李鑫 趙雪 卓愷明 劉登堂 禹順英

既往動物研究顯示腸道菌群與學(xué)習(xí)記憶障礙、精神運動亢進(jìn)等精神分裂癥樣行為有關(guān)[1]。臨床研究顯示，精神分裂癥患者與健康對照比較，部分腸道菌群菌種比例和多樣性存在差異[2-3]。還有研究指出菌種水平與精神分裂癥的癥狀嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)[4]。在精神分裂癥的腸道菌群研究中，抗精神病藥是干擾因素，因為有證據(jù)顯示幾乎所有抗精神病藥物都具有一定的抗生素活性[5]。目前針對未使用抗精神病藥的精神分裂癥患者腸道菌群研究尚不深入。因此，為排除藥物對患者腸道菌群的影響，本研究以首次發(fā)作且未使用抗精神病藥的精神分裂癥患者為研究對象，初步探索患者與對照間腸道菌群的差異，以及患者腸道菌群特征與精神癥狀之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究為病例對照研究。2020年7月至2021年8月于上海市精神衛(wèi)生中心招募首次發(fā)作且未使用抗精神病藥的精神分裂癥住院患者為患者組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊第五版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,5th Edition,DSM-5）診斷為精神分裂癥；②首次發(fā)作，從未服用過抗精神病藥物；③年齡18～50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫性疾病、胃腸疾病、糖尿??；②患有其他精神疾??；③孕婦、哺乳期婦女；④近1個月內(nèi)曾使用抗生素；⑤近1個月有明顯腹瀉或便秘。

同期通過網(wǎng)絡(luò)宣傳在社區(qū)招募健康對照為對照組。入組標(biāo)準(zhǔn)：①無精神疾?。虎趶奈捶眠^抗精神病藥物；③年齡、性別和體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）與患者匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)與患者組一致。

共納入42例首發(fā)未用藥精神分裂癥患者和47名健康對照。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會批準(zhǔn)。所有被試簽署知情同意書。

1.2 社會人口學(xué)特征和臨床癥狀評估通過與入組者訪談，記錄年齡、性別、民族、當(dāng)前吸煙狀況、BMI等資料。臨床精神科醫(yī)生對精神分裂癥患者進(jìn)行癥狀量表評定，包括精神病癥狀維度評定量表（clinician-rated dimensions of psychosis symptom severity,CRDPS）[6]和陽性與陰性癥狀量表（positive and negative syndrome scale,PANSS）[7]。

1.3 糞便樣本收集和16S rRNA測序

1.3.1 糞便樣本采集 用10 mL無菌密封集便盒取受試者新鮮糞便，在溫度4℃條件下，4 h內(nèi)送到實驗室-20℃保存。

1.3.2 樣品DNA提取 使用GHFDE100 DNA分離試劑盒（浙江杭州設(shè)備制備有限公司，20190952）提取糞便樣本細(xì)菌總基因組DNA。提取的DNA使用NanoDropND-1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，USA）和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度和完整性鑒定。

1.3.3 16S rRNA基因測序和分析 對細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Agencourt AMPure XP珠純化（Beckman Coulter,Indianapolis,IN），并用PicoGreen雙鏈DNA分析試劑盒（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）進(jìn)行定量。等量收集擴(kuò)增子后在Illumina NovoSeq6000平臺（Illumina,USA）進(jìn)行對端測序。此工作在杭州谷禾信息技術(shù)有限公司平臺完成。

1.4 生物信息學(xué)分析序列數(shù)據(jù)分析使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）和R包（v3.2.0）。用Illumina Novaseq測序平臺進(jìn)行雙端測序并得到原始數(shù)據(jù)，配對拼接成單條序列。用QIIME軟件對序列進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到有效序列。α-多樣性用QIIME軟件計算，其中Chao1指數(shù)用于估計群落中操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目，Shannon指數(shù)側(cè)重群落的豐富度以及稀有OTU，Simpson指數(shù)側(cè)重均勻度。β-多樣性分析利用OTU的豐度信息對unifrac距離構(gòu)建weighted unifrac距離。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法人口學(xué)資料分析采用SPSS 23.0，年齡、BMI、受教育年限和量表分?jǐn)?shù)用±s描述，組間比較用獨立樣本t檢驗。腸道菌群α-多樣性Chao1和Shannon指數(shù)符合正態(tài)分布，組間比較采用獨立樣本t檢驗，Simpson指數(shù)不符合正態(tài)分布，用Wald-Wolfowitz檢驗；β-多樣性通過多變量統(tǒng)計學(xué)方法主成分分析（principal component analysis，PCA）比較組間差異。腸道菌群豐度組間比較使用基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）的LEfSe分析，用LefSe軟件，統(tǒng)計學(xué)差異的LDA值（logarithmic LDA score）設(shè)為2。精神分裂癥患者腸道菌群與癥狀量表評分相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 社會人口學(xué)特征患者組和對照組年齡（P=0.50）、性別（P=0.19）、BMI（P=0.38）、受教育年限（P=0.51）和是否吸煙（P=0.30）沒有統(tǒng)計學(xué)差異，見表1。

表1 首發(fā)未用藥精神分裂癥患者和健康對照的社會人口特征及臨床癥狀評估

2.2 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 α-多樣性分析 患者組和對照組α-多樣性的Chao1指數(shù)存在差異（t=2.36，P=0.01），對照組高于患者組，但Shannon（P=0.49）和Simpson（P=0.13）指數(shù)組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，見表2。

