郝文君，夏洪澤，焦 洋，崔占鴻，劉書杰，周 磊，周玉青

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，西寧 810016；3.青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，西寧 810016；4.海北藏族自治州高原生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園管委會，海北 812200)

牦牛是青藏高原地區(qū)特有的放牧家畜，對高寒、高海拔環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[1]。碳水化合物為牦牛生長發(fā)育和消化道微生物提供重要營養(yǎng)物質(zhì)且影響瘤胃和腸道細(xì)菌區(qū)系構(gòu)成[2]。碳水化合物平衡指數(shù)(CBI)是評價飼糧中碳水化合物組成的重要指標(biāo)，物理有效中性洗滌纖維(peNDF)和瘤胃可降解淀粉(RDS)對CBI起到?jīng)Q定性作用，CBI在一定條件下會隨著peNDF水平的升高而升高[3]，而RDS水平會影響到飼糧中性洗滌纖維(NDF)與非纖維性糖類(NFC)的水平，進(jìn)而影響CBI[4]。反芻動物飼草類型和品種繁多且品質(zhì)參差不一，評價飼草品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不一[5]。2001年，盧德勛[6]首次提出粗飼料分級指數(shù)(GI)的概念，即校正粗飼料中粗蛋白質(zhì)(CP)和NDF含量，得到粗飼料可利用能的隨意采食量。GI被廣泛用來評價粗飼料品質(zhì)。不同GI和不同CBI組合飼糧對反芻動物的營養(yǎng)物質(zhì)養(yǎng)分表觀消化率、生長性能以及泌乳量的影響均有差異[7-8]。瘤胃和腸道中存在大量細(xì)菌等微生物，其分泌的消化酶是幫助反芻動物消化飼糧和提供營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[9-10],而飼糧結(jié)構(gòu)是影響瘤胃和腸道細(xì)菌區(qū)系的重要因素之一[11]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，基于表觀消化率以及生長性能等指標(biāo)得出：玉米青貯-苜蓿干草組合中GI=7.19時組合效果最優(yōu)，玉米青貯-燕麥干草組合中GI=1.31時組合效果最優(yōu)，玉米青貯-小麥秸稈組合中GI=0.96時組合效果最優(yōu)；CBI=2.45的飼糧相較于CBI=1.17、5.67的飼糧更有利于舍飼牦牛瘤胃發(fā)酵和對飼料養(yǎng)分的消化吸收[12-13]，且不同飼糧組合對牦牛的發(fā)育影響各有優(yōu)劣[14]。目前關(guān)于不同GI與CBI組合飼糧對牦牛瘤胃和腸道細(xì)菌區(qū)系的研究鮮有報道，本研究以成年舍飼牦牛為研究對象，配制不同GI和CBI組合的全混合飼糧(TMR)，基于16S rRNA測序技術(shù)，分析不同類型飼糧對牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系組成的影響，為生產(chǎn)實踐中舍飼牦牛營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的調(diào)控以及飼糧合理配制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選用12頭3.5歲健康、體重為256.0 kg±15.0 kg的公牦牛，隨機(jī)分為3組，分別飼喂3種TMR飼糧，即玉米青貯-苜蓿干草-精料(CAC)、玉米青貯-小麥秸稈-精料(CWC)和玉米青貯-燕麥干草-精料(COC)。 CAC組飼糧GI=7.19、CBI=2.45；CWC組飼糧GI=0.96、CBI=2.45；COC組飼糧GI=1.31、CBI=2.45，3種飼糧的組成及其營養(yǎng)水平見表1。

試驗地點在青海省湟中豐泰種養(yǎng)殖專業(yè)合作社，試驗期28 d,其中預(yù)飼期7 d，正式期21 d，試驗牛為單欄飼養(yǎng)，試驗圈舍衛(wèi)生通風(fēng)良好、陽光充足并定期消毒。牦牛每天分早晚兩次飼喂(08:00和17:00)，自由飲水。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表

