陳 琨，汪 穎，王 靜，龔 方，蘭冬雪，4，瞿茜楠，4，李兆杰*

（1 青島農(nóng)業(yè)大學 山東 青島 266109 2 威海海關 山東 威海 264205 3 中共青島西海岸新區(qū)工委軍民融合辦 山東 青島 266000 4 青島特種食品研究院 山東 青島 266109）

傅里葉變換紅外光譜 （Fourier transformation infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR） 技術主要是把干涉條紋的圖像信息轉換成離散的數(shù)字量，再進行傅里葉變換得到被測樣品紅外光譜的技術[1]，具有掃描速度快，分辨率和靈敏度較高的優(yōu)點，廣泛應用于定性、定量分析、性能表征、成分檢測等眾多領域[2]。許多研究者優(yōu)化和調整了技術條件，并與其它分析技術聯(lián)用獲取被分析物質的綜合信息[3-4]，采用更精準、有效的化學計量方法，建立適合分析目標的數(shù)學模型，提高技術的精度和準確度。比如Mourad 等[5]利用FT-IR 技術結合校正模型偏最小二乘回歸法（PLSR）量化了酸度、儲存材料、吸收度對油類儲存期間新鮮程度的影響；Adiani 等[6]分別研究了兩種獲取食品化學指紋數(shù)據(jù)的方法，同樣采用PLSR 統(tǒng)計分析，分別建立了單一GC-MS模型和基于FTIR 的補充模型，結果表明基于FTIR 的補充模型可以準確預測87%的樣品，而GCMS 的準確預測為53%，為建立基于FT-IR 的隨機食品樣品質量預測模型提供了新的選擇。此外，Naumanan 等[7]指出傅里葉變換紅外光譜法具有判別、分類和鑒別微生物的能力。Rebuffo-scheer 等[8]利用傅里葉紅外光譜技術為非結核分歧桿菌種屬的高效鑒定提供了方法研究。王萍等[9]建立了4 種假單胞菌的光譜數(shù)據(jù)庫和FT-IR 分類方法。

采用傅里葉紅外光譜技術進行微生物種類鑒定較多集中在屬內(nèi)種間水平。如：Lefier 等[10]運用FT-IR 技術結合標準差分析 （Canonical variates analysis,CVA）方法，能夠將默式李斯特菌與李斯特桿菌的其它6 個種區(qū)分開，同時對單核細胞增生李斯特菌的5 個血清型進行初步分類，為FTIR 技術在細菌亞種水平上分類的應用奠定基礎。細菌亞種的分類依據(jù)主要是基于生物學特性方面的差別[11]。甲型、乙型、丙型是副傷寒沙門氏菌屬內(nèi)3 個不同的亞種或血清型，是水和食品的重要污染菌。許龍巖等[12]建立了基于TaqMan 探針的四重熒光PCR 檢測方法，用于鑒定沙門氏菌的3 個亞種，比較而言，分子生物學檢測方法對技術要求較高，操作復雜，成本較高。本文應用FT-IR 技術結合化學計量學方法建立光譜數(shù)據(jù)庫，通過聚類分析建立快速、操作簡單、穩(wěn)定可靠的FT-IR 分類方法，旨在用于細菌亞種的鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標準菌株 甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi A，S.paratyphi A）CMCC 50001、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B，S.paratyphi B）CMCC 50094、丙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi C，S.paratyphi C）CMCC 50095，菌株均從國家微生物菌種保藏中心（CMCC）采購。

1.1.2 加標材料 冷凍鮐鲅魚購于當?shù)厥袌?（大潤發(fā)）。

1.1.3 試劑 營養(yǎng)肉湯和平板計數(shù)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；亞硫酸鉍（Bismuth sulfite，BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（Xylose lysine desoxycholate，XLD）瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。無水乙醇（分析純），上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

