王夢曉，王愛迪，楊武霞，劉寶山

原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）是一種以出血、血小板計數(shù)減低、骨髓巨核細(xì)胞發(fā)育成熟障礙為主要特點的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［1］。大部分ITP患者存在特異性血小板自身抗體，造成血小板破壞增多和生成減少［2-3］。機(jī)體免疫耐受平衡被打破、免疫亢進(jìn)是ITP的特點，而T細(xì)胞分化失衡是導(dǎo)致免疫亢進(jìn)的關(guān)鍵。效應(yīng)性T細(xì)胞（Teff）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是初始CD4+T細(xì)胞激活后增殖分化的2種T細(xì)胞亞群，Teff執(zhí)行免疫功能，而Treg則具有免疫抑制、維持免疫耐受的功能，兩者作用相反，相互制衡，其失衡將導(dǎo)致自身免疫疾?。?-5］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一條經(jīng)典信號通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種功能調(diào)節(jié)。多項研究證明PI3K/Akt/mTOR信號通路在中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，且可調(diào)節(jié)Teff、Treg細(xì)胞的分化［6-8］。筆者所在研究團(tuán)隊創(chuàng)制的由犀角地黃湯、當(dāng)歸補(bǔ)血湯和二至丸組成的犀角地黃湯合方在動物實驗和臨床治療ITP中療效較好［9］。本研究旨在探究犀角地黃湯合方是否可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)Teff、Treg細(xì)胞的分化，糾正Teff/Treg失衡，達(dá)到治療ITP的目的。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 8周齡SD雄性大鼠20只，每只約200 g，購于北京維通利華生物科技股份有限公司［許可證號：SCXK（京）2021-0011］，均在易生源生物技術(shù)有限公司動物房清潔級標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)，SPF級飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2 研究對象 16例ITP患者均來自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科，于2021年7月入院治療，男女各8例，年齡18～70歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：確診ITP 12個月以上，且ITP診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療專家共識》（2016年版）。另選取同期20例健康志愿者，年齡18～70歲，男女各10例。所有健康志愿者及ITP患者入組后取清晨空腹靜脈血2 mL。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理要求并通過天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（IRB2020-KY-189），所有入組者均對研究知情同意。

1.1.3 試劑與儀器 犀角地黃湯合方組成：水牛角、生地黃、白芍、丹皮、當(dāng)歸、黃芪、旱蓮草、女貞子，合方顆粒劑（20 g/袋）購于天津紅日康仁堂藥業(yè)。RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；BI特級胎牛血清購于Biological Industries公司；青鏈霉素雙抗購于北京蘭杰柯科技有限公司；1×PBS購于北京索萊寶科技公司；人全血單個核細(xì)胞（PBMC）分離液（FLCOLL配制）購于天津灝洋生物制品有限責(zé)任公司；抗CD28抗體（Clone：CD28.2）、抗CD3抗體（Clone：OKT3）購于Biolegend公司；白細(xì)胞介素（IL）-2、干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人CD4抗體、兔抗人CD25抗體、叉頭框蛋白P3（FoxP3）抗體均購于BD Bioscience公司。兔單克隆抗人PI3K抗體、兔多克隆抗人p-PI3K抗體、兔多克隆抗人p-Akt抗體、mTOR抗體、p-mTOR抗體均購于Abcam公司，兔單克隆抗人Akt抗體購于南京巴傲得生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱購于美國THERMO公司；自動平衡離心機(jī)購于北京醫(yī)用離心機(jī)廠；流式細(xì)胞儀購于安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 灌胃劑量確定 將犀角地黃湯合方顆粒使用蒸餾水溶解為200 g/L。配好的藥物置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。根?jù)人與動物體表面積換算等效劑量法確定大鼠灌胃劑量為2 g/（kg·d）。

