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        羊奶粉對小鼠免疫調(diào)節(jié)功能作用的研究

        2022-05-30 14:03:14石韶琦逄金柱賴必輝
        中國奶牛 2022年5期
        關(guān)鍵詞:羊奶粉灌胃空白對照

        石韶琦,逄金柱,賴必輝

        (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系,北京 100191;2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司,呼和浩特 011500)

        機體免疫力指機體抵抗外來侵襲、維護體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的能力,是機體識別和排除“異己”的生理反應(yīng)[1]。環(huán)境影響和營養(yǎng)不良導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)喪失,過去通過服用營養(yǎng)藥物重建免疫平衡,如今,營養(yǎng)食品代表了一種保護、平衡或增強哺乳動物免疫系統(tǒng)的創(chuàng)新方法[2],各種乳制品成為深入研究的對象[3]。

        羊奶營養(yǎng)豐富[4],具有提高消化率、促進生長發(fā)育、低致敏[5]、抗炎[6]、易消化吸收[7]、增強免疫力[8]等功能。研究表明,在HIV陽性患者攝入羊奶3個月后,CD4+細胞數(shù)量增加,免疫系統(tǒng)得到加強[9]。Jirillo等發(fā)現(xiàn)羊奶能夠通過單核細胞和PMN釋放NO激活先天免疫,并通過誘發(fā)IL-10、TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生激活先天免疫和適應(yīng)性免疫[10]。然而,羊奶粉等乳制品是否仍具有調(diào)節(jié)免疫功能尚缺乏充足的證據(jù)。

        本研究利用健康小鼠模型,通過研究羊奶粉對小鼠細胞免疫、體液免疫和NK細胞活性等方面的影響,評價羊奶粉的免疫調(diào)節(jié)功能,為羊奶粉的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 樣品

        羊奶粉,由內(nèi)蒙古歐世蒙牛乳制品有限責(zé)任公司提供,主要成分為全脂羊奶粉、脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉等。

        1.1.2 試驗動物

        Balb/C小鼠,雄性,體重18~22g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件為12h光照交替,潔凈度SPF級,濕度維持在45%~50%,溫度保持在20±2℃。小鼠可自主攝食及飲水,活動自由。

        1.2 試驗設(shè)備

        酶標儀(Biotek, ELX808);超凈工作臺(新加坡ESCO公司);CP21GⅡ高速冷凍離心機(日立公司);恒溫培養(yǎng)箱(37℃、43℃);G560E漩渦混合器(美國SCIENTIFIC Instruments公司)。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 試驗動物分組及處理

        將48只Balb/C健康小鼠隨機分成空白對照組、低劑量組和高劑量組,每組各16只??瞻讓φ战M灌胃生理鹽水,低劑量組和高劑量組分別按每千克體重6.25g、12.5g的劑量灌胃羊奶粉,每日灌胃0.2mL,連續(xù)45d。

        1.3.2 血清樣本制備

        摘取小鼠眼球采血,室溫下靜置2h,于4℃條件下1 000r/min離心10min,收集血清,-20℃保存。

        1.3.3 脾淋巴細胞懸液制備

        小鼠處死后在無菌條件下取脾臟,置于盛有Hank's液的平皿中,輕輕磨碎脾臟,制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,于1 000r/min條件下離心10min,用Hank's液洗2遍,最后將細胞懸浮在5mL RPMI-1640培養(yǎng)液中。

        1.3.4 補體制備

        采集豚鼠血,混合5只不同豚鼠血清,將1mL壓積綿羊紅細胞(SRBC)加入到5mL豚鼠血清中,4℃放置30min,振蕩,離心取上清,分裝,-70℃保存,用時以SA緩沖液1:8倍稀釋。

        1.4 測定指標

        1.4.1 體重及臟器/體重比

        動物按照分組灌胃給予生理鹽水和低、高劑量羊奶粉,所有組連續(xù)灌胃45d。實驗第0天第一次灌胃前稱量小鼠初始體重并記錄,實驗第45天稱量小鼠最終體重后,摘取胸腺和脾臟稱重并記錄,計算胸腺/體重比值和脾臟/體重比值。

        1.4.2 脾淋巴細胞增殖能力檢測

        刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)誘導(dǎo)動物脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化,利用MTT試劑盒對淋巴細胞懸液進行測定,在490nm波長下檢測吸光值(OD值)。通過式(1)表示淋巴細胞的增殖能力。若受試樣品吸光值差值顯著高于對照組(P<0.05),判定為陽性。

        1.4.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)

        腹腔注射0.2mL 2%(v/v)SRBC懸液,免疫4d后,測量左后足跖部厚度,然后在測量部位皮下注射20μL 20%(v/v)SRBC,注射后于24h測量左后足跖部厚度,同一部位測量三次,取平均值,以此來表示DTH程度。

        1.4.4 抗體生成細胞測定

        腹腔注射0.2mL 2%(v/v)SRBC懸液,免疫4d后,解剖小鼠獲得脾細胞懸液,并將其與瓊脂糖培養(yǎng)基、10% SRBC(v/v)混合傾倒在玻片上,加入稀釋后的補體溫育1h,計數(shù)溶血的空斑數(shù)。

