張 順，沈雪玉，黃 葦

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642）

0 引言

在前期研究中，以西番蓮果皮為對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化酵母菌、乳酸菌混合發(fā)酵工藝，制備出活菌數(shù)高、多酚成分保留率高，且風(fēng)味醇和的果皮漿[1-2]。但制備的果皮漿體積大，常溫下極易變質(zhì)，經(jīng)干燥處理后更適宜貯運(yùn)、銷售。制備高活力的益生菌酵素粉主要是將益生菌包埋在可溶性微膠囊壁材中，以提高益生菌存活性，目前益生菌粉的主要干燥法有噴霧干燥法和冷凍干燥法[3]。真空冷凍干燥酵素粉中的益生菌存活率和復(fù)水后的活性都較高，并且熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分損傷小，對(duì)發(fā)酵漿的香氣成分保留好[4-5]。

益生菌活菌數(shù)及其活性高低是評(píng)價(jià)酵素產(chǎn)品的主要指標(biāo)之一，要獲得高質(zhì)量的益生菌粉，在凍干過(guò)程中需要添加對(duì)益生菌具有保護(hù)作用的保護(hù)劑。試驗(yàn)利用冷凍干燥法制備西番蓮酵素粉，除加入常規(guī)保護(hù)劑CMC、麥芽糊精、β -環(huán)糊精以外，重點(diǎn)關(guān)注了脫脂乳粉和海藻糖的保護(hù)作用。益生菌酵素粉在進(jìn)入人體后，分別經(jīng)過(guò)胃液、腸液、膽汁等消化器官，并最終定植于人體腸道系統(tǒng)發(fā)揮生理功能，因此其活性取決于在腸道環(huán)境中的活菌數(shù)量[6]。研究模擬人體消化環(huán)境下益生菌的存活情況，是評(píng)價(jià)酵素粉質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。

針對(duì)發(fā)酵西番蓮果皮漿真空冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)劑的應(yīng)用效果開(kāi)展研究，并對(duì)酵素粉在模擬人體消化環(huán)境下益生菌的存活情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

發(fā)酵西番蓮果皮漿（參照張順等人[1]的方法制得）。其中，復(fù)合乳桿菌活菌數(shù)為8.93 lg CFU/g，釀酒酵母菌活菌數(shù)為7.78 lg CFU/g，總酚含量為24.00 μg/mL，總酸含量為4.40 mg/mL；西番蓮，購(gòu)自廣州市天平架水果批發(fā)市場(chǎng)。

1.2 主要試劑

脫脂乳粉、蔗糖、葡萄糖等（均為食用級(jí)或分析純），山東祥瑞藥業(yè)有限公司提供；海藻糖、胰蛋白酶、膽酸鹽、胃蛋白酶，上海源聚生物科技有限公司提供；CMC，上海申光化學(xué)品有限公司提供；β -環(huán)糊精、L -酪氨酸，上海博奧生物科技有限公司提供；麥芽糊精，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、沒(méi)食子酸、重鉻酸鉀，廣州化學(xué)試劑廠提供；三氯乙酸，永華化學(xué)科技（江蘇） 有限公司提供；干酪素，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3 菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei subsp. casei），均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.4 主要培養(yǎng)基

MRS 瓊脂培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基等，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.5 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

JE/T 型電子分析天平，梅特勒-托利多上海儀器有限公司產(chǎn)品；HK-10B 型高速粉碎機(jī)，杭州賽旭食品機(jī)械有限公司產(chǎn)品；電熱鼓風(fēng)干燥箱、LRH型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；MJBL25C4 型攪拌機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品；JM-L80 型膠體磨，溫州富瑞康機(jī)械科技有限公司產(chǎn)品；TGL-16M 型冷凍高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；12ND 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DF101S 型磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品；LDZX-30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；XK97-A 型菌落計(jì)數(shù)器，邦西儀器科技上海有限公司產(chǎn)品。

1.6 溶液配制

（1） 人工胃液的配制。準(zhǔn)確量取濃度1 mol/L 的鹽酸溶液20 mL，加蒸餾水調(diào)節(jié)pH 值，使pH 值達(dá)到2~3，然后分別加入胃蛋白酶，加入量按照1∶10（g∶mL） 的質(zhì)量濃度比計(jì)算，充分溶解后過(guò)濾除菌，制得人工胃液，備用。

（2） 人工腸液的配制。稱取KH2PO43.4 g，加蒸餾水250 mL 溶解，用0.4%的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8，加水稀釋至500 mL，然后按照1∶100（g∶mL） 的質(zhì)量濃度比加入胰蛋白酶，充分溶解后過(guò)濾除菌，制得人工腸液，備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 凍干酵素粉的制備

