李 敏，張慶娥，董晶晶，周月云，鄭建麗

(鹽城市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，江蘇 鹽城 224001)

先天性遺傳缺陷是導(dǎo)致死胎、畸形、發(fā)育不良等不良妊娠結(jié)局的重要因素，其不僅降低新生兒出生質(zhì)量，還對社會和家庭造成極大的負擔，因此產(chǎn)前及早發(fā)現(xiàn)并采取干預(yù)措施有利于提高人口素質(zhì)[1]。隨著我國產(chǎn)前超聲診斷技術(shù)、無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)、唐氏血清學篩查等方法的普及，胎兒疾病高風險的檢出率得到提升，但其準確性較低，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此對于高風險孕婦宜采用介入性產(chǎn)前檢查輔助診斷[2]。染色體核型能通過分析染色體形態(tài)特征，判斷胎兒是否存在染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常，常作為金標準；然而其分辨率較低，只能分辨較大的染色體缺失、重復(fù)，無法獲取微小的變異片段，可能導(dǎo)致致病性變異漏診[3]。而染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)則是對全基因組水平檢測，可發(fā)現(xiàn)染色體亞結(jié)構(gòu)異常，已被臨床廣泛應(yīng)用，但CMA是否能代替染色體核型分析尚存爭議[4]。本研究分析了行染色體核型分析及CMA介入性產(chǎn)前檢查孕婦的診斷結(jié)果，探討CMA運用于產(chǎn)前診斷的臨床價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2021年1月在鹽城市婦幼保健院接受介入性產(chǎn)前檢查染色體核型分析及CMA的孕婦808例為研究對象，其中不良孕產(chǎn)史148例、NIPT篩查異常148例、超聲檢查異常(結(jié)構(gòu)異常、軟指標異常)167例、高齡孕婦132例、血清學篩查異常84例、父母染色體異?；蚱渌?29例。本研究通過倫理審查。納入標準：①病歷資料完整；②所有孕婦均自愿接受介入性產(chǎn)前診斷；③簽署知情同意書。排除標準：①羊水樣本不合格；②母血污染；③多胎妊娠；④輔助生殖受孕。

1.2 方法

1.2.1 胎兒羊水標本的采集

對妊娠16～24周孕婦采用超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)，抽取胎兒羊水30mL；均在無菌條件下進行所有操作。

1.2.2 染色體核型分析

取胎兒羊水標本20mL，行羊水細胞培養(yǎng)、收獲、固定、制片、G顯帶、掃描、拍照，參照人類細胞遺傳學國際命名體制[5]對染色體進行分析和判讀。

1.2.3 CMA的檢測

取胎兒羊水樣本10mL，提取羊水基因組DNA，采用全基因組芯片(美國Affymetrix公司CytoScan 750H芯片)對羊水全基因組DNA樣本進行CMA檢測，步驟為：酶切、連接、PCR擴增、純化、片段化、標記、芯片雜交、洗滌及掃描，采用自帶軟件分析芯片數(shù)據(jù)，結(jié)果與DGV、DECIPHER、OMIM等公開數(shù)據(jù)庫對比，參照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南[6]將拷貝數(shù)目變異(copy number variations，CNVs)分為致病性、良性及臨床意義不明的CNV(variants of unknown significance，VUS)。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示，行χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床指征分類染色體異常情況

在808例胎兒羊水樣本中，CMA共檢出染色體數(shù)目異常79例(9.78%)，其中21三體41例(51.90%)、18三體15例(18.99%)、X三體13例(16.46%)、X四體1例(1.27%)、Y三體6例(7.59%)、其他三體3例(3.80%)，與染色體核型分析一致；染色體核型分析檢出染色體結(jié)構(gòu)異常9例(1.11%)，其中缺失3例(33.33%)、重復(fù)2例(22.22%)、嵌合體4例(44.44%)；CMA檢出CNVs異常93例(11.51%)，其中微重復(fù)55例(59.14%)、微缺失38例(40.86%)，雜合性缺失(LOH)/單親二倍型(UPD)10例，見表1。

CMA染色體異常檢出率為23.02%(186/808)，明顯高于染色體核型分析的10.89%(88/808)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=42.208，P<0.001)。

2.2 CMA的CNVs類型檢查情況

在93例CNVs異常中，9例為致病性，包括不良孕產(chǎn)史2例、NIPT篩查異常2例、超聲檢查異常4例、父母表型異常1例，分別與4、8、9、13、16、22號染色體有關(guān)，異常片段大小為537.0Kb～70.8Mb，見表2。CNVs異常中，VUS占64.52%(60/93)，良性占25.81%(24/93)，致病性CNVs占9.68%(9/93)；VUS和良性的發(fā)生率均明顯高于致病性CNVs發(fā)生率，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=62.004，P<0.001；χ2=8.392，P=0.004)。

