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        結(jié)核分枝桿菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

        2022-05-29 14:34:35譚偉芬付少萍
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

        譚偉芬 付少萍

        摘要:結(jié)核分枝桿菌感染內(nèi)科最常見(jiàn)的感染性疾病,該感染會(huì)侵犯全身各器官,其中以肺結(jié)核最為常見(jiàn),隨著近年來(lái)醫(yī)療檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步,結(jié)核分枝桿菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷及檢測(cè)技術(shù)不斷優(yōu)化,為疾病早期大規(guī)模快速檢測(cè)帶來(lái)極大便利。鑒于此,文章就近兩年所發(fā)表的結(jié)核分枝桿菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及檢測(cè)技術(shù)文獻(xiàn)結(jié)合我院實(shí)際治療開(kāi)展情況做如下總結(jié)。

        關(guān)鍵詞:結(jié)核分枝桿菌感染;實(shí)驗(yàn)室診斷;檢測(cè)技術(shù);研究進(jìn)展

        【中圖分類號(hào)】 R730.43 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306(2022)10--01

        結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病是全球范圍流行的疾病,臨床數(shù)據(jù)顯示結(jié)核病是世界十大死亡原因之一,WHO數(shù)據(jù)顯示目前全球范圍內(nèi)結(jié)核病患者數(shù)量約為2000萬(wàn)人,因此結(jié)核分枝桿菌感染的診療一直是臨床研究的重要方向[1]。隨著近年來(lái)醫(yī)療檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步及對(duì)疾病研究的深入,結(jié)核分枝桿菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及檢測(cè)技術(shù)已逐漸成熟,涂片鏡檢、免疫血清學(xué)檢查、培養(yǎng)法、分子生物學(xué)檢測(cè)等檢查技術(shù)開(kāi)始廣泛應(yīng)用并在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮著較為理想的診斷效果。本文就目前我國(guó)臨床對(duì)于結(jié)核分枝桿菌感染實(shí)施的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展情況做以下綜述,現(xiàn)報(bào)道如下:

        1.涂片鏡檢技術(shù)

        涂片鏡檢技術(shù)在生物學(xué)及免疫學(xué)基礎(chǔ)上建立的檢測(cè)技術(shù),包括萋-尼氏抗酸染色和熒光染色鏡檢,后者的敏感度優(yōu)于前者。但該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中尚存在一定缺陷,原因在于肺結(jié)核患者中約40%-60%為菌陰肺結(jié)核,應(yīng)用涂片鏡檢技術(shù)抗酸染色的陽(yáng)性率相對(duì)較低,因此該技術(shù)往往無(wú)法有效探查菌落;另外該技術(shù)檢查結(jié)核分枝桿菌感染敏感度相對(duì)較低,通常需要平均每毫升5000-10000條抗酸菌才可得出陽(yáng)性結(jié)果[2]。

        2.細(xì)菌培養(yǎng)法

        分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定是目前臨床針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染最精確可靠的檢查,已成為該細(xì)菌感染疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,其中固定培養(yǎng)法是指以雞蛋為基礎(chǔ),在高溫凝固形成的兩個(gè)培養(yǎng)基中實(shí)施分枝桿菌培養(yǎng),一般可在2-3周內(nèi)出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng);液體培養(yǎng)法的優(yōu)勢(shì)在于液體培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)豐富,細(xì)菌可在液體中于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分接觸,因此該技術(shù)能有效縮短培養(yǎng)時(shí)間,正常情況下可在1-2周內(nèi)出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

        3.血清學(xué)檢查

        血清學(xué)檢查是結(jié)核分枝桿菌感染重要的輔助檢查方法,該檢查具有推廣難度小、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需精密儀器等優(yōu)點(diǎn)。隨著近年來(lái)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,血清學(xué)檢查結(jié)核分枝桿菌感染受到廣泛重視、聯(lián)合應(yīng)用結(jié)核抗原、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)開(kāi)始逐漸推廣應(yīng)用。其中酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)是上述疾病實(shí)驗(yàn)室診斷及檢測(cè)技術(shù)發(fā)展最為迅速的部分,該技術(shù)的原理是抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞予以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色方式表達(dá)。

