張舸 張宏 劉楊 李德國

摘要：依據(jù)GB 5009.28—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》，采用高效液相色譜法，對焙烤食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量進行同時測定。焙烤食品樣品被制備成粉末后，經(jīng)正己烷脫脂、水浴超聲提取、沉淀劑沉淀脫蛋白、離心等處理后，去除雜質(zhì)的溶液經(jīng)色譜柱分離紫外檢測器檢測后，根據(jù)保留時間定性，峰面積外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示：苯甲酸、山梨酸和糖精鈉3種被分析物，校準(zhǔn)曲線最佳線性范圍為0.5～100 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 8，檢出限均為0.005 g/kg，樣品加標(biāo)回收率范圍90%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）2%～8%。該方法具有線性關(guān)系良好、操作簡單、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點，適用于焙烤食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的同時檢測。

關(guān)鍵詞：苯甲酸；山梨酸；糖精鈉；高效液相色譜；焙烤食品

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20220420

Determination of Benzoic Acid Sorbic Acid and Saccharin Sodium in Baked Food by High Performance Liquid Chromatograhy

Zhang Ge1， Zhang Hong1， Liu Yang1， Li Deguo2

（ 1. Siping Product Quality Inspection Institute， Siping， Jilin 136000； 2. Gongzhuling Grain Bureau， Changchun， Jilin 136100 ）

Abstract： According to the national food safety standard for the determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in food （GB 5009.28—2016）， the contents of preservatives benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in baked food were determined simultaneously by HPLC. After the baked food sample was prepared into powder， the sample treated with n-hexane degreasing， water bath ultrasound， precipitant protein precipitation， centrifugal clarification， etc. After removing impurities， the solution was separated by chromatographic column and detected by ultraviolet detector. Qualitatively according to retention time and quantitative by peak area external standard method. The results showed that the best linear range of calibration curve for benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium was 0.5 ～ 100 mg/L， the linear correlation coefficient R was greater than 0.999 8， the detection limit was 0.005 g/kg， the recovery range was 90% ～ 110%， and the relative standard deviation （RSD） was 2% ～ 8%. The results showed that the method has the advantages of good linear relationship， simple operation， rapid and accurate. It is suitable for the simultaneous determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in baked food.

Key words： benzoic acid， sorbic acid， saccharin sodium， high performance liquid chromatography， baked food

苯甲酸及其鈉鹽和山梨酸及其鉀鹽在酸性條件下，對霉菌、酵母菌和許多好氣菌均有抑制作用，是食品中常用的防腐劑。由于苯甲酸和山梨酸水溶性差，大多以苯甲酸鈉和山梨酸鉀的形式添加到食品中，食品中這兩種防腐劑的含量是以苯甲酸和山梨酸計。長期過量食用苯甲酸，易發(fā)生蕁麻疹、哮喘及血管性水腫等一系列過敏癥狀。與苯甲酸相比，山梨酸毒性小，但防腐效果更好，被廣泛用于乳及乳制品、面包、糕點、餅干、果汁、果醬、醬醋菜和水產(chǎn)品等食品的防腐。糖精鈉即糖精是一種人工合成的甜味劑、增味劑，其甜度為蔗糖的200～300倍，但人過量攝入糖精會影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使食欲減退，而且糖精鈉還有致畸、致癌和致遺傳損害的可能性[1]。

苯甲酸（鈉）、山梨酸（鉀）和糖精鈉因其價格低廉，在食品工業(yè)被廣泛使用?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定：苯甲酸（鈉）和糖精鈉的使用范圍不包括焙烤食品，山梨酸（鉀）除了面包、糕點和餅干限量使用，其他的焙烤食品都不在使用范圍內(nèi)也只能限量使用。近年來，各地市場監(jiān)督監(jiān)督管理部門對糕點和餅干等焙烤食品抽檢結(jié)果顯示，苯甲酸（鈉）、山梨酸（鉀）和糖精鈉3種食品添加劑均有超范圍、超限量使用現(xiàn)象。不法生產(chǎn)企業(yè)、個人為了延長產(chǎn)品保質(zhì)期和降低成本，在焙烤食品中超量使用山梨酸，違規(guī)使用苯甲酸和糖精鈉，侵害消費者利益。因此，對焙烤食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定十分重要。

苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的國標(biāo)測定方法中有氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）。與HPLC法相比，GC法分離度和準(zhǔn)確度相對較差、操作復(fù)雜，且所用試劑乙醚毒性大，不利于檢驗人員的身體健康[2]。因此，本研究采用高效液相色譜法，同時測定焙烤類食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，以期為食品安全檢測部門提供有效檢驗方法及數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

苯甲酸（GBW（E）100006）、山梨酸（GBW（E）100007）、糖精鈉（GBW（E）100008）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：1 000 mg/L，中國計量科學(xué)研究院；甲醇（色譜級）：德國默克有限公司；焙烤食品陰性樣品：無任何添加劑的自制奶油蛋糕。

1.2 儀器設(shè)備

LC-20型高效液相色譜儀：配紫外檢測器，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；ME203型千分之一電子天平：梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；KQ-500DE型超聲波發(fā)生器：昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A型渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試劑配制

亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）：取26.5 g亞鐵氰化鉀，適量水溶解后，水定容至250 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：取55 g乙酸鋅少量水溶解后，加入30 mL冰乙酸，水定容至250 mL。

乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：取1.54 g乙酸銨少量水溶解后，水定容至1 000 mL，0.22 μm水相濾膜過濾。臨用前配制脫氣。

氨水溶液（1+99）：氨水1 mL加99 mL水。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 mg/L）：分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計）標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，用水定容至10 mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間0.002、0.004、0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL，用水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用現(xiàn)配。

單標(biāo)溶液的配制：分別吸取質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計）標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL，分別用水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為50.0 mg/L的單標(biāo)溶液。

1.5 色譜分析條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相：A為20 mmol/L乙酸銨，B為甲醇，VA∶VB=95∶5；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：230 nm。

1.6 樣品前處理

試樣制備：將樣品中半固態(tài)樣品部分用組織勻漿機勻漿，固體樣品部分用研磨機粉碎，攪拌均勻后，倒入組織勻漿機中和前者一起攪拌均勻。

試樣提?。悍Q取2.000 g樣品于50 mL離心管中，加10 mL正己烷，60 ℃水浴加熱5 min，不時輕搖，待脂肪溶解后，加25 mL氨水溶液（1+99），1 mL乙醇，渦旋混勻，50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后，再加入2.0 mL飽和硼砂溶液，搖勻后，加入2.0 mL亞鐵氰化鉀溶液、2.0 mL乙酸鋅溶液，混勻，8 000 r/min離心5 min，棄去有機相，水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，殘渣加20 mL水，渦旋混勻后50 ℃超聲5 min，8 000 r/min離心5 min，棄去有機相，水相轉(zhuǎn)移至同一50 mL離心管中，取適量上清液過0.22 μm濾膜，作為待測液。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照1.5的色譜分析條件，將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液從低濃度到高濃度進行測定，記錄保留時間和峰面積，每個濃度重復(fù)進樣2次，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制3種分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件及樣品前處理方法的選擇

2.1.1 紫外檢測波長的選擇

選擇最佳波長對于提高檢測結(jié)果的精確度和靈敏度具有重要意義[3]。將山梨酸、苯甲酸和糖精鈉的標(biāo)準(zhǔn)樣品在200～300 nm檢測波長處進行掃描，它們的最大吸收波長分別為254 、223 、202 nm，3種物質(zhì)在230 nm附近均具有理想吸收，故選用230 nm為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

甲醇可以改變流動相的極性，流動相的配比能改變組分分離情況，改善峰型，提高分離度[4]。固定其他實驗條件，選擇質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的混標(biāo)，在流動相配比（VA∶VB）分別為90∶10、93∶7、95∶5下進行分析，觀察3種被分析物的分離度和出峰時間。結(jié)果表明：隨著甲醇在流動相中比例的增大，分離度減少，出峰時間縮短，在VA∶VB為95∶5時，3種被分析物的分離效果和峰型均較好，在18 min內(nèi)能夠完成苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的分析。所以選擇體積比為95∶5的乙酸銨（0.02 mol/L）—甲醇混合液作為流動相。

