謝書瓊，馬士龍，唐 嬌，劉益麗，江明鋒

(1.西南民族大學(xué),青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部和四川省重點(diǎn)實驗室，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是高寒地區(qū)特有牛種，主要分布于青海、西藏、甘肅西北部、四川西部、新疆南部和云南香格里拉等地[1]。牦牛素有“高原之舟”的美稱，一直以來為高原地區(qū)的牧民提供了吃、住、行等有效生活保障和經(jīng)濟(jì)來源[2]。近些年，有研究發(fā)現(xiàn)牦牛在長期自然選擇過程中為適應(yīng)高海拔、高寒低氧獨(dú)特的生存環(huán)境，其感官知覺、能量代謝和缺氧相關(guān)的組織器官和基因調(diào)控都出現(xiàn)了明顯的特異性[3]。鑒于此，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用RNA-Seq二代轉(zhuǎn)錄組測序?qū)﹃笈Ｐ呐K、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦[4]、肌肉[5]、睪丸[6]、卵巢[7]等多個組織器官進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，心臟和肺臟是適應(yīng)高原缺氧轉(zhuǎn)錄變化的關(guān)鍵器官；對于營養(yǎng)代謝器官復(fù)胃的研究中絕大多數(shù)傾向于牦牛瘤胃微生物群落的分析；而關(guān)于牦牛皺胃研究較少。目前，對牦牛皺胃的研究集中在其形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)的研究[8-9]，如魯延剛[10]對牦牛皺胃組織結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)及其黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞的動態(tài)分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)牦牛皺胃黏膜中存在比其他非高原反芻動物更豐富的淋巴組織，使得牦牛有更強(qiáng)的黏膜免疫功能和抵抗外來病原侵襲的能力。

牦牛皺胃不僅能分泌胃酸以消化食物中的蛋白質(zhì)和脂肪，還分泌具有抗酸、抗胃蛋白酶能力的溶菌酶[11-12]，以消化從瘤胃和網(wǎng)胃進(jìn)入皺胃的微生物。皺胃的功能實現(xiàn)是一個復(fù)雜的過程，涉及到大量基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此探究牦牛皺胃分子機(jī)制需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究。二代測序技術(shù)雖然通量很高，成本低廉，但是測序時間長、讀長短、末端質(zhì)量差讓其應(yīng)用有所局限[13]。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，以PacBio測序為代表的第3代基因測序技術(shù)逐漸興起，美國太平洋生物科學(xué)公司研發(fā)的單分子實時(single molecule real time，SMRT)測序技術(shù)應(yīng)用了邊合成邊測序的原理，并以SMRT芯片為測序載體[14]。PacBio Seque1系統(tǒng)相比前代RS Ⅱ系列測序儀，不僅大大簡化了建庫步驟，在測序通量上也大為提高，周期更短，測序成本更低[15]。本研究應(yīng)用PacBio SMRT技術(shù)對牦牛皺胃全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，以期為后續(xù)深入了解牦牛皺胃生物功能、分子機(jī)制及相關(guān)功能基因提供理論支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗選用四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣的1頭4歲健康麥洼公牦牛，飼養(yǎng)方式為傳統(tǒng)放牧；試驗動物集中屠宰后，用無菌手術(shù)剪剪下小塊牦牛皺胃組織，DEPC水沖洗后，對材料進(jìn)行編號，并分裝于特定的2 mL凍存管中，立即投入液氮中保存。

1.2 主要試劑與儀器

mirVanaTMmiRNA ISOlation Kit(Ambion-1561)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；SMRTbellTMTemplate Prep Kit 1.0-SPv3、PacBio Sequel Sequencing Kit 3.0測序系統(tǒng)均購自太平洋生物科學(xué)公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取和高通量測序 使用mirVanaTMmiRNA ISOlation Kit提取樣品總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解程度及污染；利用NanoDrop檢測RNA的純度(D260 nm/D280 nm值)；采用Qubit對RNA濃度進(jìn)行精確定量；利用Agilent 2100 Bioanalyzer精確檢測RNA的完整性。使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用SMRTbellTMTemplate Prep Kit 1.0-SPv3構(gòu)建文庫，使用PacBio Sequel Sequencing Kit 3.0測序系統(tǒng)進(jìn)行測序，得到樣本雙端數(shù)據(jù)。牦牛皺胃全長轉(zhuǎn)錄組測序工作主要由歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司協(xié)助完成。