西番蓮果磨皮去角質(zhì)層→果皮打漿→高壓滅菌→釀酒酵母、乳酸菌混合發(fā)酵→凍干保護(hù)劑調(diào)配→均質(zhì)→真空冷凍干燥→西番蓮酵素粉。

2.2 西番蓮凍干酵素粉保護(hù)劑的篩選

在試驗(yàn)中，選用不同性質(zhì)的保護(hù)劑CMC、麥芽糊精、β -環(huán)糊精、脫脂乳粉及海藻糖，并進(jìn)行配比組合，比較不同組合保護(hù)劑對(duì)凍干酵素粉活菌數(shù)的影響。

不同種類保護(hù)劑添加量組合見(jiàn)表1。

表1 不同種類保護(hù)劑添加量組合/ g·（100 mL）-1

2.3 西番蓮凍干酵素粉的理化特性

2.3.1 凍干酵素粉水分的測(cè)定

常壓干燥法（質(zhì)量法），參照GB/T 5009.3—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定。

2.3.2 凍干酵素粉還原糖及總糖的測(cè)定

3,5 - 二硝基水楊酸比色法，參照GB 5009.7—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。

2.3.3 凍干酵素粉酸度的測(cè)定

酸堿滴定法，參照GB/T 12456—2008 食品中總酸的測(cè)定。

2.3.4 凍干酵素粉總酚的測(cè)定

參照GB/T 8313—2008 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.5 凍干酵素粉氯化鈉的測(cè)定

參照GB 5009.44—2016 食品中氯化物的測(cè)定。

2.3.6 凍干酵素粉中活菌數(shù)測(cè)定

參照GB 4789—2010 中乳酸菌菌落總數(shù)的測(cè)定方法。

2.4 西番蓮凍干酵素粉的生理特性

2.4.1 人工胃液耐受試驗(yàn)

參照艾連中等人[7]報(bào)道的方法，取1 g 酵素粉溶解于9 mL 生理鹽水中，放入磁力攪拌器37 ℃下水浴加熱，待充分溶解后取1 mL 加入4 支裝有10 mL人工胃液的試管中，放入培養(yǎng)箱中37 ℃下分別培養(yǎng)0.5，1.0，2.0，3.0 h，待相應(yīng)時(shí)間后取出利用稀釋倒平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每組平行試驗(yàn)3 次。

2.4.2 人工腸液耐受試驗(yàn)[8]

取1 g 酵素粉溶解于9 mL 生理鹽水中，放入磁力攪拌器37 ℃下水浴加熱，待充分溶解后取1 mL加入4 支裝有10 mL 人工腸液的試管中，放入培養(yǎng)箱中37 ℃下分別培養(yǎng)0.5，1.0，2.0，3.0 h，在相應(yīng)時(shí)間取出后，利用稀釋倒平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每組平行試驗(yàn)3 次。

2.4.3 膽汁耐受力試驗(yàn)

根據(jù)卜永士等人[9]報(bào)道的方法有所改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取1.00 g 酵素粉分別溶入9 mL 質(zhì)量濃度為0，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0 g/L 膽酸鹽溶液中，在放入磁力攪拌器37 ℃下保溫2 h，取出后利用稀釋倒平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)和存活率。

2.5 數(shù)據(jù)處理

樣品做3 次平行試驗(yàn)，利用WPS office 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和處理，利用Origin Pro8 對(duì)數(shù)據(jù)處理作出相關(guān)圖形。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同保護(hù)劑組合對(duì)真空冷凍干燥酵素粉中活菌數(shù)影響

在益生菌真空冷凍干燥過(guò)程中，CMC 具有較好的菌體保護(hù)作用，并能夠改善粉體的流動(dòng)性、溶解度等特性，在此基礎(chǔ)上，加入脫脂乳粉和海藻糖，以提高酵素粉中的益生菌存活率。

不同保護(hù)劑組合對(duì)冷凍干燥活菌數(shù)及存活率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同保護(hù)劑組合對(duì)冷凍干燥活菌數(shù)及存活率的影響

在未添加凍干保護(hù)劑直接干燥的空白對(duì)照酵素粉中，益生菌存活率較低，只有62%，而添加了凍干保護(hù)劑的組合c，活菌數(shù)和存活率較直接干燥的酵素粉a 對(duì)照分別提高了34.9%和21.0%，說(shuō)明加入保護(hù)劑后，對(duì)酵素粉的益生菌保護(hù)效果明顯；另外，比較組合b 和c 可以看出，c 組合中將等量的脫脂乳粉換成海藻糖，其活菌數(shù)和存活率分別比b 提升了9.8%和8.0%，證明了海藻糖能夠保護(hù)菌體活力，使之免受干燥過(guò)程中的損傷。