1.2.2 含藥血清制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只大鼠分為含藥血清組和空白血清組，每組10只。含藥血清組大鼠于每日8：00、18：00使用犀角地黃湯合方顆粒進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃3 d；空白血清組給予等量蒸餾水灌胃。2組大鼠末次灌胃1 h后，使用促凝管經(jīng)腹主動脈取全血，制備空白大鼠血清和含藥大鼠血清，過濾除菌及水浴滅火后分裝，-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 外周血PBMC提取 使用EDTA抗凝管收取健康志愿者及ITP患者外周血后，立即進(jìn)行PBMC的提取。（1）將健康志愿者和ITP患者外周血分別與等量無菌PBS混勻，制成血液樣本。（2）取15 mL離心管，每管中加入5 mL淋巴細(xì)胞分離液,并緩慢在每管中加入等量血液樣本至分離液表面。（3）2 000 r/min離心20 min后，取每管中間乳白色層至另一新的離心管中。（4）加入2倍體積無菌PBS重懸，1 300 r/min離心8 min后棄上清液,加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，4℃冰箱中靜置10 min。（5）1 000 r/min離心5 min后，棄上清液，1 mL無菌PBS重懸PBMC，計數(shù)板計數(shù)。

1.2.4 磁珠分選CD4+T細(xì)胞（1）將1.2.3中提取的PBMC按照每1×107個細(xì)胞加入80μL Buffer，20μL CD4陽選免疫磁珠重懸，4℃冰箱中孵育15 min。（2）向PBMC懸液中加入3 mL Buffer混勻。1 000 r/min離心5 min后棄上清液，用500μL Buffer重懸備用。（3）將磁珠分選柱置于磁珠分選磁鐵及磁力架上。加入500μL Buffer將分選柱潤洗1遍，加入步驟（2）中的細(xì)胞懸液，用500μL磁珠分選Buffer沖洗1遍分離柱。（4）將磁珠分選柱置于1個新的15 mL無菌離心管上方。向磁珠分選柱中加入1 mL Buffer，迅速向下推下活塞，將Buffer收集于15 mL無菌離心管中。1 000 r/min離心8 min后，棄上清液，得到CD4+T細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞純度 用100μL PBS重懸1.2.4中所得健康志愿者CD4+T細(xì)胞，加入2μL抗CD4抗體，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min后，PBS清洗2次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中CD4陽性率。

1.2.6 實驗分組活化及干預(yù) 收集1.2.4中的CD4+T細(xì)胞并計數(shù)，接種于CD3抗體（10 mg/L）提前包被過夜的24孔板中，每孔1×106個細(xì)胞，同時加入終濃度為2 mg/L的CD28抗體和完全培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗+89%RPMI1640培養(yǎng)基），37℃CO2培養(yǎng)箱活化72 h?；罨瓿珊笥嫈?shù)并分為對照組、模型組和實驗組，對照組為健康志愿者CD4+T細(xì)胞，模型組及實驗組為ITP患者CD4+T細(xì)胞。根據(jù)筆者前期工作研究，體積分?jǐn)?shù)為20%的犀角地黃湯合方含藥血清對細(xì)胞保護(hù)作用最佳，故采用20%體積分?jǐn)?shù)的大鼠含藥血清對實驗組干預(yù)72 h，采用體積分?jǐn)?shù)20%大鼠空白血清對對照組及模型組干預(yù)72 h。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組CD4+T細(xì)胞中Teff/Treg比例 干預(yù)完成后，檢測Teff/Treg占CD4+T細(xì)胞比例，以CD4+CD25-標(biāo)記物標(biāo)記Teff，CD4+CD25+FoxP3+標(biāo)記Treg細(xì)胞。（1）收集1×106細(xì)胞于流式上樣管中，加入100μL PBS重懸后，加入5μL抗CD4抗體，抗CD25抗體，同時設(shè)空白組、CD4單標(biāo)管、CD25單標(biāo)管及同型對照管。（2）避光孵育20 min后，加入2 mL PBS，1 500 r/min離心5 min后，加入500μL Foxp3固定破膜液，4℃避光孵育1 h。（3）Buffer洗滌1次后100μL重懸，加入5μL抗Foxp3抗體，4℃避光孵育45 min。（4）PBS洗滌2遍后立即上機(jī)檢測CD4+CD25-及CD4+CD25+FoxP3+表達(dá)率。

1.2.8 ELISA檢測細(xì)胞因子水平 干預(yù)完成后，收集各組細(xì)胞上清液，同時設(shè)立含藥血清培養(yǎng)基（加入體積分?jǐn)?shù)20%的含藥血清，無細(xì)胞）為陰性對照組，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10水平。