        1.4.5 血清溶血素(HC50)測定

        腹腔注射0.2mL 2%(v/v)SRBC懸液,免疫4d后,解剖小鼠收集血清,SA緩沖液稀釋200倍,取稀釋后的血清50μL加入反應(yīng)板再加入25μL SRBC懸液、50μL補體混勻。37℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30min,冰浴終止反應(yīng),1 500r/min條件下離心10min。樣品孔和空白對照孔各取上清液50μL加入96孔培養(yǎng)板內(nèi),加都氏試劑150μL。半數(shù)溶血孔加入12.5μL 10%(v/v)SRBC,再加都氏試劑至200μL。震蕩器充分混勻,放置10min,于540nm處用全自動酶標儀測定各孔光密度值。小鼠血清溶血素由式(2)表示。

        1.4.6 自然殺傷細胞(NK細胞)活性測定

        將脾臟分離出的NK細胞與YAC-1淋巴瘤細胞各100μL共同培養(yǎng),采用WST-8試劑盒法檢測NK細胞活力。若受試樣品的NK細胞活力顯著高于對照(P<0.05),判定為陽性。

        1.5 數(shù)據(jù)處理

        應(yīng)用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果以平均值±標準差表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗,P<0.05為差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 羊奶粉對小鼠體重及臟器/體重比的影響

        羊奶粉對小鼠體重影響如圖1A所示,灌胃45d后,各組小鼠體重隨著灌胃時間延長而增加,低劑量組和高劑量組與空白對照組相比,無顯著差異(P>0.05)。羊奶粉對胸腺/體重比值的影響如圖1B所示,灌胃45d后,低劑量組和高劑量組與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。對脾臟/體重比值的影響如圖1C所示,低劑量組和高劑量組與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。由此表明,羊奶粉對小鼠體重及臟器/體重比無顯著影響。

        圖1 羊奶粉對小鼠體重、臟器的影響

        2.2 羊奶粉對小鼠細胞免疫功能的影響

        細胞免疫涉及T淋巴細胞及其產(chǎn)物(淋巴因子),ConA誘導(dǎo)淋巴細胞轉(zhuǎn)化和DTH反應(yīng)需要激活的T淋巴細胞對給定抗原的特異性識別,從而增殖和釋放細胞因子,淋巴細胞增殖能力和DTH反應(yīng)體現(xiàn)了細胞因子誘導(dǎo)巨噬細胞募集和激活的能力[11]。

        T細胞是獲得性免疫中細胞免疫的重要效應(yīng)細胞,在自身免疫、腫瘤免疫、移植物排斥反應(yīng)等方面起著重要作用[12],脾淋巴細胞中的T細胞在ConA的刺激下增殖,增殖程度反映T細胞的活性[13]。羊奶粉對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響如圖2所示,灌胃45d后,與空白對照組相比,羊奶粉低劑量組脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力未顯著增加(P>0.05),高劑量組淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力顯著增加(P<0.05)。由此表明,羊奶粉可促進脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力。

        圖2 羊奶粉對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響

        DTH是由特異性致敏T細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)[14],是一種以單核細胞浸潤及細胞變性壞死為主要特征的炎癥反應(yīng),該反應(yīng)可作為判定機體細胞免疫功能的指標[15]。羊奶粉對小鼠DTH的影響如圖3所示,與空白對照組相比,羊奶粉低劑量組和高劑量組DTH水平顯著提高(P<0.05),表明羊奶粉可以增強細胞免疫反應(yīng)。

        圖3 羊奶粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

        2.3 羊奶粉對小鼠體液免疫功能的影響

        抗體生成細胞被認為是體液免疫反應(yīng)的重要組成,其產(chǎn)生大量抗體,在宿主防御炎癥和維持體內(nèi)平衡方面實現(xiàn)一系列功能[16]。羊奶粉對小鼠抗體生成細胞的影響如圖4所示,與空白對照組相比,羊奶粉低劑量組和高劑量組顯著增加(P<0.05),表明羊奶粉可增強小鼠體液免疫反應(yīng)。

        圖4 羊奶粉對小鼠抗體生成細胞的影響

        溶血素是一種能特異性結(jié)合紅細胞的抗原型靈敏的互補固定抗體,該抗體可導(dǎo)致紅細胞溶解釋放出血紅蛋白,血清中溶血素水平越高表明機體體液免疫水平越高,其可用來評價機體體液免疫狀態(tài)[17]。羊奶粉對小鼠血清溶血素的影響如圖5所示,羊奶粉低劑量組和高劑量組血清溶血素水平均高于空白對照組,但均無顯著差異(P>0.05)。

        圖5 羊奶粉對小鼠血清溶血素的影響

        2.4 自然殺傷細胞(natural killer cells,NK細胞)活性測定

        NK細胞是關(guān)鍵的先天免疫細胞,可以被激活以介導(dǎo)細胞毒性活性,并產(chǎn)生高水平的細胞因子和趨化因子,參與非特異性抗病毒防御機制[18],其在增強先天免疫反應(yīng)和激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用[19]。羊奶粉對小鼠NK細胞活性的影響如圖6所示,低劑量組和高劑量組NK細胞活性均呈上升趨勢,但與空白對照組相比,兩試驗組NK細胞活性未顯著增加(P>0.05)。

        圖6 羊奶粉對小鼠NK 細胞的影響

        3 結(jié)論

        本試驗以Balb/C小鼠為動物模型,對羊奶粉對動物體的細胞免疫、體液免疫、NK細胞活性等調(diào)節(jié)作用進行了評價。結(jié)果顯示,羊奶粉可增強小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度等細胞免疫功能和抗體生成細胞等體液免疫功能。綜上所述,羊奶粉具有增強小鼠免疫力的作用。

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