1.3.2 全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理和校正評估 對庫檢合格文庫運(yùn)用PacBio Sequel系統(tǒng)進(jìn)行測序，PacBio SMRT為單條核苷酸鏈多次滾環(huán)測序，測序過程中產(chǎn)出的Polymerase reads去掉接頭(adapter)序列后的有效插入片段稱為子序列(subreads)，三代測序的原始子序列數(shù)據(jù)(raw subreads)為bam格式序列。利用SMRT Link v 6.0.0[16]分析包中的Isoseq3[17]分析流程對原始子序列進(jìn)行質(zhì)控分析。Isoseq3分析步驟包括：①通過分析原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行相互比對和質(zhì)量校正，得到循環(huán)一致性序列(circular consensus sequence,CCS)；②利用Isoseq3調(diào)用去接頭軟件lima以去除測序引物和標(biāo)簽序列(barcodes)；③利用Isoseq3程序的聚類(cluster)以去除poly A尾和嵌合體結(jié)構(gòu)，將相似的序列進(jìn)行聚類，生成全長非嵌合(full-length non-chimera,FLNC)的一致性序列；④利用Isoseq3的拋光(polish)命令對FLNC序列進(jìn)行打磨糾錯產(chǎn)生非冗余的一致性序列，根據(jù)準(zhǔn)確度閾值分為高質(zhì)量(high quality，HQ)和低質(zhì)量 (low quality，LQ)的Isoform序列。

將獲得的高質(zhì)量Isoform序列利用SQANTI[18]軟件對非冗余轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行質(zhì)控和結(jié)果注釋優(yōu)化，SQANTI軟件分析主要包括：參考基因組比對、去冗余分析、SQANTI質(zhì)控分析、SQANTI過濾分析、新基因預(yù)測和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化。 通過軟件minimap2[19]將高質(zhì)量Isoforms序列與參考基因組進(jìn)行比對。將比對結(jié)果通過Cupcake ToFU在identify=0.85下進(jìn)一步去冗余得到非冗余轉(zhuǎn)錄本序列。利用SQANTI軟件的sqanti_filter2.py程序包對校正后的非冗余轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步過濾，以刪除一些建庫測序中產(chǎn)生的假陽性序列信息，獲取過濾后的Unigenes。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組序列功能注釋 采用Diamond和HMMER3等軟件進(jìn)行比對，對牦牛皺胃全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能注釋，從而得到非冗余數(shù)據(jù)庫(non-redundant protein database,NR)、蛋白質(zhì)真核同源(clusters of eukaryotic orthologous groups,KOG)、基因本體論(gene ontology,GO)、蛋白質(zhì)序列(swiss-prot protein database,Swiss-Prot)、直系同源蛋白分組比對(evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups,eggNOG)、東京基因與基金組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、Pfam數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫注釋。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組序列的生物信息學(xué)分析 將非冗余轉(zhuǎn)錄本序列比對(BLAST)到動物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(animal transcription factor database,AnimalTFDB)，選取比對最好的一條作為該非冗余轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)家族注釋信息。用軟件ESTScan[20]預(yù)測其編碼區(qū)，得到其編碼序列(CDS)(序列方向5′→3′)和氨基酸序列。使用MISA[21]和Primer 3.0[22]軟件進(jìn)行簡單重復(fù)序列(SSR)分析，對單核苷酸最少重復(fù)次數(shù)為10；二核苷酸最少重復(fù)次數(shù)為6；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)均為5，獲得牦牛皺胃轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)。通過軟件Astalavista[23]檢測樣本中存在的可變剪切 (alternative splicing,AS)。

2 結(jié) 果

2.1 全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計

PacBio SMRT測序統(tǒng)計結(jié)果顯示，牦牛皺胃全長轉(zhuǎn)錄組共獲得14 467 420條子序列，總堿基數(shù)為48 382 430 732 bp，最長序列長度為270 809 bp，最短序列長度為51 bp，子序列平均序列長度為3 344.23 bp(表1)。

原始子序列質(zhì)量低，冗余程度高,且存在嵌合體。首先，通過質(zhì)控分析得到CCS reads 296 840條，帶有5′-和3′-引物接頭的全長序列(FL)為278 053條，帶有5′-和3′-引物接頭且不含嵌合體的全長序列277 712條，包含5′-引物、3′-引物和3′-端poly A尾且不存在嵌合體序列的FLNC序列277 402條，占CCS序列的93.45%。對得到的FLNC序列進(jìn)行聚類分析，然后借助arrow算法進(jìn)行打磨糾錯分析，最終獲得高質(zhì)量的Isoform序列。質(zhì)控得到高質(zhì)量序列15 669條。 經(jīng)過SQANTI分析去冗余后得到非冗余轉(zhuǎn)錄本序列11 104條，進(jìn)一步對校正后的非冗余轉(zhuǎn)錄本過濾以刪除一些建庫測序中產(chǎn)生的假陽性序列信息，獲取過濾后的8 556條Unigenes。

