李運 李燕君 張國強 李紅玉 景明

【摘 要】 目的：利用高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）在負離子模式下對藏藥熏倒牛中的化學成分進行分析和鑒定。方法：采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（3.0 mm×150 mm，1.8μm）;以0.1%甲酸的乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫;流速為0.250 mL·min-1;進樣體積：2μL;柱溫為35 ℃;以電噴霧（ESI）離子源，負離子模式下采集數(shù)據(jù)，通過分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)和元素組成，結合文獻數(shù)據(jù)對照，分析推測所含化合物。結果： 通過分子離子峰和二級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)結合文獻數(shù)據(jù)鑒定了熏倒牛全草中的 25個化合物，包括 1個脂環(huán)族有機酸類、2個香豆素類、2個多酚類、1個蒽醌類及19個黃酮類化合物。結論：UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術為鑒別藏藥熏倒牛藥材中的化學成分提供快捷、準確的方法，其主要化學成分為黃酮醇類、異黃酮類、蒽醌類，并從該植物中首次鑒定出了14個黃酮類成分，可為熏倒牛藥材的藥效物質(zhì)基礎研究和質(zhì)量控制提供參考。

【關鍵詞】 藏藥;熏倒牛;化學成分;黃酮類;高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜

【中圖分類號】R29?? 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）09-0045-08

Analysis of Chemical Constituents in Biebersteinia heterostemon Maxim by HPLC-Q-TOF-MS/MS

LI Yun1，2 LI Yanjun2 ZHANG Guoqiang3 LI Honyu2 JING Ming3*

1.Lanzhou Institute for Food and Drug Control /Gansu Engineering Research Center for

Monitoring Exogenous Harmful Residues in Traditional Chinese Medicines， Lanzhou 730030， China;

2.Pharmacy College of Lanzhou University，Lanzhou 730000， China;

3.Pharmacy Collage of Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000， China

Abstract：Objective To analyze and identify the chemical constituents in Biebersteinia heterostemon Maxim by liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight high resolution mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS/MS） in a negative ion mode. Methods The analysis was carried out on a Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 chromatographic column （3.0 mm×150 mm，1.8μm） with 0.1% formic acid acetonitrile（A）-0.1% formic acid aqueous solution （B） as mobile phase by gradient elution ，at a flow rate of 0.250 mL·min-1，the injection volume was 2 μL， the column temperature was set at 35 ℃. The data were collected under the negative ion mode using an ESI ion source.The compounds were identified by mass spectrometry data，elemental composition and reference data.Results Totally 25 compounds from Biebersteinia heterostemon Maxim were identified by the molecular ion peaks，secondary high resolution mass spectrometry and literature data，among which 1 was Alicyclic organic acids、2 were coumarins、2 were polyphenols、1 was anthraquinone and 19 were flavonoids.Conclusion HPLC-Q-TOF-MS detecting techniques can be used to analyze and identify the main chemical constituents of flavonols、isoflavones and anthraquinone in Biebersteinia heterostemon Maxim quickly and comprehensively， at the same time ， fourteen flavonoids were found from this genus for the first time which provides reference for the basic research of pharmacodynamics and the quality control of Biebersteinia heterostemon Maxim.

Key words：Tibetan Medicine; Biebersteinia heterostemon Maxim; Chemical Constituents; flavonoid; HPLC-Q-TOF-MS/MS

熏倒牛為民間常用藏藥，來源于牻牛兒苗科熏倒牛屬植物Biebersteinia heterostemon Maxim的干燥全草，由于其花蕊色黑如紫菀，青海藏醫(yī)將其作為明見賽保的代用品[1]，主要分布于甘肅、寧夏六盤山西坡和中衛(wèi)、青海東部和南部、四川西北部（若爾蓋）等地[2]，資源豐富，具有散腫止痛、治熱性炭疽、疔瘡癰疔的功效[1] 。據(jù)調(diào)研，民間可用于抑菌、鼻竇炎、腦膜炎及過敏性疾病等的治療，通常將新鮮的藥材切段后，搗碎、煎煮、去渣、熬至稠膏狀，與其他藥物配伍使用?，F(xiàn)代研究[3-5]表明，熏倒牛主要含有生物堿類、黃酮及其苷類、苯丙素類、脂肪酸類等化合物，具有抑菌[6]、抗炎鎮(zhèn)痛[7]、降血糖[8]等藥理活性。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)熏倒牛藥材提取物毒性研究表明，其口服安全可靠[9];同時，利用藥理效應法對其不同提取工藝進行評價，發(fā)現(xiàn)熏倒牛70%乙醇提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用顯著[10]。然而，目前關于熏倒牛藥材的質(zhì)量控制研究相對較少，僅見其性狀、顯微鑒別與木犀草素[11]、山羊豆堿[12]的含量測定研究，較系統(tǒng)的對其所含主要化學成分進行分析鑒定的相關研究尚未見報道。借助于高分辨質(zhì)譜技術，利用其具有靈敏度高，可提供精確質(zhì)量數(shù)的強大定性能力，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的化合物精確分子質(zhì)量、碎片離子信息及對照品信息，并結合相關文獻數(shù)據(jù)，對熏倒牛中的主要物質(zhì)基礎進行定性分析，從中初步鑒定出 25個化學成分，主要為脂環(huán)族有機酸類、香豆素類、多酚類、蒽醌類及黃酮醇類化合物，并首次鑒定出了熏倒牛中的14個黃酮類成分，為研究熏倒牛藥材的藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量標準提升研究提供了實驗依據(jù)。因此，建立一種靈敏、可靠、快速的方法系統(tǒng)分析和鑒定熏倒牛中的化學成分，對該藥材的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎研究具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1290-6545高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（Agilent Technologies，美國）; MS105DU電子天平（Mettler Toledo，瑞士），SBL-10DT超聲波恒溫清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，中國）。