1.2.9 Western blot檢測PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達(dá) （1）干預(yù)完成后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上靜置20 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用BCA法定量檢測蛋白含量。（2）配制10%的分離膠進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。（3）用5 g BSA溶于100 mL TBST的封閉液封閉1 h，封閉結(jié)束后漂洗，與相應(yīng)的PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶500）、p-Akt（1∶500）、mTOR（1∶500）、p-mTOR（1∶500）、β-tubulin（1∶1 000）一抗反應(yīng)，4℃孵育過夜。（4）TBST洗膜3次后，將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液（1∶3 000）中，室溫、避光緩慢搖動作用60 min。TBST充分漂洗后，ECL曝光，用Image J軟件分析灰度值對目的條帶進(jìn)行灰度分析，各組與內(nèi)參β-tubulin比較，得出蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett’s T3檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 犀角地黃湯含藥血清對CD4+T細(xì)胞分化的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD4陽性率為（99.44±0.01）%，滿足后續(xù)實驗要求。與對照組相比，模型組CD4+T細(xì)胞中Teff細(xì)胞比例明顯升高，Treg比例明顯降低，Teff/Treg比值增大（P＜0.05）。與模型組相比，實驗組CD4+T細(xì)胞中Teff細(xì)胞比例降低，Treg細(xì)胞比例升高，Teff/Treg比值減?。≒＜0.05）。見表1，圖1、2。

Tab.1 Comparison of the ratio of Teff/Treg cells between the three groups表1 各組Teff/Treg細(xì)胞比例比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of the ratio of Teff/Treg cells between the three groups表1 各組Teff/Treg細(xì)胞比例比較（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組實驗組F Teff 42.35±0.77 65.28±1.20a 43.25±0.66b 208.300＊＊Treg 1.67±0.06 0.71±0.08a 2.81±0.15ab 102.900＊＊Teff/Treg 25.53±0.92 92.70±9.68a 15.53±1.09ab 55.220＊

2.2 犀角地黃湯含藥血清對CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 與對照組相比，陰性對照組IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α、TGF-β水平均降低（P＜0.05），IL-10差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α水平升高，TGF-β、IL-10水平降低（P＜0.05）。與模型組相比，實驗組IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α水平降低，TGF-β、IL-10水平升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組PI3K/Akt/mTOR蛋白表達(dá)情況 與對照組相比，模型組PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白水平升高，p-Akt蛋白水平降低（P＜0.05），Akt差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，實驗組PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白水平降低（P＜0.05），Akt、p-Akt差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3、圖3。

Fig.1 Proportion of Teff in CD4+T cells in each group圖1 各組CD4+T細(xì)胞中Teff的比例

Tab.2 Comparison of cytokine secretion levels between the four groups表2 各組細(xì)胞因子分泌水平比較 （n=3，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of cytokine secretion levels between the four groups表2 各組細(xì)胞因子分泌水平比較 （n=3，ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與陰性對照組比較，c與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組陰性對照組模型組實驗組F IL-2 89.35±3.13 22.39±0.90a 138.40±0.89ab 106.80±3.15abc 450.300＊＊IL-6 660.70±13.74 17.57±0.20a 843.40±15.82ab 628.00±2.02bc 1 165.000＊＊IL-17 253.40±2.03 65.64±1.65a 321.50±3.59ab 258.10±1.37bc 2 260.000＊＊IFN-γ 391.10±4.38 13.39±2.55a 952.50±13.55ab 814.40±10.20abc 2 320.000＊＊TNF-α 171.10±5.91 70.70±12.13a 240.10±3.16ab 158.30±6.74bc 81.550＊＊TGF-β 2 638.63±30.23 560.60±17.16a 1 976.38±72.02ac 4 534.14±131.70abc 457.800＊＊IL-10 55.97±1.42 25.39±5.14 37.23±0.92a 61.35±0.93c 36.850＊

Tab.3 Comparison of expressions of PI3K/Akt/mTOR protein between the four groups表3 各組PI3K/Akt/mTOR蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of expressions of PI3K/Akt/mTOR protein between the four groups表3 各組PI3K/Akt/mTOR蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組實驗組F PI3K 0.06±0.01 0.93±0.01a 0.46±0.02ab 1 470.000＊＊p-PI3K 0.18±0.01 1.14±0.03a 0.76±0.02ab 518.700＊＊Akt 0.79±0.07 0.58±0.11 0.77±0.14 1.095 p-Akt 0.92±0.01 0.48±0.06a 0.43±0.09 20.550＊mTOR 0.46±0.03 0.89±0.02a 0.61±0.03b 66.610＊＊p-mTOR 0.16±0.01 1.00±0.05a 0.63±0.02ab 181.500＊＊