2.2 非冗余轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫注釋

將獲得的8 556條Unigenes通過7個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，與NR庫比對，共有8 544條(99.86%)Unigenes被注釋，占比最多；其次是eggNOG數(shù)據(jù)庫，共有8 491條(99.24%)Unigenes被注釋；得到注釋結(jié)果數(shù)量最少的是KEGG數(shù)據(jù)庫，只有1 721條(20.11%)；而在Swiss-Prot、KOG、GO、Pfam數(shù)據(jù)庫中，分別有8 475(99.05%)、6 572(76.81%)、7 725(90.29%)、8 162(95.40%)條Unigenes被注釋(表2)。

表2 各數(shù)據(jù)庫注釋統(tǒng)計表

2.2.1 NR注釋庫 在NR數(shù)據(jù)庫共有8 544條Unigenes被注釋，其中有34.7%被注釋到野牦牛(Bosmutus)上，22.93%被注釋到黃牛(Bostaurus)上，6.38%被注釋到美洲草原野牛(Bisonbisonbison)上，有3.91%、2.97%、2.45%、1.52%、1.25%、1.17%、1.17%的Isoforms分別在瘤?！咙S牛(Bosindicus×Bostaurus)、亞洲水牛(Bubalusbubalis)、瘤牛(Bosindicus)、中華白海豚(Sousachinensis)、綿羊(Ovisaries)、智人(Homosapiens)、東歐馬鹿(Cervuselaphushippelaphus)上被注釋(圖1)。

圖1 NR庫前十物種分布圖Fig.1 Distribution map of top 10 species in NR library

2.2.2 KOG數(shù)據(jù)庫注釋 在KOG數(shù)據(jù)庫中有6 572條Unigenes被注釋，分別被注釋到25個分類中，其中在一般功能預(yù)測中被注釋的Unigenes最多(1 044條)，其次是翻譯后修飾、蛋白折疊和分子伴侶(880條)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(816條)，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)(555條)，而最少的是細(xì)胞運(yùn)動性功能(17條)(圖2)。

2.2.3 GO功能注釋 在GO數(shù)據(jù)庫中共有7 725條Unigenes被注釋，可分為三大類：生物過程、細(xì)胞組分、分子功能。3個大類又注釋到52個小類。在生物過程中的23個小類里以細(xì)胞過程(6 276條)、單生物過程(5 254條)、代謝過程(4 583條)、生物調(diào)節(jié)(4 045條)、生物過程調(diào)節(jié)(3 754條)定位的居多，細(xì)胞殺傷功能定位最少(62條)；細(xì)胞組分中以細(xì)胞(7 056條)、細(xì)胞部分(7 049條)、細(xì)胞器(5 906條)、細(xì)胞器部分(4 325條)、膜結(jié)構(gòu)(3 598條)定位居多，以細(xì)胞外基質(zhì)(35條)、細(xì)胞外基質(zhì)部分(35條)定位最少；在分子功能中以結(jié)合活性(5 091條)、催化活性(2 918條)居多，以通道調(diào)節(jié)器活性(4條)、受體調(diào)節(jié)活性(4條)最少(圖3)。

圖2 KOG功能分類圖Fig.2 KOG functional classification diagram

圖3 GO功能分類圖Fig.3 GO function classification diagram

2.2.4 KEGG功能注釋 在KEGG數(shù)據(jù)庫中共有1 721條Unigenes被注釋，包含了細(xì)胞過程、環(huán)境信息加工、遺傳信息加工、人類疾病、新陳代謝、生物體系統(tǒng)6條一級通路和42條二級通路。其中基因數(shù)量多的有遺傳信息加工里的翻譯(284條)、折疊分類和降解(176條)、轉(zhuǎn)錄(116條)；細(xì)胞過程中的運(yùn)輸和分解代謝(153條)居多；生物體系統(tǒng)中的消化系統(tǒng)(149條)居多，這可能與皺胃是牦牛的消化器官有關(guān)。基因數(shù)量最少的是傳染?。杭纳x病(1條)(圖4)。