1.2 材料 對照品兒茶素（批號：110877-201604）、橙皮苷（批號：110721-202019）、蘆丁（批號：100080-201811）、槲皮素（批號：100081-201610）、楊梅苷（批號：111860-201703）、芹菜素（批號：111901-201603）均購自中國食品藥品檢定研究院;傘形花內(nèi)酯（批號：RFS-S02511812016）、異槲皮苷（批號： RFS-Y07601904023）、芹菜素（批號： RFS-Q00211801030）、木犀草素（批號： RFS-M00701904022）均購自成都瑞芬思生物技術有限公司;乙腈為色譜級，水為Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純。

實驗所用樣品信息詳見表1，采集于2019年8月至2020年10月，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū)張尚智教授鑒定為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物Biebersteinia heterostemon Maxim的干燥全草。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取各對照品適量，加50%甲醇使其溶解，制成各成分質(zhì)量濃度處于 10～20 mg·L-1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取熏倒牛藥材粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲提取（頻率 40 kHz，功率 300 W）1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜濾過，備用。

2.3 色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）; 0.1%甲酸的乙腈（A）和含0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～35 min，5%-40%A;35-55 min，40%-95%A;55～60 min，95%-5%A;60～65 min，5%A），流速：0.250 mL·min-1;柱溫：35 ℃;進樣體積：2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式檢測;碰撞氣為氮氣;干燥氣流速為 12.0 L·min-1;鞘氣流量為10.0 L·min-1;霧化氣壓力為 40 psi;毛細管電壓為3500 V;碰撞電壓為135 V;掃描范圍為50～1500 m/z;母離子的 MS/MS 碰撞能為 10～50 eV。

2.5 數(shù)據(jù)采集與處理 數(shù)據(jù)工作站為 MassHunter Version B.06.01軟件，通過對所有樣品的離子流圖進行比較，遴選代表性藥材進行質(zhì)譜解析。

2.6 化學成分鑒定 查閱藏藥熏倒牛相關化學成分研究文獻，并收集化學成分信息，應用MassHunter Version B.06.01、PCDL Manager B.07.00軟件，根據(jù)測得的精確相對分子質(zhì)量，在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)（±5.0 ppm）計算可能的元素組成，并通過分析各物質(zhì)的保留時間、分子離子峰、二級特征碎片離子等信息，結合對照品確認和文獻數(shù)據(jù)信息，對化合物進行分析鑒定。

3 結果

3.1 不同產(chǎn)地熏倒牛的總離子流圖比較 對不同產(chǎn)地熏倒?？傠x子流圖進行分析，如圖1所示，結果提示各產(chǎn)地樣品的 TIC圖基本相似，但各峰相應的離子強度有一定差異，說明不同產(chǎn)地熏倒牛中的化學成分種類基本一致，但含量存在差異。其中，甘肅省合作市卡加曼鄉(xiāng)樣品（樣品編號：BH-01）中各離子強度相對較高，故以該樣品為典型樣品，對熏倒牛的化學成分進行鑒定。

3.2 熏倒牛典型樣品中化學成分的鑒定 采用HPLC-Q-TOF-MS/MS對樣品1的50%甲醇提取物中的化學成分進行分析，如圖2所示。結果發(fā)現(xiàn)黃酮類、有機酸及酚酸類成分在負離子模式下有較高的響應;從該樣品50%甲醇提取物中共鑒定出25個成分，包括 1個脂環(huán)族有機酸類、2個香豆素類、2個多酚類、1個蒽醌類及19個黃酮類化合物。相關質(zhì)譜信息見表2。