表2 首發(fā)未用藥精神分裂癥患者與健康對照腸道菌群的α-多樣性分析

2.2.2 β-多樣性分析 PCA分析提取3個主成分，結(jié)果表明兩組間菌群組成存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），患者組腸道菌群聚類比對照組更緊密。見圖1。

2.2.3 腸道菌群物種組成豐度分析 LefSe分析顯示，患者組和對照組之間21個特征菌屬的豐度有差異（LDA值＞2）?；颊呓M腸道菌群中有4個綱富集，分別為α-變形菌綱、芽孢桿菌綱和紅蝽菌綱；2個目富集，分別為乳桿菌目和紅蝽菌目；3個科富集，分別為鏈球菌科、放線菌科和紫單胞菌科；5個屬富集，分別為放線菌屬、鏈球菌屬、厭氧菌屬、瘤胃球菌屬和副桿菌屬。對照組腸道菌群中有1個目富集，為巴斯德氏菌目；1個科富集，為巴斯德氏菌科；4個屬富集，分別是羅斯氏菌屬、毛螺菌屬、梭狀芽胞桿菌屬。見圖2。

2.3 腸道菌群水平與臨床癥狀相關(guān)性患者組毛螺菌屬（r=-0.49，P＜0.01）和枸櫞酸桿菌屬（r=-0.36，P=0.02）水平與CRDPS得分呈負(fù)相關(guān)，而考拉桿菌屬水平與CRDPS得分呈正相關(guān)（r=0.25，P=0.02）。鏈球菌屬水平與PANSS陰性癥狀得分呈正相關(guān)（r=0.39，P＜0.01），且與PANSS陽性癥狀得分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.31，P=0.04）。毛螺菌屬水平與PANSS一般精神病理量表得分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.33，P=0.03）。其他菌群水平與癥狀評分無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（P＞0.05）。圖3列出與臨床癥狀相關(guān)的16個菌屬。

3 討論

本研究以首發(fā)未用藥精神分裂癥患者為研究對象分析精神分裂癥與健康對照腸道菌群多樣性和菌群構(gòu)成特征的差異。發(fā)現(xiàn)在α-多樣性上，雖然Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在患者組和對照組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但患者組Chao1指數(shù)低于對照組，說明首發(fā)未用藥精神分裂癥患者腸道菌群OTU數(shù)減少，其多樣性下降。在β-多樣性上，患者組與對照組腸道菌群也存在顯著差異。本研究有關(guān)α-多樣性的結(jié)果與部分研究有所不同，如既往研究[3-4,8-10]發(fā)現(xiàn)患者組和對照組腸道菌群α-多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。但是，ZHENG等[2]的研究發(fā)現(xiàn)患者組和對照組在α-多樣性中Chao1和Shannon指數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究有關(guān)β-多樣性的結(jié)果也支持了LI等[8]的結(jié)論，即患者組與對照組之間β-多樣性存在差異。結(jié)合抗精神病藥有類抗菌作用的結(jié)論[5]，推測上述各項研究結(jié)果存在少許差異可能與是否使用抗精神病藥有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)患者組腸道菌群富集放線菌科，與既往研究[9]結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)患者組富集乳桿菌目，對照組富集毛螺菌屬，這與SHEN等[3]的研究結(jié)果一致，但SHEN等[3]的研究發(fā)現(xiàn)對照組鏈球菌屬富集，本研究結(jié)果與之不一致?？紤]本研究和既往部分研究結(jié)果不一致，可能與研究對象是否用過抗精神病藥物、樣本量差異及地區(qū)生活習(xí)慣差異等因素有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)患者組腸道菌群部分菌屬水平與精神癥狀有關(guān)。SCHWARZ等[11]與本研究都發(fā)現(xiàn)毛螺菌屬與癥狀嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。LI等[8]的研究發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬的豐度與陰性癥狀負(fù)相關(guān)，而本研究中棒狀桿菌屬與陰性癥狀相關(guān)無統(tǒng)計學(xué)意義。出現(xiàn)不同結(jié)果可能與個體差異、抗精神病藥物使用有關(guān)。在其他精神疾病與腸道菌群的研究中，鏈球菌屬已被證明在重度抑郁癥患者中豐度較高[12]，神經(jīng)性厭食癥患者毛螺菌屬豐度低于健康對照[13]，注意缺陷多動障礙患者中巨單胞菌屬豐度高于健康對照[14]。本研究結(jié)果結(jié)合上述研究結(jié)果，推測鏈球菌屬、毛螺菌屬和巨單胞菌屬在精神疾病中可能具有一定的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)首發(fā)未用藥精神分裂癥患者腸道菌群特征與健康對照存在差異，部分菌群相對豐度與精神癥狀相關(guān)。本研究納入的對象排除了抗精神病藥的影響，研究結(jié)果初步揭示了首發(fā)未用藥精神分裂癥患者腸道菌群多樣性與部分菌屬比例等特征。此外，既往有關(guān)腸道菌群的研究中對精神癥狀的評估多數(shù)使用PANSS量表，而本研究除了使用PANSS量表外，還使用了CRDPS量表，增加了癥狀評估的維度。但本研究仍存在一定局限性，如樣本量較小，這限制了探索腸道菌群差異及評估精神癥狀和腸道菌群關(guān)系的統(tǒng)計學(xué)效能。未來研究需進(jìn)一步明確腸道菌群改變和精神分裂癥發(fā)病的因果關(guān)系，為精神分裂癥的早期干預(yù)、治療提供新的理論依據(jù)。