圖4 Unigenes的KEGG功能分類Fig.4 KEGG functional classification of Unigenes

2.3 轉(zhuǎn)錄因子注釋分析

根據(jù)注釋結(jié)果，本次共注釋得到的943個轉(zhuǎn)錄因子，分布在51個轉(zhuǎn)錄因子家族。其中轉(zhuǎn)錄因子較多的家族有zf-C2H2(157個)、bHLH(76個)、Homeobox(67個)、MYB(62個)，而CSL、E2F、HTH、NCU-G1、NF-YA、Nrf1、P53、RFX、zf-BED家族轉(zhuǎn)錄因子最少，均只有1個(圖5)。

2.4 編碼區(qū)預(yù)測

利用軟件ESTScan預(yù)測其蛋白編碼區(qū)，結(jié)果顯示共有8 544個基因片段可視為蛋白編碼區(qū)，片段大小主要集中在400～1 600 bp(圖6)。

2.5 SSR分析

SSR分析結(jié)果表明，共檢索出3 596個SSR位點(diǎn)；其中，單核苷酸重復(fù)占大多數(shù)(67.38%)，雙核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)分別占11.62%、20.22%、0.42%、0.17%和0.19%(圖7)。

2.6 可變剪接

通過可變剪接類型分析,牦牛皺胃轉(zhuǎn)錄本共有1 825個可變剪接事件，其中外顯子跳躍最多(876個)，其次是內(nèi)含子保留(382個)，外顯子互斥最少(88個)(圖8)。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子家族Unigenes分布圖Fig.5 Distribution map of transcription factor family Unigenes

圖6 編碼區(qū)序列長度分布圖Fig.6 CDS sequence length distribution diagram

Mono-，單核苷酸重復(fù)；Di-，雙核苷酸重復(fù)；Tri-，三核苷酸重復(fù)；Tetra-，四核苷酸重復(fù)；Penta-，五核苷酸重復(fù)；Hexa-，六核苷酸重復(fù)；5～8/9～12/13～16/17～20/21～24，重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)Mono-，Mono nucleotide motifs;Di-，Di nucleotide motifs;Tri-，Tri nucleotides;Tetra-，Tetra nucleotides;Penta-，Penta nucleotides;Hexa-，Hexa-nucleotide motifs;5-8/9-12/13-16/17-20/21-24，Repetition times of repetition unit圖7 SSR類型統(tǒng)計結(jié)果圖Fig.7 SSR motif statistical results

A3SS，可變3′-端剪切；A5SS，可變 5′-端剪切；ES，外顯子跳躍；IR，內(nèi)含子保留；MXE，外顯子互斥A3SS，Alternative 3′-splice sites；A5SS，Alternative 5′-splice sites；ES：Exons skipping；IR，Intron retention；MXE，Mutually exclusive exons圖8 不同剪接事件頻數(shù)統(tǒng)計圖Fig.8 Statistical diagram of frequency of different splicing class

3 討 論

2015年10月，PacBio公司推出全新升級的PacBio Sequel測序系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有讀長長、通量高、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，無需打斷擴(kuò)增，直接讀取反轉(zhuǎn)錄的全長cDNA，能夠有效獲取高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本全長序列，從而可準(zhǔn)確辨別產(chǎn)生可變剪接的外顯子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的準(zhǔn)確信息[24]。本研究利用PacBio Sequel系統(tǒng)對牦牛皺胃轉(zhuǎn)錄組全長進(jìn)行測序分析，共獲得14 467 420條子序列，平均子序列長度為3 344.23 bp，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組所獲得的組裝序列完整性較好。對比牦牛參考基因組后，利用NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、eggNOG、GO、和Pfam七大公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋分析，在8 556條Unigenes中，有8 544條獲得NR數(shù)據(jù)庫注釋；有6 572條獲得KOG數(shù)據(jù)庫注釋，分為25個功能組分；有7 725條被注釋到GO數(shù)據(jù)庫，有1 721條注釋到42個代謝通路。

2018年，王明成[25]采用PacBio公司的RS Ⅱ系統(tǒng)對家牦牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚和睪丸組織進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，得到約381 884條CCS序列，F(xiàn)LNC的轉(zhuǎn)錄本為251 712條，并將得到的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用于基因注釋分析。而本研究對牦牛皺胃組織進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序與分析，得到296 840條CCS序列，相較于王明成的結(jié)果，CCS序列少。由于單個組織樣本較多組織樣本混合測序得到序列更少，本研究得到277 402條FLNC并用于后續(xù)分析，對比顯示本研究得到更多的FLNC的轉(zhuǎn)錄本，說明新一代的Sequel系統(tǒng)更優(yōu)于前代RS Ⅱ測序系統(tǒng)，序列完整度較高，產(chǎn)生較少的嵌合體序列。

