聶 穎，張領(lǐng)領(lǐng)，胡軍峰，徐輝甫

(武漢市第一醫(yī)院兒科，湖北 武漢 430022)

支氣管哮喘(哮喘)是兒童中常見的慢性肺部疾病，兒童哮喘因病情反復(fù)發(fā)作、遷延不愈等特點(diǎn)，對(duì)其身心健康及家庭和社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)、精神負(fù)擔(dān)[1]。目前全球約有3億哮喘患者，其中兒童發(fā)病率約占總發(fā)病率的一半[2]。中國(guó)16城市兒童哮喘患病率20年對(duì)比研究顯示，0～14歲中國(guó)兒童哮喘的總患病率較10年及20年前分別上升了43.4%和147.9%[3]。近年來，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotropic factors，BDNF)參與哮喘氣道炎癥反應(yīng)的過程日益受到關(guān)注。臨床研究表明，BDNF不僅參與了兒童哮喘的發(fā)病，且與兒童哮喘發(fā)病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不明確[4-5]。本研究通過建立過敏性哮喘小鼠模型，運(yùn)用重組人BDNF及其抑制劑TrkB/Fc對(duì)哮喘模型進(jìn)行干預(yù)，觀察干預(yù)肺組織中BDNF表達(dá)的變化及氣道炎癥、炎癥相關(guān)因子白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)表達(dá)的變化情況，探討B(tài)DNF參與哮喘氣道炎癥的分子機(jī)制，為兒童哮喘的病情評(píng)估及精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 主要材料

雞卵清蛋白(ovlbumin，OVA，Sigma公司)，重組人BDNF(美國(guó)PeproTech)，TrkB/Fc(美國(guó)R&D公司)；一抗：Anti-BDNF(美國(guó)Abcam公司)；二抗：山羊抗兔辣根過氧化物酶(美國(guó)Santa Cruz公司)；小鼠IL-17A ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)、小鼠Eotaxin ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2019年10月至12月飼養(yǎng)于武漢市第一醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的雌性3～4周齡C57/B6J小鼠40只，體重10～12g。該實(shí)驗(yàn)獲武漢市第一醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)和利用委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)穩(wěn)定于約25℃，相對(duì)濕度約70%，晝夜照明12/12h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哮喘模型的建立

依據(jù)有關(guān)參考文獻(xiàn)[6]建立哮喘小鼠動(dòng)物模型。哮喘組小鼠于第1、13天經(jīng)其腹腔注射0.01%OVA/A1(OH)3，混合液0.1mL[內(nèi)含OVA 10μg和A1(OH)3凝膠20mg]致敏，從第25天開始，每天以1%OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)30min，連續(xù)7天。正常對(duì)照組小鼠致敏及激發(fā)時(shí)均以生理鹽水替代OVA。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及藥物的干預(yù)

以隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為五組，每組8只，分別為A組：正常對(duì)照組；B1組：哮喘組(模型未干預(yù)組)；B2組：哮喘+生理鹽水干預(yù)組；B3組：哮喘+重組人BDNF干預(yù)組；B4組：哮喘+TrkB/Fc干預(yù)組。模型激發(fā)的第25天開始，激發(fā)前1h將各干預(yù)組小鼠以10%水合氯醛4mL/kg腹腔注射麻醉，剪開頸部皮膚行氣道插管，將2μg/小鼠的重組人BDNF或1μg/小鼠的TrkB/Fc溶解于50μL的0.9%氯化鈉中，氣道內(nèi)滴注給藥，連續(xù)7天，每日1次。

1.2.3 HE染色及肺組織的病理評(píng)分

石蠟切片二甲苯脫蠟，酒精脫水，置于HE染色5min，酒精分化10s，流水沖洗返藍(lán)20min，HE染色20s，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

肺組織的病理評(píng)分參照Lee等[7]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度判定：0分為沒有炎癥細(xì)胞；1分為可偶見炎癥細(xì)胞；2分為可見薄層(1～5個(gè))炎癥細(xì)胞；3分為可見厚層(>5個(gè))炎癥細(xì)胞。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)肺組織中BDNF蛋白的表達(dá)

肺組織50mg置于勻漿管中加入組織裂解液500μL裂解30min，提取蛋白并調(diào)整蛋白濃度。樣品加熱變性后電泳轉(zhuǎn)至聚偏二乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液室溫振蕩封閉2h后洗膜，加入一抗羊抗鼠BDNF單克隆抗體(1∶1 000，Abcam公司)4℃室溫孵育過夜，第2天加入二抗辣根酶標(biāo)記羊抗兔(1:5 000，Santa Cruz公司)室溫孵育1h，小鼠β-actin作內(nèi)參照，用LAS3000圖像分析系統(tǒng)，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值進(jìn)行定量分析。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)肺組織中IL-17A、Eotaxin水平

采用ELISA法檢測(cè)IL-17A、Eotaxin水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行具體操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)改變及肺組織的病理評(píng)分