1.2 樣品采集和貯存

試驗最后1天晨飼2 h后，將試驗牛固定在飼喂欄上，通過胃管法采集牦牛瘤胃液，分裝于15 mL無菌凍存管，于液氮中保存待測；從牦牛直腸中掏取糞樣，分裝于5 mL無菌凍存管中，于液氮中保存待測。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 DNA 提取及16S rRNA測序 采用SDS方法提取樣本基因組DNA，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性。使用Barcode特異引物，以1 ng/mL基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物對應(yīng)區(qū)域：通用引物V338F(5′-ACTCC-TACGGGAGGCAGCAG-3′)和V806R(5′-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL，5×FastPfu緩沖液4 μL，最后加ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其產(chǎn)物。用膠回收試劑盒(Qiagen 公司)回收目的條帶，利用Illumina MiSeq平臺(北京諾禾致源科技股份有限公司)對細(xì)菌擴(kuò)增子進(jìn)行測序。

1.3.2 測序數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH對每個樣本的reads進(jìn)行拼接得到Raw Tags，過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，去除嵌合體序列得到最終的Effective Tags。采用Uparse軟件(v 7.0.1001)以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(OTUs)并篩選代表序列，用Mothur方法與SILVA 132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，并統(tǒng)計在門和屬水平上的群落組成。應(yīng)用QIIME 1.7.0進(jìn)行α多樣性分析，計算 Chao1、Shannon、Simpson、Ace等指數(shù)，分析樣本物種多樣性的復(fù)雜性。用β多樣性分析評價物種復(fù)雜度的差異，用QIIME 1.7.0計算Unifrac 距離，進(jìn)行PCoA分析，以R軟件V 2.15.3繪制PCoA圖。

1.3.3 功能分析 通過提取KEGG數(shù)據(jù)庫原核全基因組16S rRNA基因序列，使用BLASTN算法(BLAST Bitscore>1 500)將其與SILVA SSU Ref NR數(shù)據(jù)庫對齊建立相關(guān)矩陣，將通過UProC和PAUDA注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫的原核全基因組功能信息對應(yīng)SILVA數(shù)據(jù)庫，得到功能注釋。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過SPSS 20.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，存在顯著差異時，采用Duncan氏SSR法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系α多樣性分析

瘤胃微生物共得到4 258個OTUs，其中CAC組獨有309個，COC組獨有256個，CWC組獨有886個。直腸微生物共得到3 889個OTUs，其中CAC組獨有1 799個，COC組獨有143個，CWC組獨有227個(圖1)。

由表2可知，3組牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系β多樣性分析

基于樣本的OTU信息，計算樣本之間的加權(quán)遺傳距離矩陣并進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果見圖2。CAC組與COC組的瘤胃細(xì)菌區(qū)系有PC1差異(P<0.05)，直腸細(xì)菌區(qū)系差異不顯著(P>0.05)。

A、B和C，分別表示CAC、COC和CWC組瘤胃樣品；E、F和G，分別表示CAC、COC和CWC組直腸樣品。下同A,B and C，Indicated the rumen samples of CAC,COC and CWC groups, respectively.E,F and G，Indicated the rectal samples of CAC,COC and CWC groups, respectively.The same as below圖1 3組牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系OTU韋恩圖Fig.1 OTU Venn diagram of rumen and rectum bacterial flora of yak in 3 groups

表2 3組牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系α多樣性分析

圖2 3組牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of rumen and rectal bacterial flora of yaks in 3 groups