本研究將所得到的Unigenes與KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)其功能可分為25類，結(jié)果顯示較多基因富集到一般功能預(yù)測，翻譯后修飾、蛋白折疊和分子伴侶，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，說明牦牛皺胃的功能涉及多種蛋白或酶的合成以及多種大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。在GO數(shù)據(jù)庫共有7 725條Unigenes被注釋，可劃分到3個大類共52個分支，GO功能富集顯示，三大類中分別是細(xì)胞過程、細(xì)胞、結(jié)合活性所富集基因最多，這與張春蘭[26]在羊上的研究結(jié)果相似。KEGG注釋到6個大類42個小類，其中涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、運(yùn)輸、分解以及消化系統(tǒng)的基因居多，這可能跟牦牛皺胃所具有的消化功能有關(guān)，在不斷地合成各種消化酶，可以消化食物、分解蛋白質(zhì)脂肪以及瘤胃和網(wǎng)胃進(jìn)入皺胃中的微生物[27]。

本次共注釋得到的943個轉(zhuǎn)錄因子，分布在51個轉(zhuǎn)錄因子家族。其中轉(zhuǎn)錄因子較多的家族有zf-C2H2(157個)、bHLH(76個)和Homeobox(67個)等。zf-C2H2鋅指基因是人類最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，也是哺乳動物最大的基因家族之一[28]；牦牛bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合、DNA模板化、肌肉器官發(fā)育以及神經(jīng)元分化等[29]，這可能與牦牛皺胃肌肉發(fā)育和皺胃細(xì)胞分化有關(guān)；Homeobox家族既在消化道發(fā)育過程中的內(nèi)胚層又在中胚層成分中表達(dá)，而且許多持續(xù)表達(dá)至成年，本研究正是從成年牦牛皺胃注釋到很多Homeobox家族轉(zhuǎn)錄因子，Hox基因家族的異常表達(dá)還可能導(dǎo)致先天性消化道畸形[30]。

牦牛皺胃編碼區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)共有8 544個基因片段可視為蛋白編碼區(qū)，而共有82條注釋到溶菌酶基因，其他的注釋到DNA聚合酶、RNA聚合酶、ATP酶家族等，這些基因序列可以為后期研究提供參考。從轉(zhuǎn)錄組中共檢測到3 596個SSR位點(diǎn)，其中單核苷酸重復(fù)最多67.38%，占大多數(shù)，二核苷酸、三核苷酸為重復(fù)單元的序列也較多，分別是11.62%、20.22%，而以四、五、六核苷酸為重復(fù)單元的SSR序列則較少，分別只有0.42%、0.17%、0.19%，說明要開發(fā)利用SSR序列作為分子標(biāo)記應(yīng)重點(diǎn)考慮單核苷酸重復(fù)SSR序列，其次為復(fù)雜SSR序列：二核苷酸和三核苷酸重復(fù)SSR序列。獲得的SSR分析結(jié)果可作為后期牦牛SSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。此外，本研究還獲得牦牛皺胃轉(zhuǎn)錄組1 825個可變剪接事件，其中外顯子跳躍最多。鮑晶晶等[31]通過研究綿羊不同發(fā)育階段背最長肌組織中可變剪接發(fā)現(xiàn)，外顯子跳躍最多，與本研究相似，說明可變剪接的發(fā)生對皺胃肌肉組織發(fā)育過程中形成的功能各異的蛋白質(zhì)起著重要作用。

4 結(jié) 論

本研究利用PacBio Sequel測序系統(tǒng)獲得了可靠的牦牛皺胃全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得14 467 420條子序列，平均子序列長度為3 344.23 bp，質(zhì)控得到CCS序列有296 840條，F(xiàn)LNC序列有277 402條。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、eggNOG、GO和Pfam七大數(shù)據(jù)庫對比注釋，分別注釋到8 544、8 475、1 721、6 572、8 491、7 725、8 162條Unigenes，通過轉(zhuǎn)錄因子注釋分析得到943個轉(zhuǎn)錄因子，分布在51個轉(zhuǎn)錄因子家族，編碼區(qū)預(yù)測到8 544個基因片段可視為蛋白編碼區(qū)，SSR分析檢索出3 596個SSR位點(diǎn)，得到1 825個可變剪接事件。本研究可為進(jìn)一步研究牦牛皺胃生物學(xué)特性、相關(guān)代謝途徑、信號通路及其分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。