逄淯婷，張渝潔，唐瑋琦，王 巖，邢晉祎

(1.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨沂 276005；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130)

瑯琊雞為山東地方優(yōu)良家禽品種，具有體格較小、肉味鮮美、抗病力強(qiáng)、產(chǎn)蛋較多、適應(yīng)性較好等優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)殡u胚具有發(fā)育周期短和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，常被用來(lái)作為研究胚胎發(fā)育和器官形成機(jī)制的試驗(yàn)材料[1]。雞胚發(fā)育過(guò)程中受多種基因調(diào)控，從而保證胚胎有序地進(jìn)行個(gè)體發(fā)育和組織分化。

Msh同源框2(Msh-homeobox 2,MSX2，又稱為HOX-8)基因是MSX同源盒基因家族成員之一，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)信號(hào)的真實(shí)靶點(diǎn)和Y染色體性別決定去框蛋白2(sex determining region Y-box 2，SOX2)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，在各種細(xì)胞和組織的增殖分化中起著重要作用；MSX2基因參與多種組織的器官發(fā)生和發(fā)育過(guò)程，包括顱面組織、肢體、心臟、牙齒、軟骨和神經(jīng)嵴衍生物[2-6]。研究表明，MSX2基因在多種胚胎組織中都有表達(dá)，涉及到上皮-間充質(zhì)相互作用和模式形成；在發(fā)育中的雞肢芽中，MSX2基因在腦神經(jīng)嵴源性組織遷移后間充質(zhì)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，在指導(dǎo)肢體中胚層生長(zhǎng)和模式形成中起著關(guān)鍵作用[7]。MSX2蛋白是一種轉(zhuǎn)錄抑制物，可在正常顱面形態(tài)發(fā)生所需的神經(jīng)嵴源性細(xì)胞的存活和凋亡之間建立平衡[8]。因此，MSX2被認(rèn)為是組織發(fā)育和許多器官形成的重要基因[9]。目前，對(duì)MSX2基因的研究主要集中在小鼠和人上，盡管雞MSX2基因序列已被克隆，且對(duì)其在雞肢芽中的表達(dá)進(jìn)行了初步研究，但是瑯琊雞MSX2基因的結(jié)構(gòu)及在不同發(fā)育階段雞胚中的表達(dá)水平鮮見(jiàn)報(bào)道。雞胚心臟和肝臟是發(fā)育較早的器官，對(duì)后續(xù)胚胎正常發(fā)育起著關(guān)鍵作用。鑒于此，本研究以瑯琊雞胚為試驗(yàn)材料，克隆MSX2基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)和雞胚發(fā)育性表達(dá)變化分析，以期為進(jìn)一步研究MSX2基因的功能和挖掘瑯琊雞的利用價(jià)值提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

80枚瑯琊雞種蛋購(gòu)自山東瑯琊雞種業(yè)有限公司，用新潔爾滅溶液噴霧消毒后孵化。孵化條件：前期(1～10 d)控制孵化箱溫度在38.0～38.2 ℃，后期(11～19 d)控制孵化箱溫度在37.8～38.0 ℃，整個(gè)孵化期濕度控制在50%～65%，翻蛋周期為120 min。

分別于孵化期第1、2、3、4、5、6、9、12、15、18天(標(biāo)記為E1、E2、E3、E4、E5、E6、E9、E12、E15、E18)同一時(shí)間選取大小一致、發(fā)育良好的胚蛋6枚，E1～E6采集整胚，E9、E12、E15、E18分別采集心臟和肝臟組織放入1.5 mL凍存管中液氮速凍。

1.2 主要試劑

Trizol、TIANSeq M-MLV均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR產(chǎn)物快速純化回收試劑盒購(gòu)自北京蓋寧金諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×SYBR Fast qPCR Mix和LATaq酶均購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ均購(gòu)自原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

用Trizol試劑按照說(shuō)明書(shū)步驟提取雞胚總RNA，并檢測(cè)其質(zhì)量；用TIANSeq M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank中雞MSX2基因mRNA序列(登錄號(hào)：NM_204559)，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)MSX2基因克隆引物和表達(dá)譜引物，以β-actin(登錄號(hào)：NM_205518)為管家基因，引物序列見(jiàn)表1。引物均由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 引物序列信息