3.3 主要化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律及結構鑒定 以峰 2 為例，其準分子離子峰為m/z 787.2450 [M-H]-，推測分子式為 C33H40O22。該離子分別失去一分子葡萄糖殘基（C6H10O5）和一分子龍膽雙糖殘基C12H20O10產(chǎn)生碎片離子m/z 625.1861[M-H-162Da]-和m/z 463.1205[M-H-324Da]-。碎片離子 m/z 463.1205分別失去一分子H和一分子葡萄糖殘基C6H10O5產(chǎn)生碎片離子m/z 462.1181和m/z 300.0571。碎片離子 m/z 300.0571繼續(xù)失去一分子H得到碎片離子m/z 299.0498。因此，推斷該化合物為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-O-β-D-龍膽雙糖苷，其二級質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖3所示。

以峰14為例，其準分子離子峰為m/z 463.1244 [M-H]-，推測分子式為 C21H20O12。該離子分別失去一分子葡萄糖殘基（C6H10O5）產(chǎn)生碎片離子m/z 301.0642[M-H-162Da]-，繼而分別失去一分子中性離子CH2O和一分子中性離子C8H6O3得到碎片離子m/z 271.0552 [M-H-162Da-30Da]-和151.0045 [M-H-162Da-150Da]-。因此，推斷該化合物為異槲皮素，它的二級質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖4所示。

以峰21 為例，其準分子離子峰為m/z 285.0682 [M-H]-，推測分子式為 C15H10O6。該離子分別失去一分子離子C6H6O2，C8H6O2和C7H4O4產(chǎn)生碎片離子m/z 175.0616[M-H-110Da]-，m/z 151.0232[M-H-134Da]-和m/z 133.0477[M-H-152Da]-。碎片離子m/z 151.0232繼而失去一分子CO2得到碎片離子m/z 107.0301。因此，推斷該化合物為木犀草素，其二級質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖5所示。

以峰23為例，其準分子離子峰為m/z 269.0732[M-H]-，推測分子式為 C15H10O5。該離子分別失去一分子離子CO2，C8H6O和C7H4O4產(chǎn)生碎片離子m/z 225.0803[M-H-44Da]-，m/z 151.0230 [M-H-118Da]-和m/z 117.0515[M-H-152Da]-。碎片離子m/z 225.0803和m/z 151.0232繼而分別失去一分子C2H2O2和CO2得到碎片離子m/z 183.0669和107.0293。因此，推斷該化合物為芹菜素，其二級質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖6所示。

4 討論

預試驗對熏倒牛50%甲醇提取物分別進行了正、負離子質(zhì)譜掃描模式考察，總離子流圖提示，熏倒牛藥材50%甲醇提取物的物質(zhì)組成在負離子掃描模式下具有較好的響應值，信息豐富;而在正離子掃描模式下響應值較低，且化合物數(shù)量較單一。故本文選用負離子模式進行數(shù)據(jù)的采集與分析。

本研究基于HPLC-Q-TOF-MS/MS 技術，建立了熏倒牛屬植物熏倒牛50%甲醇提取物中主要化合物的快速鑒別方法。對采集于不同產(chǎn)地、不同海拔的 4批熏倒牛藥材進行分析，發(fā)現(xiàn)其化學成分組成基本一致，故從中選擇1批次典型樣品進行分析鑒定。通過檢索、歸納已報到的熏倒牛屬及其近緣屬植物化學成分信息、結合SciFinder 和ChemSpider 等在線質(zhì)譜庫資源以及標準物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，建立熏倒牛屬植物物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，并對熏倒牛提取物中的25個化合物進行了準確歸屬。初步鑒定結果提示，熏倒牛 50%甲醇提取物主要含有黃酮類化合物（tR在11～37 min），如槲皮素、山奈酚、芹菜素、木犀草素及以其為苷元的多種黃酮苷類成分，此類物質(zhì)在抗氧化、抗菌、抗炎及抗腫瘤等方面具有良好的藥理活性。另在tR為42～60 min內(nèi)的部分化合物尚未能準確歸屬，有待進一步的深入研究。

通過本研究，建立了一種快速、靈敏、重復性好的方法對熏倒牛中主要化學成分進行較系統(tǒng)的定性分析，初步揭示了其主要物質(zhì)基礎，豐富了該藥材的成分信息，為進一步挖掘潛在藥用價值、闡釋藥效機理及深入開發(fā)、綜合利用該資源奠定了基礎。

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（收稿日期：2021-09-08 編輯：劉 斌）