3.2 凍干西番蓮酵素粉的理化特性結(jié)果分析

不同處理方式的凍干西番蓮酵素粉見(jiàn)圖2，酵素粉一般理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，酵素粉特征性指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 不同處理方式的凍干西番蓮酵素粉

表2 酵素粉一般理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果/%

表3 酵素粉特征性指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由圖2 可看出，未添加凍干保護(hù)劑的酵素粉色澤偏淡黃色，且粉體顆粒大，較為粗糙，西番蓮果皮發(fā)酵液中纖維成分豐富，因此在干燥后粉體質(zhì)感較為粗糙。而加入了凍干保護(hù)劑的試驗(yàn)組則色澤偏淡，但粉體均勻細(xì)膩，沒(méi)有顆粒感，說(shuō)明加入的脫脂乳粉、海藻糖等既可作為益生菌保護(hù)劑起到保護(hù)作用，又可以改善粉體性質(zhì)。

根據(jù)TCBFIA 08001—2016 酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)食用植物酵素，將凍干酵素粉中的理化指標(biāo)分為一般理化指標(biāo)和特征性指標(biāo)[10]。從表2 中看出，添加保護(hù)劑的試驗(yàn)組和和未添加的空白組，都均未檢出乙醇，氯化鈉含量均在標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)；從表3 可知，空白組總酸和總酚含量高于添加了保護(hù)劑的試驗(yàn)組，這是因?yàn)樘砑恿藘龈杀Ｗo(hù)劑的酵素粉中因含有麥芽糊精、脫脂乳粉和海藻糖、總酚和總酸占比下降；同理，添加了海藻糖的凍干酵素粉中，因額外添加的糖使總糖含量高于空白組；而關(guān)鍵性指標(biāo)、益生菌活菌數(shù)方面，添加保護(hù)劑的試驗(yàn)組顯著高于空白組，其乳酸活菌數(shù)達(dá)到8.08 lg CFU/g，遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)要求的5. 00 lg CFU/g；多酚含量也高于標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.3 凍干西番蓮酵素粉的模擬消化條件下菌體活力結(jié)果分析

3.3.1 酵素粉中益生菌在模擬胃液環(huán)境下的存活率結(jié)果分析

胃液的酸度極高，通常其pH 值在1~3，在消化食物時(shí)會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)，這樣的酸性環(huán)境下大部分微生物都難以存活，食物在人體胃部的停留時(shí)間一般在3 h。要保證益生菌能“安全”到達(dá)人體腸道而進(jìn)一步定植，以發(fā)揮抑制有害菌群增殖、增強(qiáng)腸道免疫等生理作用，益生菌需要耐受胃液的嚴(yán)苛環(huán)境。

模擬胃液環(huán)境下的活菌數(shù)和存活率變化情況見(jiàn)圖3。

圖3 模擬胃液環(huán)境下的活菌數(shù)和存活率變化情況

由圖3 可知，在模擬胃液環(huán)境下，酵素粉中的活菌數(shù)隨消化時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，在模擬消化時(shí)間0.5 h 時(shí)活菌數(shù)有8.86 lg CFU/g，存活率達(dá)到98%，而在經(jīng)過(guò)3 h 后的胃液消化后活菌數(shù)為7.00 lg CFU/g，存活率為77%，說(shuō)明在模擬胃液環(huán)境下，酵素粉中的益生菌能夠保持較好的活力，以保證食用后發(fā)揮益生菌的功效。

3.3.2 酵素粉中益生菌模擬腸液環(huán)境下的存活率結(jié)果分析

食物經(jīng)過(guò)胃液的消化后會(huì)進(jìn)入腸道，而腸道內(nèi)是人體微生物聚集的部位，其種類和數(shù)量都很多，包括對(duì)人體有益的益生菌和對(duì)人體有害的有害菌群。益生菌對(duì)小腸液必須具有一定的耐受性才能更好地發(fā)揮作用。小腸液的pH 值大約為7.6，無(wú)論是固體還是液體食物通過(guò)小腸的平均時(shí)間約為1.5 h。

模擬腸液環(huán)境下的活菌數(shù)和存活率變化情況見(jiàn)圖4。

圖4 模擬腸液環(huán)境下的活菌數(shù)和存活率變化情況

由圖4 可知，在初始消化時(shí)間0.5 h 和1.0 h時(shí)，活菌數(shù)維持在較高水平，無(wú)明顯下降，達(dá)到8.86 lg CFU/g 左右，說(shuō)明益生菌對(duì)模擬腸液的適應(yīng)性較好；而在消化后期，益生菌活菌數(shù)開(kāi)始下降，在3 h 活菌數(shù)對(duì)數(shù)值還有8.00 lg CFU/g 左右，而存活率也達(dá)到88%。即在模擬腸液下，酵素粉中的益生菌在前期3 h 內(nèi)能夠保持在90%的存活率，能夠在經(jīng)過(guò)腸液環(huán)境后依然能保證較高的存活數(shù)，并順利進(jìn)入其他消化環(huán)境中。

