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        支氣管哮喘患兒血清骨膜蛋白、IL-13和miR-155水平相關(guān)性的研究

        2022-05-25 07:05:10路黎娟徐梅佳
        中國婦幼健康研究 2022年5期
        關(guān)鍵詞:急性期氣道支氣管

        路黎娟,徐梅佳,董 焱,呂 偉,林 珍

        (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒科,上海 201999)

        支氣管哮喘屬于多種炎性細(xì)胞參與介導(dǎo)的慢性呼吸道炎性疾病。以氣道高反應(yīng)性、氣道慢性炎癥為主要特征,不同程度的氣促、喘息、咳嗽或胸悶為支氣管哮喘的主要臨床表現(xiàn)。支氣管哮喘的發(fā)病機制尚不明晰,但以往認(rèn)為其發(fā)生與多種免疫細(xì)胞及產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)聯(lián)。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,受環(huán)境惡化及遺傳因素作用的影響,支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢;同時其發(fā)病無特定年齡限制,且常于清晨及夜間發(fā)作[1-2]。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn),支氣管哮喘與免疫調(diào)節(jié)紊亂、炎癥反應(yīng)、感染等因素密切關(guān)聯(lián)[3-4]。本文對127例支氣管哮喘患兒的骨膜蛋白(Periostin)、白介素-13(interleukin-13,IL-13)和微小RNA-155(microRNA-155,miR-155)水平進行檢測,并對其相關(guān)性進行研究。

        1 研究對象與方法

        1.1 研究對象

        選擇2019年1月至2020年1月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院門診就診的支氣管哮喘患兒127例為研究對象(研究組);選擇同時間段在本院接受健康體檢的兒童127例為健康志愿者(對照組)。

        研究組:男66例,女61例;年齡為5~13歲;緩解期65例,急性期62例。對照組:男63例,女64例;年齡為3~15歲。兩組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、膳食鈣攝入量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

        納入標(biāo)準(zhǔn):所有患兒均符合中華醫(yī)學(xué)會對支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn):①一般資料不全;②患有先天性心臟疾病或肝腎等重要臟器功能不全;③患有血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾?。虎芎喜⑵渌瓨蛹膊』蚵苑渭膊?;⑤合并過敏性疾病。

        本文研究內(nèi)容均已告知患兒家屬并知情同意,同時獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

        表1 兩組一般資料的比較Table 1 Comparison of baseline data between the two

        1.2 肺功能的檢測

        采用Master Screen肺功能儀對所有受檢兒童進行肺功能檢查。對每位受檢者測量3次以上,保留3次最佳數(shù)值,取其平均值。主要測試參數(shù):第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 1 second,F(xiàn)EV1),第1秒用力呼氣量占用力肺活量比值(ratio of forced expiratory volume in 1 second to forced vital capacity,F(xiàn)EV1/FVC%),最大呼氣50%流量(maximal expiratory flow at 50%,MEF50)。

        1.3 方法

        對所有受檢兒童于接診當(dāng)日采集外周空腹靜脈血5mL,要求血液標(biāo)本無脂血和溶血,置于無抗凝劑試管中,室溫下凝固,3 000r/min離心處理15min,分離上清,-70℃低溫下保存待檢。

        1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測相關(guān)指標(biāo)表達水平

        取50mL碳酸鹽緩沖液對抗原進行稀釋,加蓋處理,4℃冰箱內(nèi)存放24h,第2天重復(fù)洗滌3次,拋干,將稀釋液(pH值為7.4的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標(biāo)本0.1mL放入酶標(biāo)本空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔內(nèi),同時放入陽性和陰性對照標(biāo)本,42℃環(huán)境中存放1h,移除液體,3次洗滌后拋干,在每個孔中放Periostin、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、γ-干擾素(interferon γ,IFN-γ)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白抗體0.1mL,存放1h,移除液體后進行3次洗滌并拋干,在每個孔中放入底物液(0.1mol/L的Na2HPO4,0.05mol/L的枸櫞酸),混勻后放入0.1mL鄰苯二胺,進行20min遮光,再次將2mol/L的H2SO40.05mL放置在每個孔內(nèi),終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀下測定Periostin、IL-13、TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF具體數(shù)值,參照試劑盒說明書進行操作。