        目前臨床上最常用的方法為IGRAs,基本原理是MTB感染者體內(nèi)致敏的T淋巴細(xì)胞,在體外再次接受MTB特異性抗原刺激后,激活的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生特異性IFN-γ,通過(guò)對(duì)IFN-γ的檢測(cè)判斷是否存在MTB感染。根據(jù)檢測(cè)技術(shù)和操作程序的不同,IGRAs方法有2類:(1)以基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)全血中MTB特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ水平;(2)采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)在MTB特異性抗原刺激下,外周血單個(gè)核細(xì)胞中釋放IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)目。

        4.結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)

        結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)又被稱為PDD皮膚實(shí)驗(yàn),該技術(shù)主要采用結(jié)核分枝桿菌的純蛋白衍生物實(shí)施前臂內(nèi)側(cè)皮膚注射,再通過(guò)觀察受檢者局部皮膚是否出現(xiàn)紅腫硬結(jié),但由于我國(guó)國(guó)民大多接種了卡介苗,故單純依靠結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)或難以判斷是自然感染或卡介苗的免疫應(yīng)答反應(yīng),并受患者免疫狀態(tài)及部分非結(jié)核分枝桿菌感染的影響可能出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性,在實(shí)際應(yīng)用中需綜合使用其他檢查,以此提升診斷效力。

        5.分子生物學(xué)檢測(cè)

        PCR檢查主要利用體外擴(kuò)增技術(shù)檢查結(jié)核分枝桿菌,是目前臨床針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染應(yīng)用率最高的基因檢查技術(shù)。(1)GeneXpert結(jié)核分枝桿菌(MTB)技術(shù)是由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)的一套半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR體外診斷技術(shù)。以利福平耐藥基因rpoB基因?yàn)榘邢蚧颍稍?h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)MTB和對(duì)利福平是否耐藥。該方法于2010年由WHO推薦用于肺結(jié)核的診斷,2013年WHO又推薦其用于肺外結(jié)核的診斷。目前GeneXpert結(jié)核分枝桿菌(MTB)技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床,成為診斷結(jié)核病重要的檢測(cè)手段,大大地提高了病原學(xué)陽(yáng)性率,初步判斷患者耐藥情況,指導(dǎo)臨床抗結(jié)核治療方案。該檢查具有更高的簡(jiǎn)便性及特異性,能最大限度避免交叉感染,進(jìn)而提升診斷的精準(zhǔn)度。而Xpert MTB/RIF Ultra是新一代檢測(cè)技術(shù),靶基因增加了IS6110和IS1081,其敏感度優(yōu)于Xpert MTB/RIF。(2)交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(cross-priming amplification,CPA):采用IS6110基因?yàn)榘谢颉T诔扇私Y(jié)核病檢測(cè)的敏感度為72%。WHO于2018年在全球結(jié)核病報(bào)告中介紹了該方法,認(rèn)為其可作為Xpert MTB/RIF的替代方法,在結(jié)核病的診斷中具有潛在價(jià)值。(3)分子線性探針測(cè)定法:該技術(shù)主要利用核酸擴(kuò)增和反向雜交技術(shù),將不同靶基因的特異性探針置于紙條上,進(jìn)行一系列的反應(yīng)。該方法可以鑒別MTBC和NTM,并進(jìn)行耐藥相關(guān)基因檢測(cè),敏感度(92.9%)和特異度(99.3%)高;WHO推薦GenoTypeMTBDR為MDR-TB的快速診斷方法[4]。