1.5 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

利用E18胚齡肝臟cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25 μL：10×LA Buffer 2.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)0.8 μL，dNTP 2 μL，cDNA模板1 μL，LATaq酶(1 U/L) 0.2 μL，三蒸水18.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

對(duì)鑒定正確的PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物快速純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收。回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體，16 ℃連接30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)12～15 h。挑選白色菌落，接種在3 mL LB培養(yǎng)液中(含3 μL Amp)，在37 ℃搖菌培養(yǎng)13～15 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，挑取至少3個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒委托青島派森諾基因科技有限公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行拼接后，用DNAStar軟件尋找MSX2基因開(kāi)放閱讀框，預(yù)測(cè)氨基酸序列，并與其他動(dòng)物MSX2氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)；運(yùn)用Mega 10.2.5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用ProtParam在線工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的理化性質(zhì)；運(yùn)用PSORT Ⅱ Prediction在線工具(https:∥psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的亞細(xì)胞定位；利用SignalP 5.0在線工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的信號(hào)肽；運(yùn)用TMHMM 2.0在線工具(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的跨膜區(qū)；利用NetPhos 3.1在線工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的磷酸化位點(diǎn)；采用NetNGlyc 1.0在線工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的N-糖基化位點(diǎn)；采用YinOYang 1.2在線工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的O-糖基化位點(diǎn)；利用SOPMA在線工具(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL在線工具(https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)MSX2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MSX2基因表達(dá)譜

以E1～E6的整胚和E9、E12、E15、E18的肝臟和心臟組織cDNA為模板，進(jìn)行MSX2基因不同發(fā)育階段表達(dá)譜分析，利用SYBR Green Ⅰ染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。 PCR反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR Fast qPCR Mix 12.5 μL，cDNA(8倍稀釋)1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，無(wú)菌超純水補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(退火溫度見(jiàn)表1)20 s，72 ℃延伸1 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值用β-actin管家基因進(jìn)行校正，用2-△△Ct法計(jì)算MSX2基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0軟件采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Duncan氏進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MSX2基因克隆和序列分析

MSX2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示一條長(zhǎng)約800 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期相符。 經(jīng)克隆測(cè)序和序列拼接分析后確認(rèn)瑯琊雞MSX2基因序列長(zhǎng)度為818 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?80 bp，共編碼259個(gè)氨基酸。MSX2基因核苷酸序列與GenBank中原雞MSX2基因序列(登錄號(hào)：NM_204559)一致性為100%。

2.2 MSX2氨基酸序列相似性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

由表2可知，瑯琊雞MSX2氨基酸序列與日本鵪鶉、禿鷹和倉(cāng)鸮相似性最高，均為99.23%，與其他鳥(niǎo)類氨基酸序列相似性均在97%以上， 與黃喉擬水龜、河口鱷、綿羊、牛、豬、小鼠和大鼠的相似性也在80%以上，但與人、兩棲類和山羊的相似性均在80%以下。說(shuō)明MSX2在物種間具有一定的保守性。由圖2可知，瑯琊雞與日本鵪鶉的MSX2聚為一類，表明瑯琊雞與日本鵪鶉親緣關(guān)系較近，與哺乳類和兩棲類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與氨基酸序列比對(duì)結(jié)果一致。

1,陰性對(duì)照；2,MSX2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M，DL2000 DNA Marker1，Negative control;2,PCR amplification product of MSX2 gene；M，DL2000 DNA Marker圖1 MSX2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of MSX2 gene

表2 瑯琊雞和其他動(dòng)物MSX2氨基酸序列相似性

圖2 瑯琊雞MSX2氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of MSX2 in Langya chickens

2.3 MSX2蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 蛋白理化性質(zhì) MSX2蛋白分子質(zhì)量為28.24 ku，理論等電點(diǎn)為9.71，由259個(gè)氨基酸組成，其中正電荷氨基酸殘基為34個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基為23個(gè)(表3)。MSX2蛋白消光系數(shù)為21 430，不穩(wěn)定系數(shù)為57.55，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為68.30，總平均親水性為-0.530，屬于親水性蛋白。

