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        固本平喘方納米脂質(zhì)體霧化吸入劑改善哮喘豚鼠病理狀態(tài)的研究

        2022-05-30 10:48:04貫劍宋紅普張曉曉張彤
        關鍵詞:霧化吸入豚鼠病理學

        貫劍 宋紅普 張曉曉 張彤

        【摘要】目的:研究固本平喘方霧化吸入后治療效果。方法:將39只豚鼠分為正常對照組、哮喘模型組、中藥對照組、固本平喘吸入劑小劑量組、固本平喘吸入劑大劑量組、西藥對照組6組,采用固本平喘中醫(yī)納米脂質(zhì)體霧化吸入,觀察一般情況、血常規(guī)和病理改變。結(jié)果:模型組與其他組比較,白細胞(WBC)、嗜酸性細胞(EO)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義。正常組由于霧化等因素影響,存在肺動脈壁增厚和輕微炎癥的情況。哮喘模型組的炎癥情況最為嚴重,動脈壁增厚。中藥對照組炎癥情況減輕,伴有肉芽組織增生。結(jié)論:固本平喘方納米脂質(zhì)體霧化吸入劑對哮喘豚鼠的病理學有一定的改善作用。

        【關鍵詞】固本平喘方;霧化吸入;哮喘;豚鼠;病理學

        【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517(2022)11-0009-05

        StudyonthePathologicalStateoftheNebulizedNanoliposome

        InhalationofGubenPingchuanFormulaonAsthmaticGuineaPigs

        GUANJian1SONGHongpu2ZHANGXiaoxiao3ZHANGTong2

        1.LiangyuanHospitaloftraditionalChinesemedicine,Shangqiu476000,China;

        2.ShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine,Shanghai200030,China;

        3.PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityoftraditionalChinesemedicine,Shanghai200062,China

        Abstract:ObjectiveToassesstheinhalationtherapyofnebulizedGubenPingchuan.Method39guineapigsweredividedintosixgroups:normalcontrolgroup,asthmamodelgroup,traditionalChinesemedicinecontrolgroup,GubenPingchuanlow-doseinhalationgroup,GubenPingchuanhigh-doseinhalationgroup,andWesternmedicinecontrolgroup.ThenebulizednanoliposomesofGubenPingchuanwereinhaledbythesixgroupsandwemeasuredtheallergy-relatedimmunologicalindicators.ResultThelevelsofWBCandeosinophil(EO)weresignificantlyhigherinmodelgroupandothergroups.Thenormalgrouphadpulmonaryarterywallthickeningandslightinflammationduetoatomizationandotherfactors.Theinflammationofasthmamodelgroupwasthemostserious,andthearterialwallwasthickened.Inthecontrolgroup,inflammationwasalleviated,accompaniedbygranulationtissuehyperplasia.ConclusionThenebulizednanoliposomeinhalationofGubenPingchuancouldimprovethepathologyofasthmaticguineapigstoacertainextent.

        Keywords:GubenPingchuanFormula;NebulizedInhalation;Asthma;GuineaPigs;Pathologically

        固本平喘方具有益氣平喘、脫敏解毒的功效,筆者在臨床上長期使用霧化吸入劑治療哮喘有較好效果,但方式多為簡單的霧化吸入,多數(shù)臨床觀察[1-3]僅停留在經(jīng)驗層面,實驗研究的機理不明確,本項研究,通過動物實驗來客觀地觀察和評價其治療效果,探討其在細胞的作用機理。

        1實驗材料

        1.1藥物

        1.1.1治療用藥固本平喘霧化吸入劑(以下簡稱固本平喘方):每毫升含1g生藥量,由上海中醫(yī)藥大學中藥學院提供。

        1.1.2陽性對照藥小青龍合劑(湖北福廣制藥有限公司生產(chǎn),國藥準字Z42021495)。功能主治是解表化飲,止咳平喘,用于風寒水飲,惡寒發(fā)熱,無汗,喘咳痰稀。每支裝10mL。

        1.2實驗動物英國種普通級健康豚鼠39只,體重250~300g,均由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,普通級,實驗動物合格證號[上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SYXK(滬)2004-0005]。

        1.3設備與試劑

        1.3.1設備貝爾思超聲霧化器(BSW-2A型)由鞍山市貝爾思電子有限公司生產(chǎn)。希森美康(XE-2100)全自動血球分析裝置,由日本SYSMEXCORPORATIION公司生產(chǎn)。萊卡SP1600切片機由上海萊卡儀器有限公司生產(chǎn)。奧林巴斯CX31顯微鏡。隔水式恒溫箱(PYX-DHS型)上海躍進醫(yī)療器械一廠生產(chǎn)。