2.3 牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系在門水平上的組成差異

經(jīng)分類學(xué)分析，本試驗共檢測到50個菌門。分別選擇樣品微生物在門水平上相對豐度排名前十的物種進(jìn)行比較。

瘤胃細(xì)菌區(qū)系最豐富的門包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)(圖3)。CAC、COC、CWC組瘤胃細(xì)菌擬桿菌門占比分別為52.05%、59.25%、52.90%，厚壁菌門分別為40.49%、33.49%、35.40%，變形菌門(Verrucomicrobiota)分別為0.53%、1.02%、1.98%，螺旋體門(Spirochaetes)分別為0.51%、0.88%、0.77%，廣古菌門(Euryarchaeota)分別為1.61%、0.95%、1.14%。CWC組瘤胃放線菌門(Actinobacteriota)與CAC、COC組存在顯著差異(P<0.05)。

直腸細(xì)菌區(qū)系中最豐富的門包括擬桿菌門、厚壁菌門、螺旋體門、疣微菌門(Euryarchaeota)、變形菌門(圖3)。 CAC、COC、CWC組直腸細(xì)菌擬桿菌門占比分別為33.45%、30.62%、25.83%，厚壁菌門分別為48.52%、50.94%、55.21%，螺旋體門分別為6.55%、5.92%、7.45%，變形菌門分別為1.46%、1.78%、2.29%，疣微菌門分別為1.65%、2.71%、0.90%。3組牦牛直腸細(xì)菌區(qū)系在門水平上差異不顯著(P>0.05)。

2.4 牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系在屬水平上的組成差異

在屬水平上對牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系相對豐度>1%的細(xì)菌群落種類進(jìn)行統(tǒng)計(圖4)，瘤胃細(xì)菌區(qū)系中相對豐度>1%的菌屬有5個，相對豐度最高的為理研菌科-RC9-gut-group(Rikenellaceae-RC9-gut-group)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)和琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)。3組牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系在屬水平上差異不顯著(P>0.05)。

直腸細(xì)菌區(qū)系中相對豐度>1%的菌屬有6個，其中豐度最高的為瘤胃球菌科-UCG-005(Ruminococcaceae-UCG-005)，其次為理研菌科-RC9-gut-group。3組牦牛直腸細(xì)菌區(qū)系在屬水平上差異不顯著(P>0.05)。

圖3 3組牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系在門水平上的相對豐度(前十)Fig.3 Relative abundance of microbial community at phylum level of rumen and rectum bacterial flora in yaks of 3 groups (top 10)

圖4 3組牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系在屬水平上的相對豐度(前十)Fig.4 Relative abundance of microbial community at genus level of rumen and rectum bacterial flora in yaks of 3 groups (top 10)

2.5 細(xì)菌基因功能預(yù)測分析

本試驗共匹配到39個KEGG二級代謝通路(圖5)，基因分類為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝、生物系統(tǒng)，大多數(shù)基因功能屬于膜轉(zhuǎn)運、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、復(fù)制與修復(fù)、翻譯、能量代謝和核苷酸代謝等。

對39個代謝通路的相對豐度進(jìn)行3組間比較(圖6)。在瘤胃細(xì)菌區(qū)系中，復(fù)制與修復(fù)、原核細(xì)胞群體、細(xì)胞信號傳遞、環(huán)境適應(yīng)通路在CAC與COC組存在顯著差異(P<0.05)；復(fù)制與修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、原核細(xì)胞群體和老化通路在CAC與CWC組存在顯著差異(P<0.05)，脂質(zhì)代謝、其他氨基酸代謝和老化通路在CWC組和COC組存在顯著差異(P<0.05)。在直腸細(xì)菌區(qū)系中,與能量代謝有關(guān)的KEGG二級代謝通路在CAC與COC組間存在顯著差異(P<0.05)；膜轉(zhuǎn)運、能量代謝、聚糖生物合成和代謝、輔助因子和維生素的新陳代謝、細(xì)胞運動、折疊降解、翻譯和環(huán)境適應(yīng)通路在CAC與CWC組存在顯著差異(P<0.05);脂質(zhì)代謝通路在CWC和COC組間存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 功能基因預(yù)測熱圖Fig.5 Heat map of predicted function of microbiota