2.1.1 肺組織的病理改變

正常對(duì)照組(A組)小鼠細(xì)支氣管和肺泡壁結(jié)構(gòu)清晰，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；哮喘組(B1組)小鼠細(xì)支氣管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜增厚；哮喘+生理鹽水干預(yù)組(B2組)小鼠細(xì)支氣管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞增生，肺泡間隔增寬；哮喘+重組人BDNF干預(yù)組(B3組)小鼠細(xì)支氣管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏液分泌增多、管腔狹窄，平滑肌層、基底層增厚，較B1組、B2組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯加重；哮喘+TrkB/Fc干預(yù)組(B4組)小鼠細(xì)支氣管周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，較B1組明顯減輕，見圖1。

2.1.2 肺組織的病理評(píng)分

五組的肺組織病理評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B1、B2、B3、B4組的病理評(píng)分均顯著高于A組(P<0.01)；B2組與B1組病理評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B3組病理評(píng)分顯著高于B1組(P<0.01)，B4組病理評(píng)分顯著低于B1組(P<0.01)；B3組病理評(píng)分顯著高于B2組(P<0.01)，B4組病理評(píng)分顯著低于B2組(P<0.01)；B4組病理評(píng)分顯著低于B3組(P<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠肺組織的病理評(píng)分的比較Table 1 Comparison of pathological score of lung tissues of the mice among the five groups

2.2 各組小鼠肺組織中BDNF蛋白的表達(dá)

應(yīng)用Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)，五組的肺組織中BDNF蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B1、B2、B3組的BDNF蛋白表達(dá)均高于A組(P<0.01)，B4組與A組BDNF蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B2組與B1組BDNF蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B3組BDNF蛋白表達(dá)顯著高于B1組(P<0.05)，B4組BDNF蛋白表達(dá)顯著低于B1組(P<0.01)；B3組BDNF蛋白表達(dá)顯著高于B2組(P<0.01)，B4組BDNF蛋白表達(dá)顯著低于B2組(P<0.01)；B4組BDNF蛋白表達(dá)顯著低于B3組(P<0.01)，見圖2、表2。

表2 各組小鼠肺組織BDNF蛋白表達(dá)的比較Table 2 Comparison of expression level of BDNF protein in lung tissues of the mice among the five groups

2.3 各組小鼠肺組織中IL-17A和Eotaxin水平的表達(dá)

2.3.1 各組小鼠肺組織中IL-17A水平的表達(dá)

應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-17A水平，五組的IL-17A水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B1、B2、B3、B4組的IL-17A水平均顯著高于A組(P<0.01)；B2組與B1組IL-17A水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B3組IL-17A水平顯著高于B1組(P<0.01)，B4組IL-17A水平顯著低于B1組(P<0.05)；B3組IL-17A水平顯著高于B2組(P<0.01)，B4組IL-17A水平顯著低于B2組(P<0.01)；B4組IL-17A水平顯著低于B3組(P<0.01)，見表3。

表3 各組小鼠肺組織中IL-17A水平的比較Table 3 Comparison of IL-17 level in lung tissues of the mice among the five groups

2.3.2 各組小鼠肺組織中Eotaxin水平的表達(dá)

應(yīng)用ELISA法檢測(cè)Eotaxin水平，五組的Eotaxin水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B1、B2、B3、B4組的Eotaxin水平均顯著高于A組(P<0.01)；B2組與B1組Eotaxin水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B3組Eotaxin水平顯著高于B1組(P<0.01)，B4組Eotaxin水平顯著低于B1組(P<0.01)；B3組Eotaxin水平顯著高于B2組(P<0.01)，B4組Eotaxin水平顯著低于B2組(P<0.01)；B4組Eotaxin水平顯著低于B3組(P<0.01)，見表4。

表4 各組小鼠肺組織中Eotaxin水平的比較Table 4 Comparison of Eotaxin level in lung tissues of the mice among the five groups