表1 不同臨床指征分類CMA染色體異常檢測結(jié)果(n)Table 1 Chromosomal abnormalities in different clinical indication categories(n)

表2 CMA的致病性CNVs檢查結(jié)果Table 2 Pathogenic CNVs examination results of CMA

2.3 CMA的LOH/UPD檢查情況

CMA共檢出10例LOH/UPD，包括NIPT篩查異常3例、不良孕產(chǎn)史1例、超聲檢查異常2例、高齡孕婦1例、血清學篩查高風險2例、父母表型異常1例，分別與1、3、5、6、8、11、12、13、19、20號染色體有關(guān)，異常片段大小為10.1～18.5Mb，見表3。

表3 CMA的LOH/UPD檢查結(jié)果Table 3 LOH/UPD inspection results of CMA

3 討論

隨著我國生育政策的放開，高危妊娠情況明顯增加，先天缺陷兒出生率有所增加，給其家庭和社會帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔，產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷對降低出生缺陷發(fā)生率、提高人口素質(zhì)具有重要意義。產(chǎn)前篩查是通過了解孕婦的孕產(chǎn)史、年齡、檢測其血液指標，以及超聲檢查等方式篩出染色體異常的高危孕婦，產(chǎn)前診斷則是通過遺傳學手段明確診斷產(chǎn)前高風險[7]。

3.1 CMA與染色體核型分析

染色體核型分析是通過獲取羊水中的細胞進行培養(yǎng)，借助G顯帶技術(shù)，對比人染色體正常數(shù)目、長度、著絲點位置、臂比等核型不同特征，對染色體進行分析、配對、編號和排序，并進行染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目形態(tài)分析，可有效地確定染色體的數(shù)量結(jié)構(gòu)異常，但結(jié)果具有一定的主觀性，與操作者技術(shù)水平相關(guān)，檢查時間長[8]。CMA技術(shù)可在全基因組水平檢測染色體異?？截?，尤其是染色體核型分析無法檢測到的微缺失、微重復(fù)等情況。CMA技術(shù)可分為基于微陣列的比較基因組雜交技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP array)技術(shù)[9]。本研究使用的SNP assay技術(shù)只需將待測樣本DNA與已報道的正常基因組數(shù)據(jù)進行對比，即可發(fā)現(xiàn)染色體亞結(jié)構(gòu)的異常；不僅能夠檢出CNVs，還能夠檢測出大多數(shù)的LOH和UPD。目前CMA成為一線臨床遺傳學檢測技術(shù)，并應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。本研究CMA染色體異常檢出率明顯高于染色體核型分析，染色體數(shù)目異常與染色體核型分析結(jié)果一致，但還檢出了較多的CNVs及LOH，因此CMA能提高染色體異常的檢出率。

不良孕產(chǎn)史與子宮發(fā)育、內(nèi)分泌及父母染色體異常等多種因素有關(guān)。不良孕產(chǎn)史父母不平衡易位攜帶可使生殖細胞減數(shù)分裂過程中遺傳物質(zhì)分配不平衡，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、生育智力低下兒等不良妊娠結(jié)局[10]。本研究中，CMA共檢出2例不良孕產(chǎn)史的致病性CNVs，22號染色體與CLTCL1、HIRA、TBX1等29個OMIM基因相關(guān)，涉及22q11.21微缺失綜合征關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括先天性心臟病、腭裂、面容異常、認知障礙、免疫缺陷等；16號染色體與NDE1、MYH11、ABCC6等9個OMIM基因相關(guān)，涉及16p13.11微重復(fù)綜合征關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括智力障礙、發(fā)育遲緩、自閉癥譜系障礙等；提示CMA可進一步篩查染色體異常的因素，指導(dǎo)產(chǎn)前診斷，預(yù)防不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。

3.2 CMA與NIPT篩查

NIPT篩查是對母體外周血的游離DNA片段高通量測序，主要用于篩查胎兒21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征等染色體情況，同時還可提示其他常染色體及性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常問題，具有較高的靈敏度和特異度。母體外周血游離DNA包含母體及胎兒的所有游離DNA，母體存在限制性胎盤嵌合、CNVs，致使游離DNA異常、而胎兒正常導(dǎo)致假陽性，同時若孕周過小，染色體異常的胎兒游離DNA水平過低，會被母體的游離DNA掩蓋導(dǎo)致假陰性結(jié)果，增加了穿刺的風險[11]。本研究中，CMA共檢出2例NIPT篩查異常的致病性CNVs，其中1例位于13號染色體，包含RB1、ZIC2、EDNRB等164個OMIM基因，涉及13q14.11q3微重復(fù)綜合征關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括不同程度的精神障礙、發(fā)育遲緩、面部特征等；另1例位于22號染色體，包含CLTCL1、HIRA、TBX1等44個OMIM基因，涉及22q11.21微缺失綜合征關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括先天性心臟病、腭裂、面容異常、認知障礙、免疫缺陷等；提示CMA檢測可進一步確認假陽性，發(fā)現(xiàn)一些染色體核型分析無法發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失微重復(fù)問題。

