王貞麗,王曉雯,付曉菁,張海霞,趙文文,陳雪紅

[摘要]目的? ?探討隱丹參酮（CPT）對肝癌細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響。 方法? ?HepG2細胞分別用不同濃度的CPT處理48 h，采用MTT法、乳酸脫氫酶釋放法和細胞劃痕法檢測細胞的生長和遷移能力，Annexin V FITC-PI染色后流式細胞分析術(shù)檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測caspase3、重鏈結(jié)合蛋白（BIP）和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（p-PERK）的表達水平。 結(jié)果? ?與陰性對照組相比，CPT作用后HepG2細胞的生長和遷移能力減弱（F=41.10～126.40，P<0.01），凋亡蛋白caspase3的活化水平升高（F=156.90，P<0.01）。15 μmol/L CPT可以使HepG2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白BIP和p-PERK的表達水平明顯下降（F=57.20、49.92，P<0.01）。結(jié)論? ?CPT對肝癌細胞的生長和遷移有抑制作用，并且能抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和促進凋亡。

[關(guān)鍵詞]隱丹參酮;Hep G2細胞;細胞增殖;細胞運動;細胞凋亡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

[中圖分類號]R284;R329.25

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2022）04-0602-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.128[HT]

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220822.1543.002.html;[JY]2022-08-2309：49：42

EFFECT OF CRYPTOTANSHINONE ON APOPTOSIS AND ENDOPLASMIC RETICULUM STRESS IN HEPATOMA CELLS

WANG Zhenli， WANG Xiaowen， FU Xiaojing， ZHANG Haixia， ZHAO Wenwen， CHEN Xuehong

（Quality Management Section of Qingdao Special Service Sanatorium Center of PLA Navy， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of cryptotanshinone （CPT） on apoptosis and endoplasmic reticulum stress in hepatoma cells.

Methods HepG2 cells were treated with different concentrations of CPT for 48 h. MTT assay， lactate dehydrogenase release assay， and wound healing assay were used to measure cell growth and migration abilities; flow cytometry was used to measure cell apoptosis rate after Annexin V FITC-PI staining; Western blot was used to measure the expression levels of caspase3， heavy chain-binding protein （BIP）， and protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase （p-PERK）.

Results Compared with the negative control group， the CPT treatment group had significant reductions in the growth and migration abilities of HepG2 cells （F=41.10-126.40，P<0.01） and a significant increase in the activation level of the apoptotic protein caspase3 （F=156.90，P<0.01）. CPT at a concentration of 15 μmol/L significantly reduced the expression levels of the endoplasmic reticulum stress proteins BIP and p-PERK in HepG2 cells （F=57.20，49.92;P<0.01）.

Conclusion CPT can inhibit the growth and migration of HepG2 cells， and it can also inhibit endoplasmic reticulum stress and promote apoptosis.

[KEY WORDS] cryptotanshinone; Hep G2 cells; cell proliferation; cell movement; apoptosis; endoplasmic reticulum stress

肝癌是一種常見的惡性腫瘤[1]。目前常用的肝癌化療藥物5-氟尿嘧啶和鉑類（順鉑）經(jīng)過多年臨床應用證實存在大量的副作用和不良反應。目前針對肝癌治療的化學藥物和新的靶向藥物的研究層出不窮，但化療藥物耐藥性和預后不良的弊端仍然存在。近年來，中醫(yī)藥以其療效顯著、副作用小、原料經(jīng)濟方便等特點，受到世界各國的高度關(guān)注[2]。因此，尋求療效優(yōu)越、不良反應小的中藥是肝癌治療的潛在方向。丹參作為一種中藥，廣泛應用于動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、高脂血癥、肝纖維化、慢性腎衰竭和婦科疾病等多種疾病的治療，無嚴重副作用[3]。丹參的水溶性成分具有良好活性，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其脂溶性成分也具有抗結(jié)直腸癌、前列腺癌和肺癌等腫瘤的作用[4-5]。隱丹參酮（CPT）是丹參的主要脂溶性提取物。有研究表明，CPT對多種類型的癌細胞有直接的細胞毒性作用[6-8]。本研究旨在探討CPT對肝癌細胞凋亡和目前報道較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料

CPT（晨光生物，中國陜西）;RPMI 1640（基諾，中國江蘇）;胎牛血清（Biological Industrie，以色列）;乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒（碧云天，中國上海）;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抗體試劑盒、cleaved caspase3、caspase3（CST，美國）;MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、PBS緩沖液、衣霉素（索萊寶，中國北京）;Annexin V FITC-PI凋亡試劑盒（BD，美國）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)肝癌HepG2細胞（來源于青島大學基礎醫(yī)學院細胞凍存庫）用含體積分數(shù)0.10胎牛血清和青霉素/鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細胞活性將HepG2細胞接種于96孔板中，12 h后加CPT處理，加藥濃度分別為0、1、5、10、15和30 μmol/L。CPT處理48 h后，加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后加入Formazan溶解液，用酶標儀檢測570 nm波長處每孔吸光度。

1.2.3LDH釋放法檢測細胞毒性HepG2細胞加CPT處理（其濃度分別為0、1和15 μmol/L），作用48 h后檢測LDH釋放量，用酶標儀檢測490 nm波長處每孔吸光度。