3 討論

3.1 BDNF促進(jìn)兒童哮喘氣道炎癥的發(fā)生

馮帥等[8]研究表明，BDNF Val66Met基因多態(tài)性(Val/Val、Met/Met)在哮喘患兒中顯著升高，說明功能性BDNF的多態(tài)性(rs6265)與兒童哮喘呈正相關(guān)，且助于兒童嚴(yán)重哮喘的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中BDNF呈過表達(dá)狀態(tài)(P<0.01)；同時(shí)運(yùn)用重組人BDNF或其抑制劑TrkB/Fc對(duì)模型進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，哮喘+重組人BDNF干預(yù)組肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較哮喘組明顯加重，而哮喘+TrkB/Fc干預(yù)組肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較哮喘組明顯減輕，說明BNDF參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生過程，BDNF高表達(dá)可誘導(dǎo)、趨化氣道炎癥因子的釋放。Freeman等[9]研究顯示，在人類氣道平滑肌細(xì)胞(ASM)中存在通過囊泡自分泌BDNF，其通過對(duì)受體電位3(TRPC3)通道的調(diào)節(jié)，使Ca2+內(nèi)流增加氣道張力及促進(jìn)氣道炎性因子IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放。Müller等[10]對(duì)6～15歲哮喘持續(xù)期患兒的血漿BDNF水平和各種炎癥標(biāo)志物(CCL3、CCL11、CCL22、CCL24等)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中、重度哮喘患兒BDNF水平顯著增高，而其他各種炎癥標(biāo)志物與對(duì)照組均無差異，提示BDNF是一種潛在的哮喘患兒臨床嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。由此提示BDNF參與了兒童哮喘氣道炎癥的發(fā)生，在哮喘的發(fā)病過程中起促進(jìn)作用。故本研究通過BDNF對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行干預(yù)，以氣道炎癥為切入點(diǎn)，了解其下游氣道炎癥介質(zhì)的變化，進(jìn)一步明確其分子機(jī)制，為兒童哮喘的診斷、預(yù)防及治療提供新的思路。

3.2 BDNF介導(dǎo)氣道炎癥因子IL-17A和Eotaxin的釋放促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生

本研究顯示，與正常對(duì)照組比較，哮喘小鼠的氣道炎癥因子IL-17A、Eotaxin均呈高表達(dá)(P<0.01)；而哮喘+重組人BDNF干預(yù)組中IL-17A、Eotaxin的表達(dá)均較哮喘組顯著升高(P<0.01)，哮喘+TrkB/Fc干預(yù)組中IL-17A、Eotaxin的表達(dá)均顯著低于哮喘組(P<0.05)。IL-17通常是指IL-17A，是IL-17家族中最先被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，是Th1細(xì)胞重要的效應(yīng)因子；IL-17A通過參與炎癥反應(yīng)和宿主抗感染免疫，直接或間接地參與了哮喘的病理生理過程[11]。在兒童哮喘發(fā)作期，患兒血清中IL-17表達(dá)顯著增高，且經(jīng)治療后IL-17表達(dá)顯著下降，故IL-17參與了哮喘的發(fā)病，且與兒童哮喘病情嚴(yán)重程度正相關(guān)[12-13]。在幼年哮喘大鼠模型中，IL-17可通過誘導(dǎo)CCL4、CXCL1、GM-CSF等細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)炎性因子的激活和炎性細(xì)胞向氣道的浸潤(rùn)，由此提示IL-17在兒童哮喘氣道炎癥中發(fā)揮著重要作用[14]。研究表明，嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)浸潤(rùn)是哮喘發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，在學(xué)齡期哮喘患兒急性發(fā)作組、慢性持續(xù)組和緩解組血中EOS均顯著升高，且與哮喘患兒肺功能呈負(fù)相關(guān)[15]。Eotaxin是一種β-趨化因子，能特異性地募集、趨化和活化EOS，在哮喘患兒中顯著增高，與其疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)[16]。Eotaxin通過特異性地與EOS上高表達(dá)的Eotaxin特異性受體C-C趨化因子受體-3(C-CR3)結(jié)合，激活分裂素活化蛋白(MAP)激酶，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-2(ERK2)和p38，使EOS聚集浸潤(rùn)，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞活化、炎癥介質(zhì)釋放而引起氣道炎癥及氣道高反應(yīng)[17]。結(jié)合本研究通過重組人BDNF或其抑制劑TrkB/Fc對(duì)哮喘模型進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)BDNF可促進(jìn)哮喘氣道炎癥的發(fā)生，同時(shí)對(duì)肺組織細(xì)胞因子IL-17A、Eotaxin起正性調(diào)節(jié)作用，由此提示BDNF可能通過促進(jìn)氣道炎癥因子IL-17A、Eotaxin的釋放而參與兒童哮喘的發(fā)病過程。

3.3 IL-17A和Eotaxin參與氣道炎癥的可能機(jī)制及進(jìn)一步的研究方向

IL-17A與IL-17R復(fù)合物結(jié)合后可引起氣道上皮細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中的IL-1β、IL-6、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)增加，促使中性粒細(xì)胞的聚集而參與哮喘的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在BDNF干預(yù)下，IL-17A和Eotaxin的表達(dá)均顯著升高，由此推測(cè)，在過敏性哮喘小鼠模型中，BDNF作用于模型后可上調(diào)小鼠氣道IL-17A的分泌增多，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子Eotaxin的表達(dá)，使EOS活化、聚集而參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生。IL-17A、Eotaxin均與兒童哮喘發(fā)作密切相關(guān)，且與兒童哮喘疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而本研究顯示在哮喘小鼠中IL-17A和Eotaxin呈同步升高，具有一定的關(guān)聯(lián)性，因此可進(jìn)一步研究其在幼年哮喘小鼠中的作用機(jī)制，為兒童哮喘的評(píng)估及治療提供新的思路。