        1.3.2 間接法檢測免疫功能T淋巴細(xì)胞亞群水平

        將待測空腹靜脈血5mL/人傳代到5孔板中,置于37℃、5%二氧化碳的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)1天、2天和3天,然后再加入0.25%胰蛋白酶進行消化,以2 000r/min離心5min收取細(xì)胞,收取細(xì)胞后使用PBS緩沖液洗滌3min,再重復(fù)洗滌2次,完成后以2 000r/min離心,收集細(xì)胞后加入1mL PI染液,一定要在避光的常溫下放置1h后,使用PE熒光染色進行特異熒光標(biāo)記,在鞘液包裹下高速流動,流動期間會發(fā)射出光子,用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+水平。

        1.3.3 RT-PCR法檢測miR-155表達水平

        提取TTK細(xì)胞總RNA,對提取總RNA的純度、含量進行檢測,隨后逆轉(zhuǎn),逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA,使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,采用2-△△Ct方法計算,內(nèi)參U6。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25℃ 10min,40℃ 1h,85℃ 5min;設(shè)置擴增條件:94℃ 20s,72℃ 30s,60℃ 30s,35個循環(huán),采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-155表達量。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 兩組兒童肺功能指標(biāo)情況

        與對照組相比,研究組的FEV1、FEV1/FVC%、MEF50水平均顯著下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

        表2 兩組兒童肺功能指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of pulmonary function indicators between the two

        2.2 兩組兒童血清Periostin、IL-13和miR-155水平情況

        與對照組相比,研究組的哮喘緩解期、哮喘急性期患兒的Periostin、IL-13、miR-155水平均顯著上升,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

        表3 兩組兒童血清Periostin、IL-13和miR-155水平的比較Table 3 Comparison of serum Periostin,IL-13 and miR-155 levels among the

        2.3 兩組兒童哮喘相關(guān)炎癥因子水平情況

        在對照組、研究組的哮喘緩解期和哮喘急性期患兒中,TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相比對照組,哮喘緩解期、哮喘急性期患兒TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升,IFN-γ水平下降(哮喘緩解期與對照組比較,t值分別為13.830、29.730、28.180、10.790,P<0.05;哮喘急性期與對照組比較,t值分別為39.140、26.420、29.540、19.170,P<0.05);相比哮喘緩解期,哮喘急性期患兒TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升,IFN-γ水平下降(t值分別為14.270、15.970、13.510、11.160,P<0.05),見表4。

        表4 兩組兒童哮喘相關(guān)炎癥因子水平的比較Table 4 Comparison of the levels of inflammatory factors related to asthma among the

        2.4 兩組兒童免疫功能情況

        在對照組、研究組的哮喘緩解期和哮喘急性期患兒中,CD3+、CD4+、CD8+水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相比對照組,哮喘緩解期、哮喘急性期患兒CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(哮喘緩解期與對照組比較,t值分別為12.400、21.480、9.374,P<0.05;哮喘急性期與對照組比較,t值分別為19.810、32.050、11.720,P<0.05);與哮喘緩解期相比,哮喘急性期患兒CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(t值分別為6.001、8.246、2.039,P<0.05),見表5。

        表5 兩組兒童免疫功能的比較Table 5 Comparison of immune functions among the

        2.5 Periostin、IL-13和miR-155三者的相關(guān)性

        采用Pearson進行相關(guān)性分析,Periostin與IL-13呈正相關(guān)(r=0.403,P=0.001);Periostin與miR-155呈正相關(guān)(r=0.655,P=0.001);IL-13與miR-155呈正相關(guān)(r=0.482,P=0.001),見圖1。

        3 討論

        支氣管哮喘屬于慢性氣道炎癥疾病,以不同程度的咳嗽、氣喘、胸悶為主要癥狀。臨床研究表明,兒童機體器官及組織發(fā)育尚未成熟,肺泡較少、身體免疫力低下、呼吸道系統(tǒng)功能不全是導(dǎo)致其呼吸道細(xì)菌侵襲感染的主要原因[6]。近年來,隨著我國對支氣管哮喘研究的增多,發(fā)現(xiàn)其是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的異質(zhì)性疾病,多發(fā)于清晨或夜間;受環(huán)境、遺傳、氣候等多種因素影響,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]。若不及時接受有效治療,會引發(fā)呼吸衰竭,甚至死亡,對患者生命健康造成極大威脅。因此,準(zhǔn)確有效地診斷對治療及預(yù)后評估具有重要意義。