3.3 CMA與超聲檢查

超聲檢查是產(chǎn)檢中最常用的影像學檢查方法，可以觀察胎兒的生長發(fā)育狀況，安全快捷，主要觀測包含心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼、泌尿系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)異常，以及NT增厚、NB缺失、側(cè)腦室增寬、腸管回聲增強、脈絡(luò)叢囊腫、心室強光點、單臍動脈、腎盂擴張等軟指標異常情況，但超聲軟指標指導(dǎo)產(chǎn)前診斷尚存爭議，雖然染色體異常的胎兒超聲軟指標異常發(fā)生率較高，但超聲軟指標不具有特異性，不能完全提示胎兒的結(jié)構(gòu)異常，其可能隨著孕周增大而消失，屬一過性特征，染色體正常胎兒也可能發(fā)生超聲異常，造成一定的假陽性[12-13]。本研究中，CMA檢出1例超聲結(jié)構(gòu)異常的致病性CNVs，16號染色體與PRRT2、TBX6、KCTD13等20個OMIM基因相關(guān)，涉及16p13.11復(fù)發(fā)微重復(fù)綜合征關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括發(fā)育遲緩、自閉癥譜系障礙、體重過輕、神經(jīng)行為異常等。本研究中，CMA共檢出3例超聲軟指標異常致病性CNVs，9號染色體與DOCK8、SMARCA2、KANK1等32個OMIM基因相關(guān)，臨床表型包括面部畸形、腸梗阻、發(fā)育遲緩、智力障礙等，4號染色體與FGFR3、LETM1、WHSC1、NELFA等177個OMIM基因相關(guān)，包含Wolf-Hirschhorn綜合征疾病關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括巨頭畸形、語言發(fā)育遲緩、面容異常等；16號染色體與PRRT2、TBX6、KCTD13等23個OMIM基因相關(guān)，涉及16p11.2微重復(fù)綜合征關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括發(fā)育遲緩，智力障礙，自閉癥譜系障礙，肥胖等；22號染色體與CLTCL1、HIRA、TBX1等44個OMIM基因相關(guān)，涉及22q11.2微缺失綜合征關(guān)鍵區(qū)域，臨床表型包括先天性心臟病，腭裂，面容異常，認知障礙，免疫缺陷等。上述均提示CMA能進一步診斷超聲異常的孕婦，提高染色體異常檢出率。

3.4 CMA與唐氏血清學篩查

唐氏血清學篩查通過檢測孕中期血清妊娠相關(guān)血漿蛋白A、絨毛膜促性腺激素、甲型胎兒蛋白、游離雌三醇、抑制素等指標水平，結(jié)合孕婦體征綜合評估胎兒發(fā)育狀態(tài)，主要用于評估我國發(fā)病率高、危害性大的21三體綜合征(檢出率為60%～70%)和18三體綜合征(檢出率為60%～70%)及先天性神經(jīng)管缺陷(檢出率為85%～90%)，因其成本低、快捷，臨床多用于大規(guī)模篩查，但只能評估染色體異常的風險，準確診斷需進一步的檢查[14]。本研究中，CMA檢查未發(fā)現(xiàn)致病性CNVs，但有2例患者檢出LOH，LOH可能與抑癌基因相關(guān)，患癌癥的風險較高。

3.5 小結(jié)

本研究除了檢出上述致病性CNVs，還檢出了大量的VUS，這些不明確的染色體變異可能與機體某些代謝疾病相關(guān)，但無法得到明確的解釋，增加了孕婦及其家屬的心理負擔，其與DGV、DECIPHER、OMIM數(shù)據(jù)庫不完整有關(guān)。

總之，產(chǎn)前篩查后采用CMA技術(shù)與染色體核型分析對比，可明顯提高染色體異常的檢出率，但也檢出了較多的無意義拷貝數(shù)異常，因此需要廣大臨床工作者共同參與完善相關(guān)數(shù)據(jù)庫，提高CNVs的準確性，使CMA技術(shù)得到更廣泛的臨床運用。本研究后期將對60例孕婦進行隨訪，并記錄孕婦的妊娠結(jié)局，以補充有關(guān)數(shù)據(jù)庫。