        高通量測(cè)序技術(shù):采用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)臨床標(biāo)本或陽(yáng)性培養(yǎng)物中的核酸進(jìn)行靶向測(cè)序或全基因組測(cè)序,通過(guò)將測(cè)序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)明確是否存在MTB特異性序列,獲得MTB的耐藥基因突變情況,從而進(jìn)行診斷和/或耐藥性預(yù)測(cè)。WHO在2018年的技術(shù)指南中指出,高通量測(cè)序技術(shù)可以作為檢測(cè)耐藥結(jié)核病的病原學(xué)新方法,并建議在有條件的地區(qū)予以推廣。其局限性為檢測(cè)步驟復(fù)雜,周期較長(zhǎng),費(fèi)用高;檢測(cè)結(jié)果易受人源宿主及環(huán)境物種遺傳物質(zhì)的干擾。近年來(lái)快速發(fā)展的宏基因檢測(cè)技術(shù)因其不依賴于已知核酸序列,無(wú)需特殊探針設(shè)計(jì),可直接對(duì)未知病原微生物進(jìn)行檢測(cè),打破了傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)的局限性,一代宏基因檢測(cè)只能測(cè)量單一的序列,最長(zhǎng)可測(cè)得1000-1500bp;二代宏基因檢測(cè)能測(cè)得大量序列,但片段被限制在250-300bp;三代宏基因檢測(cè)能測(cè)最長(zhǎng)可測(cè)得10kb[5]。

        6.病理學(xué)檢查

        典型的病變由融合的上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)組成,中心為干酪樣壞死,周邊可見(jiàn)朗格漢斯巨細(xì)胞,外層為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和增生的纖維結(jié)締組織[6]。主要病理變化包括滲出性病變、增生性病變和壞死性病變,這3種病理變化?;祀s存在,并相互轉(zhuǎn)化。組織病理學(xué)檢查對(duì)于結(jié)核病有確診價(jià)值,但若病理改變中未找到MTB,需要結(jié)合臨床和影像學(xué)特點(diǎn)以除外真菌感染等疾病引起的肉芽腫改變。病理組織的獲取方法:肺組織、胸內(nèi)淋巴結(jié)可通過(guò)內(nèi)鏡檢查、外科手術(shù)、尸檢時(shí)獲得。病理結(jié)果陽(yáng)性判定:(1)組織形態(tài)學(xué)符合結(jié)核病病理基本變化;(2)病理分子生物學(xué)鑒定為MTB[7]。

        7.小結(jié)

        隨著現(xiàn)代醫(yī)療檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步,結(jié)核分枝桿菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及檢測(cè)技術(shù)越發(fā)成熟,涂片鏡檢技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)、細(xì)菌培養(yǎng)法、血清學(xué)檢查、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)在其中發(fā)揮著重要作用,但各項(xiàng)檢測(cè)手段實(shí)施需根據(jù)臨床實(shí)際情況進(jìn)行選用,后續(xù)研究需在聯(lián)合運(yùn)用各項(xiàng)檢測(cè)手段的前提下為患者提供最具效力的病理診斷,最大限度提升結(jié)核分枝桿菌感染的診斷精確率及診斷效率。

        參考文獻(xiàn):

        [1]王智慧,梁亞充,王玉紅,等.結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥基因聯(lián)合結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測(cè)在耐藥結(jié)核性胸膜炎中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2021,21(2):112-116.

        [2]中國(guó)防癆協(xié)會(huì).高危人群結(jié)核分枝桿菌潛伏感染檢測(cè)及預(yù)防性治療專家共識(shí)[J].中國(guó)防癆雜志,2021,43(9):874-878.

        [3]曾海清,熊君暉,溫順華,等.結(jié)核分枝桿菌相關(guān)檢測(cè)試劑盒對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的診斷價(jià)值研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2019,40(12):1493-1497.

        [4]鐘明浩,黃裕春,關(guān)海艦,等.4種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染檢測(cè)方法的比較[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2021,37(5):128-132.

        [5]王度,方心俞,吳百健,等.宏基因組二代測(cè)序技術(shù)在非結(jié)核分枝桿菌骨關(guān)節(jié)感染診斷中應(yīng)用價(jià)值的初步報(bào)道[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2021,23(7):577-582.

        [6]樂(lè)曉琴,陳軍,沈銀忠,等.結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)診斷艾滋病患者肺結(jié)核的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中華傳染病雜志,2021,39(1):21-24.

        [7]王新剛,衛(wèi)建民,楊俊松,等.結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在脊柱結(jié)核檢測(cè)中的應(yīng)用[J].頸腰痛雜志,2021,42(6):875-877.

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