1.2.4細胞劃痕實驗將HepG2細胞接種于背面畫好橫線的6孔板中，培養(yǎng)12 h后用槍頭垂直于直線劃痕，以PBS清洗，加CPT處理（CPT用無血清培養(yǎng)液稀釋，濃度分別為0、1和15 μmol/L）。置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2無菌環(huán)境中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、48 h時取樣，拍照。

1.2.5Western blot法檢測凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達收集CPT（0、1和（或）15 μmol/L）作用48 h后的HepG2細胞，提取蛋白。取30 μg蛋白，于搖床上用1 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入cleaved caspase3、重鏈結(jié)合蛋白（BIP）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（p-PERK）一抗（1∶1 000），4 ℃過夜，以PBST清洗3次，加入二抗（1∶10 000），室溫搖床孵育2 h，以PBST清洗，滴加ECL化學發(fā)光液在顯影儀中進行化學發(fā)光成像。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡分別用濃度為1、15 μmol/L的CPT處理HepG2細胞48 h，然后用預冷PBS輕洗細胞2次，消化細胞。取1×104個細胞用Binding Buffer重懸后置于1.5 mL EP管中，每管加入5 μL FITC輕輕混勻，避光孵育15～30 min。加入5 μL PI和400 μL Binding Buffer，上機檢測調(diào)亡細胞。最后使用Flow Jo軟件分析細胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計學分析

采用Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。本研究所有實驗均進行3次獨立實驗，取均值。所得數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s形式表示，組間比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計學檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1CPT對HepG2細胞生長和遷移的作用

MTT法檢測結(jié)果顯示，CPT對HepG2細胞生長的抑制作用是呈梯度的。與陰性對照組相比，10、15、30 μmol/L CPT組HepG2細胞的生存率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（F=126.40，P<0.001）（圖1A）。LDH釋放法檢測結(jié)果顯示，15 μmol/L CPT組HepG2細胞的LDH釋放量明顯升高，與陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（F=41.10，P<0.001）（圖1B）。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，細胞劃痕48 h后，與陰性對照組相比，15 μmol/L CPT組的閉合率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（F=96.18，P<0.001）（圖1C）。

2.2CPT對HepG2細胞凋亡的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組和1 μmol/L CPT組相比，15 μmol/L CPT組cleaved caspase3的表達水平增高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=156.90，P<0.001）（圖2A）。流式細胞分析術(shù)檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，15 μmol/L CPT組細胞凋亡率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=1 090.00，P<0.001）（圖2B、表1）。

2.3CPT對HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，15 μmol/L CPT組細胞中p-PERK和BIP蛋白的表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（F=57.20、49.92，P<0.001）;與1 μmol/L CPT組相比較，15 μmol/L CPT組細胞中BIP蛋白的表達水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（F=49.92，P<0.001）（圖3A）。在15 μmol/L CPT作用下，與未經(jīng)衣霉素預處理組相比，經(jīng)衣霉素預處理組HepG2細胞中BIP的表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=41.09，P<0.001）（圖3B）。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，CPT作為從丹參中提取的脂溶性單體，對腫瘤有很好的療效[7-9]。本文體外細胞學研究結(jié)果表明，CPT可以抑制HepG2細胞的生長，與陰性對照組相比，10、15、30 μmol/L CPT組HepG2細胞的生存率明顯下降。15 μmol/L的CPT可以破壞HepG2細胞的細胞膜，引起LDH釋放量明顯增加。另外，在細胞劃痕實驗中，相對于陰性對照組，15 μmol/L CPT組HepG2細胞的遷移水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義。上述結(jié)果證實CPT可以減弱HepG2細胞的生長和遷移能力。

CPT誘導的細胞生長和增殖抑制主要是由于細胞凋亡[10-11]。有研究表明，CPT可以誘導HeLa、DU145和Hep3B細胞凋亡，其機制主要是誘導凋亡蛋白caspase3的活化和抑制抗凋亡蛋白Bcl-xL等的表達[6，12-13]。CPT被普遍認為是一種有效的信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抑制劑。相關(guān)文獻報道，CPT可以快速抑制DU145細胞中STAT3 Tyr705的磷酸化，而后與細胞質(zhì)中的STAT3分子共定位，并通過直接結(jié)合到STAT3的SH2域來抑制STAT3二聚體的形成[12]。有文獻報道，STAT3可以調(diào)節(jié)細胞的生長和凋亡[13]。本研究結(jié)果表明，CPT可以活化細胞凋亡蛋白caspase3，從而誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種多功能細胞器，可以參與維持細胞穩(wěn)態(tài)和支持細胞存活[14-15]。外界的刺激可以使其內(nèi)部錯誤蛋白不斷積累，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[16]。當這種積累超過臨界閾值時，未折疊蛋白反應（UPR）補救信號轉(zhuǎn)導途徑會被激活，該途徑主要涉及3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜傳感器（IRE1α、PERK和ATF6）介導的通路[17-18]。相關(guān)研究表明，腫瘤細胞通過UPR適應低糖環(huán)境，促進腫瘤細胞的生存[19-21]。此外，有研究證實，UPR通過抑制炎癥和凋亡信號通路進行細胞保護[22-25]。本研究結(jié)果表明，CPT可以有效地抑制HepG2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。

綜上所述，CPT對HepG2細胞的生長和遷移有抑制作用，在促進HepG2細胞凋亡的同時可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。本研究為CPT作為一種有潛力的抗肝癌藥物提供了證據(jù)。

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（本文編輯馬偉平）