3.3.3 酵素粉中益生菌模擬膽汁環(huán)境下的存活性結(jié)果分析

人體內(nèi)的膽汁含有一定膽酸，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為0.3%~3.0%。膽酸鹽對(duì)微生物具有一定的抑制作用，因此要發(fā)揮益生菌在人體腸道定植的作用，對(duì)膽酸鹽的耐受性也是重要指標(biāo)。

不同膽酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的活菌數(shù)及存活率變化情況見(jiàn)圖5。

圖5 不同膽酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的活菌數(shù)及存活率變化情況

由圖5 可知，選擇模擬膽汁酸的作用時(shí)間均為2 h（進(jìn)餐消化后1~2 h 內(nèi)的血清膽汁酸水平會(huì)急劇升高），在較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，酵素粉中的活菌數(shù)維持在7.00 lg CFU/g 左右，而在升高膽酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，益生菌活菌數(shù)會(huì)迅速下降，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的高水平時(shí)，存活率為64%，活菌數(shù)下降為5.78 lg CFU/g，低于益生菌最低發(fā)揮作用數(shù)量級(jí)6.00 lg CFU/g 的要求，但總體看，在膽酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于非極端條件下的益生菌仍可以維持較高的活性水平。

3.4 討論

試驗(yàn)中，在CMC、麥芽糊精和β -環(huán)糊精基礎(chǔ)上，添加了脫脂乳粉和海藻糖，后兩者可以明顯提高益生菌酵素粉的活性。脫脂乳粉為大分子物質(zhì)，可在細(xì)胞表面形成保護(hù)層，以減少細(xì)胞暴露在氧氣及介質(zhì)中的面積，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其適用性強(qiáng)，對(duì)不同的益生菌類均能起到很好的保護(hù)作用；而海藻糖一方面作為非還原性多糖，其含有多個(gè)極性較強(qiáng)的親水羥基，能夠在脫水干燥過(guò)程中，在菌體細(xì)胞表面形成保護(hù)膜，保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，其玻璃化溫度較高、吸濕性低，很適合作為活性成分干燥保護(hù)劑[11-14]。另外，海藻糖作為功能性低聚糖，有研究也表明其可以促進(jìn)益生菌在體內(nèi)的增殖，提高人體的免疫力，從而發(fā)揮預(yù)防腸道疾病的作用[13，15-18]。

4 結(jié)論

以真空冷凍干燥法制備西番蓮果皮酵素粉，比較了不同干燥保護(hù)劑對(duì)凍干酵素粉的理化特性、菌體活力的影響，并對(duì)模擬消化條件下酵素粉中益生菌活力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)論如下：

（1） 海藻糖、脫脂乳粉凍干保護(hù)劑在西番蓮果皮酵素粉凍干過(guò)程中，起到了保護(hù)益生菌和改善粉體性質(zhì)的作用。添加了保護(hù)劑的酵素粉較直接干燥的酵素粉，其益生菌存活率提高了34.9%，且粉體更加細(xì)膩均勻，適合進(jìn)行后續(xù)的保存與應(yīng)用。

（2） 該條件下生產(chǎn)的凍干酵素粉在模擬人體消化試驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的耐受性，胃液消化3 h 后，活菌數(shù)7.00 lg CFU/g，存活率為77%；在腸液中3 h 后，活菌數(shù)8.00 lg CFU/g，而存活率也達(dá)到88%；在中等濃度膽酸鹽的模擬膽汁中，活菌數(shù)高于6.00 lg CFU/g標(biāo)準(zhǔn)要求。較高的活菌數(shù)和存活率保證了益生菌酵素粉進(jìn)入人體環(huán)境后能定植成功，發(fā)揮相應(yīng)的作用。

（3） 該工藝下制得的凍干酵素粉中，雖然益生菌存活性較高，但是總酸和含糖量偏低，產(chǎn)品應(yīng)用還需要從發(fā)酵工藝和后期凍干添加劑上進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，試驗(yàn)只對(duì)其儲(chǔ)存特性進(jìn)行了初步的驗(yàn)證和分析，對(duì)于該益生菌酵素粉的最佳儲(chǔ)存方式未做討論，因此后續(xù)還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其儲(chǔ)存、包裝等性質(zhì)的研究。