        3.1 Periostin、IL-13和miR-155生物學(xué)特征及其在支氣管哮喘發(fā)病中的作用

        本研究顯示,急性期支氣管哮喘患兒Periostin、IL-13、miR-155水平均顯著高于健康兒童和緩解期患兒,提示Periostin、IL-13、miR-155均參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程。Periostin屬于細(xì)胞基質(zhì)蛋白,于細(xì)胞表面與數(shù)種整合素分子相互作用,為組織生長、重構(gòu)提供了條件[8]。相關(guān)研究顯示,在氣道上皮細(xì)胞中,Periostin蛋白通過促進纖維母細(xì)胞趨化因子生成,加劇患者肺部炎癥;同時,Periostin具有自分泌效應(yīng),通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞水平,在氣道纖維化過程中發(fā)揮作用,其是哮喘發(fā)病的作用機理[9]。IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌,是重要的炎癥因子,具有多種效能。相關(guān)研究顯示,氣道的免疫調(diào)節(jié)和炎癥與IL-13有關(guān)聯(lián),可單獨介導(dǎo)引起哮喘;同時,IL-13可對纖維細(xì)胞產(chǎn)生刺激,使其活化參與氣道重塑[10]。miRNA對臨床多種病理、生理的生物學(xué)改變具有調(diào)控作用,其表達水平能夠?qū)Χ喾N疾病的發(fā)病情況做出相對反映。miR-155在T細(xì)胞分化過程中具有關(guān)鍵意義。在機體正常情況下,miR-155水平較為平穩(wěn),當(dāng)機體發(fā)生疾病時,其水平呈異常高表達,因此,通過miR-155水平的檢測能夠?qū)膊?yán)重程度做出直觀評估。本研究顯示,Periostin、IL-13、miR-155在支氣管哮喘中表達均較高,且其表達水平在急性期中均明顯高于緩解期。由此證實,Periostin、IL-13、miR-155與支氣管哮喘發(fā)生存在必要關(guān)聯(lián),且其水平變化受病情程度影響,因此可通過對其水平的檢測有效評估病情,臨床應(yīng)用價值較高。

        3.2 炎癥因子在支氣管哮喘發(fā)病中的作用

        本研究顯示,支氣管哮喘患兒血清TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均高于健康兒童,IFN-γ、CD8+、CD3+、CD4+水平均低于健康兒童,說明支氣管哮喘的發(fā)生與機體炎癥反應(yīng)、免疫功能存在關(guān)聯(lián)。氣道重塑與氣道炎癥是支氣管哮喘中最常見的病理變化。研究顯示,TGF-β1作為強烈致纖維化作用因子,是氣道重塑的實質(zhì),可有效刺激氣道平滑肌細(xì)胞[11]。IFN-γ對細(xì)胞免疫反應(yīng)具有介導(dǎo)作用,能夠減輕哮喘氣道炎癥。相關(guān)研究表明,肺組織缺氧導(dǎo)致HIF-1α降解減少和轉(zhuǎn)錄增加,造成氣道痙攣、氣管壁平滑肌細(xì)胞機械張力增加[12]。VEGF作為血管新生正調(diào)控因子,對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有促進作用,同時對血管通透性的增加具有促進效果,在呼吸道炎癥和重塑中發(fā)揮重要作用。T淋巴細(xì)胞亞群作為臨床常用免疫檢測指標(biāo),其水平變化顯示患者機體免疫情況。CD3+能夠反映機體免疫能力,其高表達表示機體免疫能力增強;CD4+對細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有刺激或介導(dǎo)作用;CD8+屬于細(xì)胞毒性T細(xì)胞[13]。本研究顯示,支氣管哮喘患兒機體炎癥反應(yīng)明顯高于健康者,免疫功能較低,同時通過對不同程度病情觀察發(fā)現(xiàn),機體炎癥反應(yīng)狀態(tài)隨病情發(fā)展而升高,機體免疫能力隨病情發(fā)展而降低,提示炎癥因子在支氣管哮喘病情進展中發(fā)揮重要作用,并對機體免疫能力造成影響。

        綜上所述,檢測Periostin、IL-13、miR-155水平對支氣管哮喘患兒的診斷及預(yù)后具有重要意義,且其水平在支氣管哮喘中具有一定的相關(guān)性,可為支氣管哮喘臨床診斷提供一定參考依據(jù)。

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