        1.3.2試劑卵蛋白粉(OVA),國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)(批號:F20110811)。

        2實驗方法

        2.1造模方法將豚鼠正常飼養(yǎng)1周后開始進行致敏。第1天,先用75%乙醇溶液消毒局部皮膚后,給哮喘模型組、高劑量組、低劑量組及中藥對照組、西藥對照組每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1.6mL(6mL/kg,另有0.1mL損耗)致敏??瞻讓φ战M用0.9%生理鹽水。第8天,再次注射致敏,各組劑量和方法同前。

        2.2模型評價指標第14天開始激發(fā)引喘,將豚鼠置于4L的玻璃鐘罩內(nèi)用1%卵蛋白霧化吸入15~30s,觀察20~30s,誘發(fā)哮喘發(fā)作(說明模型成功)。如豚鼠出現(xiàn)抽搐,馬上將其取出。以后隔天進行1次引喘,至實驗結(jié)束。同時,從第14天起,引喘后1h各組進行相應治療。至第28天,各組動物處死,提取樣本。

        2.3分組與治療方法A正常對照組:致敏、激發(fā)以及治療均以0.9%生理鹽水代替。B哮喘模型組:造模成功后每天吸入1%OVA溶液激發(fā)1次。C中藥對照組:霧化吸入小青龍合劑1g/次。D固本平喘吸入劑小劑量組:霧化吸入劑1g/次。E固本平喘吸入劑大劑量組:霧化吸入劑3g/次。F西藥對照組:霧化吸入地塞米松1g/次。

        2.4血常規(guī)檢測采用全自動血球分析裝置自動分析血常規(guī)全套。

        2.5肺組織病理學檢查各組豚鼠分別于末次激發(fā)后24h內(nèi)用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下開胸。取右肺下葉組織,置4%甲醛固定,24h后酒精梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片行HE染色,光鏡下觀察支氣管周圍炎性病變。

        2.5.1肺組織切片制備①切取標本同一部位組織,大小約2mm×1mm×1mm;②以乙醇進行梯度脫水(80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次);③浸二甲苯2次,以透明;④用58℃低熔點石蠟浸蠟2次;⑤包埋蠟塊;⑥5um常規(guī)切片,裱于防脫片劑處理過的干凈載玻片上;⑦置60℃恒溫箱中烤片3h,備用。

        2.5.2肺組織HE染色①切片以二甲苯脫蠟2次;②以乙醇進行梯度脫水(100%乙醇3次、95%乙醇2次、80%乙醇1次);③在蒸餾水中停留2min后,以蘇木素溶液染細胞核;④自來水沖洗,去掉浮色;⑤1%鹽酸酒精分化;⑥蒸餾水漂洗后,以1%伊紅酒精溶液染細胞質(zhì);⑦以乙醇進行梯度脫水(80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次);⑧以二甲苯透明,樹脂膠封片。光鏡下觀察。

        2.6統(tǒng)計學方法應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標準差(x±s)方式表示,多組之間均數(shù)比較采用方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

        3結(jié)果

        3.1一般情況變化各組在被激發(fā)后癥狀表現(xiàn)不同,正常對照A組豚鼠表現(xiàn)精神活躍、反應靈敏、呼吸平穩(wěn),無明顯呼吸急促、困難和喘鳴音,模型組合各用藥組豚鼠在吸入OVA后不久出現(xiàn)躁動、搔抓顏面等情況,部分豚鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹式呼吸,甚至哮鳴音等。在末次激發(fā)時,小劑量治療D組豚鼠未出現(xiàn)哮鳴音和呼吸困難,其他各治療組均有2~3只豚鼠出現(xiàn)輕度呼吸急促、喘鳴等情況。

        3.2血常規(guī)變化模型組與其他組比較,WBC、EO水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義。正常組較其他各組的EO水平均低,差異有統(tǒng)計學意義。D、E、F組的BA水平與模型組比較顯著增高,D、F組與C組比較亦有差異。A組與B組的PMN差別有統(tǒng)計意義,其余各組無差別。B組與A組比較,LY有顯著差別,D、E、F組與B組的差別也有統(tǒng)計學意義。詳見表1。