表3 瑯琊雞MSX2蛋白氨基酸組成

2.3.2 亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽和跨膜域預(yù)測(cè) 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，MSX2蛋白大部分分布在細(xì)胞核(60.9%)，少量分布在線粒體(13.0%)、細(xì)胞質(zhì)(13.0%)、細(xì)胞骨架(8.7%)和分泌系統(tǒng)囊泡(4.3%)中。信號(hào)肽和跨膜域預(yù)測(cè)顯示，MSX2蛋白不存在信號(hào)肽和跨膜域，不屬于分泌蛋白和跨膜蛋白。

2.3.3 磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 磷酸化預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MSX2蛋白中有37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為8個(gè)蘇氨酸、27個(gè)絲氨酸及2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，為蛋白質(zhì)激酶磷酸化的位點(diǎn)(圖3)。糖基化位點(diǎn)分析表明，MSX2蛋白有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，位于第172位氨基酸處，其潛力值為0.7083(>0.5)(圖4)。MSX2蛋白在第5、31、66、115、139、142、143、220位氨基酸處有8個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，其潛力值分別為0.4157、0.4413、0.4324、0.4094、0.4071、0.5216、0.4907、0.4393，但只有第142位氨基酸的潛力值>0.05(圖5)。

圖3 瑯琊雞MSX2蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Phosphorylation site prediction of MSX2 protein in Langya chickens

圖4 瑯琊雞MSX2蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 N-glyoosylation site prediction of MSX2 protein in Langya chickens

圖5 瑯琊雞MSX2蛋白O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5 O-glyoosylation site prediction of MSX2 protein in Langya chickens

2.3.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) MSX2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈及β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成，占比分別為63.32%、28.19%、8.11%和0.39%(圖6)。MSX2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MSX2蛋白可與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中1ig7.1.C模板中56個(gè)氨基酸序列比對(duì)上，序列一致性為96.43%，其三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7。

2.4 MSX2基因在瑯琊雞雞胚和組織中的表達(dá)水平

由圖8可知，MSX2基因在瑯琊雞整胚中的相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)是從E1～E4逐漸增加，然后呈下降趨勢(shì)，且MSX2基因在E4時(shí)的表達(dá)水平極顯著高于E1、E2和E3(P<0.01)，在E5和E6時(shí)的表達(dá)水平極顯著高于E1和E2(P<0.01)；MSX2基因在E9～E18雞心臟中的表達(dá)趨勢(shì)是先下降后上升，且MSX2基因在E9時(shí)的表達(dá)水平極顯著高于E12、E15和E18(P<0.01)，而MSX2基因在E9～E18肝臟中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，且MSX2基因在E9時(shí)的表達(dá)水平顯著高于E12、E15和E18(P<0.05)。

3 討 論

MSX2是胚胎發(fā)育過(guò)程中重要的候選基因之一。本研究克隆得到了瑯琊雞MSX2基因CDS序列，相似性比對(duì)分析表明，MSX2基因與鳥(niǎo)類氨基酸序列相似性較高，說(shuō)明瑯琊雞MSX2基因在進(jìn)化中具有高度保守性，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果與其一致。一般來(lái)說(shuō)，序列間的相似性越高，它們是同源序列的可能性就越高，其親緣關(guān)系越近，蛋白功能的相似性也越高，推測(cè)MSX2蛋白在鳥(niǎo)類體內(nèi)具有相似的生物學(xué)功能。研究表明，MSX是HOX基因家族成員之一，人MSX由MSX1和MSX2 2種亞型組成，鼠類MSX由MSX1、MSX2和MSX3 3種亞型組成[10]。目前，已經(jīng)從雞肢芽cDNA文庫(kù)中分離到雞MSX1和MSX2基因，其中MSX2基因編碼1個(gè)約3 kb的mRNA轉(zhuǎn)錄子[11-12]。原位雜交和斑點(diǎn)雜交分析表明，MSX2基因在肢體芽中胚層以時(shí)間和空間的方式表達(dá)，且在雞肢體芽發(fā)育的幾個(gè)早期階段都有表達(dá)[13]。

