuspp-20；蛋白測(cè)定儀：K9840（山東還能科學(xué)儀器有限公司）；集熱試恒溫加熱攪拌器：DF-101S （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；細(xì)胞破碎儀：SM-650A（南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司）；制冰機(jī)：ZBL-35（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑緩沖液配制

依次稱(chēng)取以上物質(zhì)溶解到800 mL純化水里，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.4，并定容為1 000 mL的儲(chǔ)備液備用，分別為T(mén)ris（0.01 mol/L）、氯化鈉 （0.15 mol/L）、BSA（0.5 mol/L）、甘露醇（0.5 mol/L）、 海藻糖（0.5 mol/L）、BRONIDOX-L（0.01 mol/L）及Tween20（0.05%）。

1.3.2 檢測(cè)試劑盒主要組份的制備

檢測(cè)試劑盒主要組份由試劑R1、試劑R2及標(biāo)準(zhǔn)液組成。

（1）PQ試劑R1配制。生產(chǎn)工藝流程如圖1所示，采用抗體偶聯(lián)操作工藝。①取10.00 mL磁珠微球（固體物10%），磁分離10 min，棄上清，用100 mL 0.5 mol/L、pH 5.0的MES緩沖液重懸，在混勻儀上混勻10 min；磁分離10 min，棄上清，加入100 mL 0.5 mol/L、PH 5.0的MES緩沖液重懸。②稱(chēng)取 100 mg N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），用0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩 沖 液充分溶解至10.0 mg/mL；稱(chēng)取50 mg EDC，用 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液充分溶解至 10.0 mg/mL。③在攪拌的條件下，往磁珠微球中先后加入10 mL NHS溶液和5 mL EDC溶液，混勻；④在攪拌的條件下，往磁珠微球中加入百草枯抗體10.00 mg，混勻；⑤磁分離10 min，棄上清，用 100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻；⑥磁分離10 min，棄上清，加100.0 mL 10%BSA重懸，混勻；⑦磁分離10 min，棄上清；用100 mL 0.5 mol/L、pH為5.0的MES緩沖液重懸，混勻即得。

圖1 R1生產(chǎn)工藝流程圖

（2）PQ試劑R2配制。R2生產(chǎn)工藝流程如圖2所示， 采用抗原標(biāo)記操作工藝。①稱(chēng)取5 mg百草枯化合物，12 mg DSS，用200 μL DMSO溶解，再加入10 μL N-甲基嗎啉，混合均勻，37 ℃反應(yīng)90 min。②反應(yīng)完成之后再加入1 mL的DMSO，得到百草枯活化液待用。③取1 mg AP酶溶解在0.1 mol/L Tris，pH為8.0的緩沖液中，加入600 μL百草枯活化液，反應(yīng) 30 min。④反應(yīng)完成之后，加入100 μL 1 mol/L甘氨酸，反應(yīng)15 min。⑤用蛋白測(cè)定儀確定蛋白標(biāo)記物濃度。⑥用酶標(biāo)記物稀釋液稀釋至25 μg/mL。

圖2 R2生產(chǎn)工藝流程圖

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)液的制備

將百草枯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物（貨號(hào)：YJ-XXXX）用 0.1 mol/L PH為7.4的PBS緩沖液溶解成1 mg/mL母液；再分別稀釋成0 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、 125 ng/mL、250 ng/mL及500 ng/mL 6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液C1～C6。

2 結(jié)果與分析

用6個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)發(fā)光儀進(jìn)行定標(biāo)后，分別進(jìn)行準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析。

2.1 準(zhǔn)確度分析

將1 mL高濃度標(biāo)準(zhǔn)液C5（250 ng/mL）加入到9 mL低濃度標(biāo)準(zhǔn)液C1（0 ng/mL）中，混勻后在化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上測(cè)試混合液和低濃度標(biāo)準(zhǔn)液濃度值，各測(cè)試3次，計(jì)算平均值，回收率應(yīng)在85%～115%。根據(jù)公式（1）計(jì)算結(jié)果，回收率為99.58%，在要求范圍以?xún)?nèi)。測(cè)試數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 準(zhǔn)確度測(cè)試數(shù)據(jù)

式中：R為回收率，%；V為加入高濃度標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；V0為低濃度標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL；C為混合液測(cè)試平均值，ng/mL；C0為低濃度標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)試值，ng/mL；Cs為已知高濃度標(biāo)準(zhǔn)液濃度，ng/mL。

2.2 靈敏度評(píng)估

取標(biāo)準(zhǔn)液C1和C2作為待測(cè)樣本，在化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上對(duì)C1進(jìn)行20次測(cè)定，C2測(cè)試3次，統(tǒng)計(jì)測(cè)量結(jié)果的發(fā)光值（RLU），計(jì)算C1的平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Deviation，SD），得出M-2SD；同時(shí)根據(jù)C1和C2之間的發(fā)光值（RLU）進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M-2SD的RLU值代入上述方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為產(chǎn)品的靈敏度，要求靈敏度不能大于5 ng/mL（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求最低殘留量）。從表2數(shù)據(jù)可以計(jì)算得出，試劑檢測(cè)靈敏度為0.37 ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5 ng/mL，產(chǎn)品具有很高的靈敏度。

表2 靈敏度測(cè)試數(shù)據(jù)

2.3 特異性分析

往試劑盒中滴加干擾物并在化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上分別測(cè)定濃度為500 ng/mL的干擾物多菌靈和毒死蜱，各測(cè)試3次，測(cè)定結(jié)果應(yīng)不得高于0.5 ng/mL。從表3數(shù)據(jù)可以看出，兩組干擾物的測(cè)試結(jié)果均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.5 ng/mL，說(shuō)明試劑盒受干擾物影響很小，具有很高的特異性。

表3 特異性測(cè)試數(shù)據(jù)

2.4 精密度

在化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液C2和C5，各重復(fù)測(cè)試至少10次，分別計(jì)算測(cè)量值的平均值（x—）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）[6]。計(jì)算變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV），結(jié)果應(yīng)≤8%。由表4可知，標(biāo)準(zhǔn)液C2和C5變異系數(shù)均小于8%，產(chǎn)品的精密度 很高。

表4 精密度測(cè)試數(shù)據(jù)

2.5 穩(wěn)定性評(píng)估

將制備好的試劑盒進(jìn)行37 ℃加速老化7 d后，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)試，對(duì)測(cè)試結(jié)果的發(fā)光值（RLU）進(jìn)行對(duì)照，數(shù)據(jù)見(jiàn)表。從表5中統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)組的蛋白活性回收率達(dá)到了95%以上，說(shuō)明試劑盒穩(wěn)定性很好。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照表

3 結(jié)論

利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法技術(shù)對(duì)百草枯6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液C1～C6進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密度以及穩(wěn)定性分析，可以得到回收率為99.58%，檢測(cè)靈敏度為0.37 ng/mL，精密度≤8%，蛋白活性回收率可達(dá)到98.17%。