2.1.3 沉淀劑的選擇

常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、氫氧化鈉等，選用106 g/L的亞鐵氰化鉀溶液和220 g/L的乙酸鋅溶液各2.0 mL時，處理液沉淀明顯，上清液清晰，可以最大限度地去除雜質(zhì)，滿足實驗要求[5-7]。

2.2 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉定性及定量分析

按照1.5的色譜分析條件，先將10.0 mg/L的混標(biāo)進樣分析，再將單標(biāo)質(zhì)量濃度為50.0 mg/L的3種被分析物分別進樣，根據(jù)它們的保留時間，確定3種物質(zhì)，色譜圖見圖1。

由圖1可知，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉獲得了良好的分離且互不干擾測定，樣品干擾少，峰形好。3種物質(zhì)的保留時間分別為9.679、13.590、17.723 min。

將試樣待測液注入液相色譜儀中，得到峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉 （以糖精計）的質(zhì)量濃度。

2.3 方法的線性關(guān)系

3種被分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

結(jié)果表明：苯甲酸和山梨酸在0.2～100 mg/L范圍內(nèi)，糖精鈉在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.999 8，符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F的要求。

2.4 檢出限測定

利用液相色譜相關(guān)軟件計算檢出限，以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的濃度為檢出限。在取樣量2 g，定容50 mL時，苯甲酸、山梨酸和糖精鈉（以糖精計）的檢出限均為0.005 g/kg。

2.5 準(zhǔn)確性和可靠性

2.5.1 加標(biāo)回收率和方法重復(fù)性測定

選擇方法測定底限、在糧食中的殘留量限量和任選一點3個水平，在陰性樣品中同時添加苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，按照1.5色譜條件每個水平進行6次重復(fù)實驗，添加濃度、檢測結(jié)果及方法重復(fù)性（RSD）測定結(jié)果見表2。

2.5.2 儀器重復(fù)性測定

選擇1、40 mg/L兩個質(zhì)量濃度的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)混合液注入色譜儀，在1.5色譜條件下重復(fù)進樣6次，計算RSD值，測定結(jié)果見表3。

從表2和表3可以看出，本方法三水平添加苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的回收率在90%～110%，方法和儀器重復(fù)性測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2%～8%。說明該方法檢測的準(zhǔn)確性和可靠性良好，符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/ T 27404—2008）要求。

3 結(jié) 論

選用正己烷、氨水—乙醇溶液、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硼砂去除脂肪和蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，樣品處理液的上層液澄清，上層液能順利通過濾膜，此樣品處理方法不僅干擾少、峰形好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，還可以降低柱壓、減少色譜柱的污染，延長其使用壽命。使用本方法要注意的是：標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)選用有效期內(nèi)的；苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液容易降解，不能放置過久，宜現(xiàn)配現(xiàn)用。實驗結(jié)果表明，本方法具有線性關(guān)系、準(zhǔn)確性、精密度好，出峰時間快、峰形好、分離度好等優(yōu)點，適用于烘焙食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的同時測定。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]周楠，丁紅梅，楊俊.高效液相色譜法測定藍(lán)莓酵素酒中山梨酸和糖精鈉含量的不確定度評定[J].糧食科技與經(jīng)濟，2020，45（8）：95-99.

[2]趙夢蕓，陳艷，袁婷婷，等.高效液相色譜技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用探討[J].糧食科技與經(jīng)濟，2020，45（5）：76-77.

[3]羅學(xué)平，魏曉惠，郭浩，等.反相HPLC同時快速測定茶飲料中的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉[J].中國茶葉加工，2008（3）：46-48.

[4]陳海紅，王益萍，沈仁富，等.超聲提取-高效液相色譜法測定豆制品中的苯甲酸、山梨酸和糖精鈉[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010（11）：2 734-2 735.

[5]車燕妮，蘇敬武，劉新榮.常溫液相色譜法快速測定食品中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息，2004，10（3）：309-310.

[6]徐燕，王家保，王冬梅.HPLC同時測定甜面醬中山梨酸、苯甲酸和糖精鈉[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，5（5）：613.

[7]王鋒.高效液相色譜法測定糕點中苯甲酸·山梨酸·糖精鈉含量的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（21）：8 889-8 890.