MSX2基因在胚胎發(fā)育和多器官形成中起著重要作用，在體內(nèi)控制著細(xì)胞的增殖和分化，MSX2基因表達(dá)異?；蛲蛔儠?huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響[10]，MSX2缺陷小鼠顯示骨祖細(xì)胞增殖減少，顱骨骨化缺損和顱骨孔持續(xù)存在[14]。同時(shí)，小鼠MSX2基因敲除后，小眼球畸形，晶狀體早期發(fā)育遲緩和異常[15-16]。最新研究表明，MSX2和特異性蛋白6(specificity protein 6，Sp6)協(xié)同作用形成了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)，在牙齒發(fā)育的后期階段控制成釉細(xì)胞的生命周期[17]，MSX2可能在生理和病理?xiàng)l件下限制牙釉質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，MSX2基因缺陷會(huì)導(dǎo)致牙釉質(zhì)缺陷和牙齒嚴(yán)重磨損，所以MSX2基因在調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)質(zhì)量方面發(fā)揮著重要作用[18-19]。據(jù)報(bào)道，MSX2基因在癌細(xì)胞中通過(guò)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化侵襲鄰近組織中發(fā)揮重要作用，MSX2基因的表達(dá)失調(diào)可能與子癇前期有關(guān)[2]，且MSX2基因在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，可能成為結(jié)直腸癌治療的新的預(yù)后因子和治療靶點(diǎn)[20]。最近研究發(fā)現(xiàn)，MSX2是一種新的人類造血調(diào)節(jié)因子，MSX2缺失可促進(jìn)造血干細(xì)胞生成造血細(xì)胞[6]；MSX2還是合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞譜系的一個(gè)抑制因子，它在決定細(xì)胞命運(yùn)、控制人類胎盤發(fā)育和疾病中起著關(guān)鍵作用[21]。 MSX2是血管鈣化的關(guān)鍵因素，并與鈣化過(guò)程中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和雙微體2 (murine double minute 2，MDM2)信號(hào)通路相關(guān)[22-23]。目前，MSX2基因在骨骼發(fā)育和異位鈣化方面的作用過(guò)程尚存在爭(zhēng)議，以上研究結(jié)果為理解MSX2基因在動(dòng)物胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中的調(diào)控機(jī)制以及疾病的治療提供了一個(gè)新視角。

MSX2基因可以調(diào)控山羊毛囊發(fā)育周期[24]，能促進(jìn)傷口誘導(dǎo)的小鼠毛囊再生[25]。研究發(fā)現(xiàn)，在山羊真皮毛乳頭細(xì)胞中MSX2基因表達(dá)量增加后細(xì)胞的增殖能力也增加，表明MSX2基因可能參與真皮毛乳頭細(xì)胞的增殖調(diào)控[26]；MSX2可通過(guò)保護(hù)小鼠次級(jí)心臟場(chǎng)前體祖先細(xì)胞來(lái)抑制心臟神經(jīng)嵴和心肌細(xì)胞的過(guò)度增殖，在血管形態(tài)形成中發(fā)揮著雙重作用[27]。一般來(lái)說(shuō)，雞胚在9胚齡時(shí)心臟和肝臟已經(jīng)發(fā)育良好。本研究結(jié)果表明，MSX2基因在9胚齡雞的心臟和肝臟中表達(dá)水平最高，推測(cè)MSX2基因在雞胚心臟和肝臟發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，與Coelho等[13]和曹春娜等[24]研究結(jié)果一致?？梢?jiàn)，MSX2基因的表達(dá)有時(shí)間和空間的差異，且其表達(dá)水平在不同物種的不同發(fā)育階段存在異同或者可能因細(xì)胞類型和細(xì)胞分化階段而異。目前，對(duì)MSX2基因的研究大多數(shù)集中在小鼠和人類疾病方面，本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究MSX2基因的結(jié)構(gòu)和功能以及雞胚發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到了瑯琊雞MSX2基因的部分核苷酸序列，對(duì)其基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)MSX2基因在不同物種中具有較高的保守性；MSX2基因?qū)Φ?天整胚，以及第9天胚胎中心臟和肝臟的發(fā)育起著重要作用。