3 討 論

3.1 不同GI與CBI組合飼糧對牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系組成的影響

反芻動物瘤胃中含有種類繁多的細(xì)菌群落[15]，瘤胃細(xì)菌對于降解飼料營養(yǎng)成分、維持瘤胃穩(wěn)態(tài)及增強(qiáng)機(jī)體免疫力具有重要意義[16]。細(xì)菌區(qū)系的α多樣性反映樣品中細(xì)菌種類的多樣性和豐富度，物種豐富度由Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)來體現(xiàn)，二者數(shù)值越大，細(xì)菌群落豐富度越高。本試驗中3組牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)差異不顯著，說明粗飼料品質(zhì)對牦牛瘤胃微生物區(qū)系豐富度影響并不顯著，但隨著GI降低，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均升高，說明在CBI相同的情況下，粗飼料品質(zhì)差(GI小)有增加瘤胃細(xì)菌群落豐富度的趨勢[17]。 物種多樣性可由Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)體現(xiàn)，Shannon指數(shù)越高，群落多樣性越豐富，Simpson指數(shù)越高，群落多樣性越低[18]。本研究結(jié)果顯示3組牦牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)無顯著差異，且數(shù)值基本接近一致，表明粗飼料品質(zhì)的優(yōu)劣對瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響并不顯著，該試驗結(jié)果與林波等[19]研究結(jié)論不同，可能與飼糧精粗比及試驗動物種類不同有關(guān)。

大量研究表明，反芻動物瘤胃微生物中相對豐度較高的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門[20]，本研究結(jié)果與此相同。據(jù)報道厚壁菌門和擬桿菌門的比值越高越易造成肥胖[21]，本研究中GI最高的飼糧組合的牦牛瘤胃中厚壁菌門和擬桿菌門的比值較大，說明粗飼料品質(zhì)越高，可能更易造成牦牛脂肪沉積。放線菌門能分解植物來源的碳水化合物[22]，本試驗中 GI最低的組合飼糧的牦牛瘤胃液中放線菌門較高，可能與飼糧小麥干草中纖維成分較高有關(guān)，也可能與粗飼料來源有關(guān)，即不同的纖維水平與不同的纖維來源飼糧均會影響纖維降解菌種類和豐度。在屬水平上，牦牛瘤胃中豐度較高的菌群為普雷沃氏菌屬、理研菌科-RC9-gut-group和瘤胃球菌-UCG-005，與鐘港等[23]研究結(jié)果一致，其中普雷沃氏菌屬能降解淀粉、蛋白質(zhì)[24-25]；瘤胃球菌科與纖維飼料的發(fā)酵密切相關(guān)。本試驗中3種不同GI和CBI飼糧組合牦牛瘤胃3種優(yōu)勢菌屬無顯著差異，表明粗飼料品質(zhì)的差異對牦牛瘤胃在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著影響，可能是因為本試驗中飼糧營養(yǎng)水平基本一致，而且試驗牦牛均已成年，瘤胃優(yōu)勢菌屬細(xì)菌趨于穩(wěn)定，相對不易受到粗飼料品質(zhì)的影響。

圖6 3組牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌區(qū)系差異顯著的功能基因Fig.6 Microbial functional genes with significant differences in rumen and rectum of yaks in 3 groups