傅里葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；核酸蛋白分析儀，美國寶騰國際有限公司；離心機（型號3K15），美國Sigma 公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，中儀國科（北京）科技有限公司；干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 將-70 ℃保藏的3 株標準菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯中，（36±1） ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18～24 h，備用。

挑取3 種活化菌液一環(huán)分別接種于100 mL營養(yǎng)肉湯中，（36±1）℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)18～24 h。測定菌液濃度后，分別吸取3 種菌液各1 mL 于1.5 mL 離心管中，5 000×g 離心5 min，菌泥分別用1 mL 無菌生理鹽水和1 mL 超純水各洗滌2 次，最后用50 μL 超純水懸浮菌泥沉淀，混勻，吸取不同稀釋度的菌懸液各10 μL 于ZnSe 窗片（透過波長7 800～440 cm-1，透過率大于68%，厚度2 mm，直徑25 mm）中心，置于45 ℃烘干，得到菌斑樣品。每個菌株重復試驗8 次，每次3 個樣品重復。

1.3.2 光譜采集 利用傅里葉變換紅外光譜儀對制備好的ZnSe 窗片樣品進行光譜掃描，采集4 000～400 cm-1[13-16]波段范圍內(nèi)的光譜信息，分辨率4 cm-1，掃描64 次，取平均值[17]，儀器設置自動扣除大氣背景。

1.3.3 標準光譜數(shù)據(jù)庫的建立及聚類方法的建立 利用OPUS 6.5 軟件對光譜數(shù)據(jù)進行預處理：首先進行自動基線校正，然后全光譜數(shù)據(jù)進行平滑去噪（一階9 點平滑） 運算后再進行矢量歸一處理，得到導數(shù)譜，最后轉化為DPT 數(shù)據(jù)點格式到excel 數(shù)據(jù)格式，建立標準光譜的數(shù)據(jù)庫，用于聚類方法的建立。

用Metlab 6.5 和Statistica 6.0 軟件對3 種菌在1 805.3～977.9 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和分級聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA），得到甲型、乙型、丙型3 種菌FT-IR 光譜的HCA 和PCA 聚類分布圖，建立3 種副傷寒沙門氏菌的分類鑒定方法。

PCA 和HCA 都是在細菌分類未知的情況下對光譜數(shù)據(jù)進行描述的方法，其中，PCA 在不降低光譜差異的前提下，減少變量維數(shù)，轉化為少數(shù)幾個綜合變量[18]，而后將光譜進行比較，相同光譜歸類畫出散點圖。HCA 是用光譜間的距離作為判定依據(jù)，根據(jù)數(shù)據(jù)本身所具有的定性或定量特征進行歸類和內(nèi)在結構分析[19]，本文采用的是皮爾森積矩相關系數(shù)計算距離，運用Ward's 算法，得到光譜簇間距離。

1.4 加標驗證

1.4.1 供試樣品制備 取解凍后的冷凍鮐鲅魚500 g，剪碎均質后，向其中添加甲型副傷寒沙門氏菌CMCC 50001 溶液（5×102CFU/mL）10 mL，攪拌混勻，冷凍備用。

1.4.2 細菌培養(yǎng) 將冷凍鮐鲅魚供試樣品解凍后，稱取樣品25 g，按照沙門氏菌檢測標準進行增菌培養(yǎng)。

增菌后的培養(yǎng)液劃線接種選擇性培養(yǎng)基BS和XLD，分別置于（36±1） ℃培養(yǎng)24～48 h 后（BS培養(yǎng)48 h），用無菌接種環(huán)挑取可疑菌落一環(huán)，接種于盛有15 mL 營養(yǎng)肉湯的大試管中，（36±1）℃靜置培養(yǎng)18～24 h，盡量控制OD600nm值在0.45 左右。

1.4.3 硒化鋅（ZnSe）窗片的制作 按照1.3.1 節(jié)的方法分別制作各菌的ZnSe 窗片樣品。

1.4.4 光譜采集 按照1.3.2 節(jié)的方法分別采集各個樣品的光譜數(shù)據(jù)。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理及分析 可疑菌做3 個重復，結果取平均值。光譜預處理同1.3.3 節(jié)的方法。