        3.3固本喘方對病理學的影響肺組織病理學觀察變化情況,A正常對照組:支氣管及周圍肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺動脈壁輕度增厚,有2例伴有輕度間質(zhì)性肺炎。B哮喘模型組:肺動脈壁增厚,細支氣管腔內(nèi)充滿炎性分泌物,有2例伴有肺間質(zhì)纖維組織增生。C中藥對照組:肺內(nèi)細支氣管壁及管周見少量炎細胞浸潤,腔內(nèi)少量分泌物。小灶性肺組織結(jié)構(gòu)破壞,伴部分肉芽組織增生。D固本平喘吸入劑?。悍蝿用}壁增厚,細支氣管腔內(nèi)少量分泌物,3例出現(xiàn)輕度間質(zhì)性肺炎和局部間質(zhì)性肺炎。E固本平喘吸入劑大:1肺動脈壁增厚,輕度間質(zhì)性肺炎。2例出現(xiàn)局部肺組織破壞,伴肉芽組織增生。F西藥對照組:肺動脈壁增厚,輕度間質(zhì)性肺炎。2例出現(xiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞,另有1例局部肺出血。A組:圖①、②;B組:圖③、④;C組:圖⑤、⑥;D組:圖⑦、⑧;E組:圖⑨、⑩;F組:圖B11、B12(如下圖所示)。

        4討論

        支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,反復接觸過敏原導致變態(tài)反應性炎癥是多數(shù)哮喘發(fā)作的基本機制。中藥復方固本平喘方(包括黃芪、白術、黃芩、甘草、麻黃、烏梅等)是臨床經(jīng)驗方基礎上結(jié)合現(xiàn)代研究進展優(yōu)化配伍而成,具有益氣平喘、脫敏解毒的功效。中藥霧化吸入劑治療哮喘有較好效果,但方式多為簡單的霧化吸入,多數(shù)臨床觀察僅停留在經(jīng)驗層面,實驗研究的機理不明確。

        白細胞(WBC)升高是細菌性炎癥的主要表現(xiàn),但是在哮喘動物實驗中也發(fā)現(xiàn)存在外周血WBC增高的情況,有研究[4]表明中藥復方能顯著降低大鼠外周血WBC,較模型組有顯著差異。哮喘炎癥的特征性標志是嗜酸性細胞(EOS)的浸潤,EOS細胞漿中含有嗜酸性細胞陽離子蛋白(ECP)、堿性蛋白(MBP)、嗜酸細胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)、嗜酸細胞過氧化物酶(EPO)等特殊蛋白質(zhì)顆粒以及多種炎癥介質(zhì)、細胞因子和氧自由基,EOS釋放組胺,產(chǎn)生氣道高反應性(AHR),因此EOS是引起遲發(fā)相變態(tài)反應和氣道高反應性的關鍵細胞,在介導氣道變應性炎癥參與支氣管哮喘發(fā)病的調(diào)節(jié)中起重要作用[5]。同時,EOS在氣道的緩解期也處于高水平,與晚期哮喘反應和氣道高反應性關系密切[6]。淋巴細胞(LY)包括T淋巴細胞和B淋巴細胞,EOS分化、成熟、聚集又依賴于淋巴細胞的活化及其產(chǎn)生的細胞因子來調(diào)節(jié),因此淋巴細胞在哮喘發(fā)病中也起了關鍵作用,它影響哮喘的發(fā)生和哮喘氣道炎癥及氣道高反應性,其中T淋巴細胞具有“中樞性”調(diào)節(jié)作用[7]。筆者研究發(fā)現(xiàn),模型組與其他組比較WBC、EO水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義,說明模型組的血液中EO增多,處于一種致敏狀態(tài)。正常組較其他各組的EO水平均低,差異有統(tǒng)計學意義。B組與A組比較,LY有顯著差別,D、E、F組與B組的差別也有統(tǒng)計學意義,提示造模后的豚鼠LY明顯升高,而兩個治療組和西藥組對于豚鼠外周血的LY有降低作用。

        從各組的病理結(jié)果可以看出,正常組由于霧化等因素影響,存在肺動脈壁增厚和輕微炎癥的情況。哮喘模型組的炎癥情況最為嚴重,動脈壁增厚。中藥對照組炎癥情況減輕,伴有肉芽組織增生。兩組治療組同樣有肺動脈增厚,并有輕度炎癥存在。西藥組存在肺組織結(jié)構(gòu)受到破壞的情況,以上不排除外界感染的可能。

        參考文獻

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        (收稿日期:2022-02-25編輯:陶希睿)

        基金項目:上海市科委項目[固本平喘霧化吸入劑對哮喘豚鼠信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因6(STAT6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達影響的實驗研究]。項目編號:8ZR1416200。

        作者簡介:貫劍(1973-),男,滿族,博士,副主任醫(yī)師,研究方向為中醫(yī)藥治療過敏性疾病的臨床和實驗研究。E-mail:475479521@qq.com

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