3.2 不同GI與CBI組合飼糧對牦牛直腸細(xì)菌區(qū)系組成的影響

腸道是牦牛吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所之一，腸道菌群種類和豐度直接影響腸道吸收和免疫功能，腸道菌群通過參與糖類、脂肪、蛋白質(zhì)以及氨基酸等的代謝活動影響動物健康，且不同菌群會造成腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)效率差異[26-27]。飼糧纖維影響腸道細(xì)菌區(qū)系組成，復(fù)雜的碳水化合物可作為大量腸道微生物消耗的底物[28]。 本研究發(fā)現(xiàn)3組牦牛直腸細(xì)菌區(qū)系Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均無顯著差異，說明粗飼料品質(zhì)優(yōu)劣對牦牛直腸細(xì)菌區(qū)系豐富度和多樣性均無顯著影響，3種組合的飼糧均可使直腸細(xì)菌區(qū)系保持較穩(wěn)定水平，且隨著GI降低，直腸細(xì)菌區(qū)系多樣性也有增加的趨勢。李蔣偉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，給早期斷奶藏羊飼喂不同精粗比飼糧，其小腸細(xì)菌多樣性和豐度均呈現(xiàn)不同程度變化，這與本研究結(jié)果不一致，可能是本試驗飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)水平、碳水化合物水平一致，且兩個試驗中動物種類不同且采樣部位不同造成的。

本試驗研究表明，在門水平上不同組合飼糧腸道細(xì)菌區(qū)系豐度最高的為厚壁菌門，其次為擬桿菌門，這與以往的研究結(jié)果一致[30]。厚壁菌門中的大多數(shù)細(xì)菌能降解纖維素，擬桿菌門中的細(xì)菌可提高碳水化合物利用率[31]，本試驗中3組間細(xì)菌區(qū)系門水平豐度無顯著差異，可能是3組試驗飼糧纖維水平相近且碳水化合物平衡指數(shù)一致的原因。瘤胃球菌屬中的某些細(xì)菌可合成并分泌大量的纖維素酶和半纖維素酶[32]，降解飼料中的纖維素和半纖維素。 本試驗中，在屬分類水平上，直腸中瘤胃球菌-UCG-005、理研菌科-RC9-gut-group豐度最高；3組間直腸細(xì)菌區(qū)系在屬水平上差異不顯著。瘤胃中相對豐度較高的厚壁菌門和擬桿菌門可降解碳水化合物和纖維素，破壞植物細(xì)胞壁，從而實現(xiàn)對纖維素的分解發(fā)酵導(dǎo)致到達(dá)直腸的纖維素較少。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)在大腸中瘤胃球菌屬的相對豐度要顯著高于其他胃腸道部位，這與本研究結(jié)果一致。

3.3 牦牛瘤胃和直腸細(xì)菌功能預(yù)測

瘤胃菌群與腸道細(xì)菌區(qū)系的豐度、功能與宿主緊密聯(lián)系，瘤胃細(xì)菌與腸道細(xì)菌分解纖維素與淀粉等物質(zhì)，參與機(jī)體代謝并為宿主提供養(yǎng)分[34-35]。本試驗中，細(xì)菌基因功能主要富集在代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過程和環(huán)境處理四大功能類群上。GI為7.19的玉米青貯-苜蓿干草-精料組合飼糧有利于牦牛直腸能量代謝、聚糖生物合成和代謝，可能會促進(jìn)宿主脂肪沉積；GI為1.31的玉米青貯-燕麥干草-精料組合飼糧組牦牛瘤胃脂質(zhì)代謝通路富集顯著，說明飼喂燕麥干草可促進(jìn)牦牛瘤胃微生物脂質(zhì)代謝。而直腸糞便微生物更趨向于氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能通路的富集，這與已報道的奶牛胃腸道微生物功能研究結(jié)果相符[36]。本試驗結(jié)果表明，在CBI一致的情況下，GI最高組的牦牛直腸細(xì)菌功能在能量代謝通路上富集，說明粗飼料品質(zhì)越好，對牦牛能量代謝影響越大。

4 結(jié) 論

不同GI與CBI組合飼糧對瘤胃細(xì)菌區(qū)系組成有顯著影響，但是直腸細(xì)菌區(qū)系組成多樣性卻不受其影響；隨著GI的降低有增加瘤胃細(xì)菌群落豐富度的趨勢，GI越高越有利于牦牛脂肪沉積。在保持CBI一致的情況下，在實際生產(chǎn)中可以考慮將苜蓿干草部分替換為燕麥秸稈和小麥秸稈，以降低舍飼成年牦牛的養(yǎng)殖成本和提高瘦肉率。