將可疑菌光譜數(shù)據(jù)與1.3 節(jié)所建立的光譜信息數(shù)據(jù)庫進行合并，并應用Metlab 6.5 和Statistica 6.0 對1 805.3～977.9 cm-1范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)分別進行PCA 和HCA 分析，得到分類鑒定結果。甲型副傷寒沙門氏菌應聚類到數(shù)據(jù)庫種對應的甲型副傷寒沙門氏菌聚類群中。

2 結果與分析

2.1 細菌濃度

（36±1）℃振蕩培養(yǎng)18～24 h 后，菌液的吸光值及其對應的菌濃度見表1。

表1 培養(yǎng)后菌液吸光值（OD600nm）及其相應菌濃度Table 1 OD600nm of bacteria and its corresponding concentration

2.2 光譜數(shù)據(jù)庫的建立

紅外光譜中的4 000～400 cm-1波數(shù)范圍能夠對細菌進行較好的分類，其中1 800～900 cm-1是細菌的特征指紋波段。根據(jù)試驗結果，本文確定4 000～600 cm-1為光譜采集波數(shù)范圍，1 805.3～977.9 cm-1為數(shù)據(jù)分析波段范圍。對得到的原始光譜數(shù)據(jù)進行基線校正、歸一化、一階導數(shù)等預處理，得到導數(shù)譜，又對導數(shù)譜進行適量歸一化，建立了3 種副傷寒沙門氏菌的FT-IR 導數(shù)譜數(shù)據(jù)庫。

對各菌株的重復測量譜圖取平均值，見圖1。在1 805.3～977.9 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，各菌株的光譜圖具有相似性，難以直觀辨別，乙型副傷寒沙門氏菌在992.8 cm-1處的峰形與其它2 種菌略微有所不同，而肉眼難以區(qū)分，鑒定分類需要進一步借助計算機和化學計量學運算來分析[20]。

圖1 3 種副傷寒沙門氏菌FTIR 光譜圖Fig.1 FTIR spectra of three subspecies of S.paratyphi

2.3 聚類分析結果

2.3.1 PCA 分析結果 PCA 方法通過簡化變量實現(xiàn)線性降維，選取方差貢獻率最大的前幾個主成分構成空間分布圖，可以對不同種屬的關系遠近進行判定，也可以揭示相同屬、種以及不同生物特征亞種的相似性。以主成分1（PC1）和主成分2（PC2）作為聚類依據(jù)進行PCA 分析，得到甲型、乙型、丙型副傷寒沙門氏菌的PCA 聚類分布圖，見圖2。由圖可知，3 種菌的散點圖被分布在不同的象限內(nèi)，說明FT-IR 結合PCA 分析能夠將3 種菌進行較好的分類和鑒定。主成分PC1、PC2 的權重見圖3，PC1 和PC2 的方差貢獻率分別為39.6%和29.0%，說明這兩個主成分可以解釋原始數(shù)據(jù)68.6%的有效信息，用于PCA 分析具有代表性。

圖2 3 種副傷寒沙門氏菌PCA 聚類分布圖Fig.2 PCA cluster results of three species of S.paratyphi

圖3 3 種副傷寒沙門氏菌PCA 分析中的PC1、PC2 圖Fig.3 Loading plots of PC1 and PC2 obtained from PCA analysis of three species of S.paratyphi

2.3.2 HCA 分析結果 HCA 通常用來估計光譜之間的相似性，選擇合適算法并描繪樹狀分支圖對細菌進行判定。對甲型、乙型、丙型副傷寒沙門氏菌的光譜數(shù)據(jù)HCA 分析結果，見圖4，可見3種菌都被單獨聚為一類，說明通過HCA 分析可以將副傷寒沙門氏菌的3 個亞種進行較好聚類。

圖4 3 種副傷寒沙門氏菌亞種的HCA 聚類分析圖Fig.4 HCA cluster results of three sub-species of S.paratyphi

2.3.3 加標驗證結果 通過向冷凍鮐鲅魚樣品中添加標準菌株，驗證所建立的3 種副傷寒沙門氏菌的FT-IR 光譜數(shù)據(jù)庫及所建立的各菌的FT-IR分類鑒定方法，結果見圖5、圖6。由圖可知，從樣品中分離的甲型副傷寒沙門氏菌成功聚類到數(shù)據(jù)庫中對應的甲型副傷寒沙門氏菌標準菌株聚類群中，因此可以對可疑目標菌的所屬亞種做出初步判斷。驗證試驗說明本文建立的3 種副傷寒沙門氏菌的標準菌株光譜數(shù)據(jù)庫，能夠實現(xiàn)對可疑目標菌的歸類分析，也說明本文所建立的3 種副傷寒沙門氏菌的FT-IR 分類鑒定方法不僅準確、有效，而且方便、快速，可以在幾分鐘之內(nèi)實現(xiàn)對可疑菌的分類鑒定。

圖5 可疑甲型副傷寒沙門氏菌的PCA 聚類分布圖Fig.5 PCA cluster results of suspected S.paratyphi A

圖6 可疑甲型副傷寒沙門氏菌的HCA 樹狀分布圖Fig.6 HCA cluster results of suspected S.paratyphi A

3 討論

FT-IR 技術在鑒定細菌方面的作用越來越受到重視，其具有簡單、快速、高效等優(yōu)點，而且成本低廉，有助于在食品檢測、臨床醫(yī)學等領域開展快速鑒定。同時，許多研究發(fā)現(xiàn)細菌的培養(yǎng)條件，樣品制備的標準化，光譜掃描的參數(shù)設定，以及光譜分析方法對FTIR 結果的重復性有很大影響[21]，因此應確保可疑菌的所有操作及參數(shù)均與建立光譜數(shù)據(jù)庫保持一致，即確保所有操作及數(shù)據(jù)處理的標準化。有研究者在試驗中選用等量的干菌粉收集光譜后，重復性比菌斑效果更穩(wěn)定[22]，可以在進一步研究中進行借鑒。也有研究發(fā)現(xiàn)在試驗用量范圍內(nèi)，微生物量的變化對譜圖無明顯影響[23]。本文研究發(fā)現(xiàn)細菌的濃度對細菌種間鑒定存在一定的影響，應盡量保證濃度的統(tǒng)一，減少對后期分析的影響。

FT-IR 技術結合計量學應用于細菌分類的基礎是通過光譜信息反映了菌體的生化組成成分的特征[24-25]，如同菌體的指紋信息，因此可以通過分析光譜的組成變化來研究不同菌體的分類，然而由于這些區(qū)別數(shù)據(jù)量較大，往往肉眼無法得到結果[6，26-27]。在應用FT-IR 技術時，常需要把FT-IR技術和化學計量分析方法相結合，分析獲取的綜合信息，利用包括PCA、HCA 等在內(nèi)的數(shù)學計算模型，提高FT-IR 譜圖分析的準確度[28]。

甲型、乙型、丙型3 種副傷寒沙門氏菌作為重要的食源性致病菌，采用常規(guī)生化方法、免疫學及分子生物學方法等操作，往往存在程序繁瑣、耗時較長等缺點，因而易受干擾，常出現(xiàn)假陰性或者假陽性的結果[29]。相比較而言，F(xiàn)T-IR 技術在微生物分類鑒定上，具有操作簡單，前處理少，分析速度快等優(yōu)點[30]。本文利用FT-IR 技術，建立各菌的光譜數(shù)據(jù)庫，通過PCA、HCA 分析方法，構建了3 種菌的分類鑒定方法，驗證試驗結果也表明FT-IR技術結合化學計量學方法用于副傷寒沙門氏菌亞種的分類鑒定是穩(wěn)定有效的。