Fig.3 Expression of PI3K/Akt/mTOR protein in each group圖3 各組PI3K/Akt/mTOR蛋白表達(dá)情況

3 討論

當(dāng)前，ITP的一線治療藥物為糖皮質(zhì)激素，此外，脾切除、血小板生成素受體激動劑（TPO-RA）、免疫球蛋白、利妥昔單抗等均是西醫(yī)治療ITP的有效方法和藥物［10-11］。然而，基于目前的治療方法，西醫(yī)無法徹底根治ITP，且在治療過程中有一定不良反應(yīng)，如激素停減后易復(fù)發(fā)、反復(fù)治療后反應(yīng)性降低、高凝、肝功能損害等。中醫(yī)則在ITP治療中起到減毒增效的效果，不僅可以增強(qiáng)并維持西醫(yī)藥物治療的效果，還可以緩解不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量，因此中西醫(yī)結(jié)合能更好地治療ITP。筆者將ITP的病機(jī)特點總結(jié)為“熱盛血瘀，氣陰虧虛”，確定了“益氣養(yǎng)陰，清熱化瘀”的治法，創(chuàng)制了由犀角地黃湯（水牛角代、生地黃、白芍、丹皮），當(dāng)歸補(bǔ)血湯（當(dāng)歸、黃芪）和二至丸（女貞子、旱蓮草）組成的犀角地黃湯合方。根據(jù)近期研究，犀角地黃湯、當(dāng)歸補(bǔ)血湯、二至丸均具有調(diào)節(jié)免疫功能的藥理作用［12-14］，為本研究中犀角地黃湯合方調(diào)節(jié)ITP患者Teff/Treg分化及功能提供了一定的理論基礎(chǔ)。此外，有研究證明犀角地黃湯對其他免疫性疾病具有治療作用。張曉蒙等［15］發(fā)現(xiàn)犀角地黃湯聯(lián)合匹多莫德可治療風(fēng)熱動血型兒童過敏性紫癜，改善患兒免疫平衡，降低復(fù)發(fā)率。王福祖等［16］通過臨床研究證實潑尼松聯(lián)合犀角地黃湯可以有效治療熱毒熾盛型系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，改善其血清指標(biāo)。

ITP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是體液免疫、細(xì)胞免疫等多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。近年來，對ITP發(fā)病機(jī)制的研究中，免疫細(xì)胞亞群失衡、Th1/Th2失衡、Th17/Treg失衡等都被證實與ITP的發(fā)生有關(guān)［17］。Teff、Treg是初始T細(xì)胞激活后增殖分化的2種功能相反的T細(xì)胞亞群。然而Teff不僅具有保護(hù)性免疫作用，若炎性因子分泌過多時還可以誘導(dǎo)對自身抗原或非有害變應(yīng)原的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫或過敏性疾病［18］。因此，Teff需要在Treg的約束之下發(fā)揮免疫作用，兩者保持平衡方可維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。初始T細(xì)胞的活化需要接受2個信號的刺激：第一信號是來自T細(xì)胞的T細(xì)胞受體（TCR）識別抗原提呈細(xì)胞（APC）的主要組織相容性復(fù)合物/肽復(fù)合物，TCR-CD3復(fù)合物可將活化信號傳至細(xì)胞內(nèi)部；第二信號是APC上的協(xié)同刺激分子，如CD28/B7、CD40/CD154等相互作用激活TCR，使T細(xì)胞增殖分化。本研究通過抗CD3抗體刺激提供第一信號，聯(lián)合抗CD28抗體協(xié)同刺激提供第二信號使CD4+T細(xì)胞在體外充分活化。

本研究通過磁珠分選健康志愿者及ITP患者外周血來源的CD4+T淋巴細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞模型，探討中藥發(fā)揮的作用機(jī)制，未設(shè)立陽性藥物對照，僅將活化后的CD4+T細(xì)胞分為對照組、模型組、實驗組進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組Teff占CD4+T細(xì)胞比例明顯升高，Treg比例明顯降低，且促炎因子IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α水平較高，抑炎因子TGF-β、IL-10水平較低，表明ITP細(xì)胞模型存在過度免疫反應(yīng)。經(jīng)犀角地黃湯合方含藥血清干預(yù)后，實驗組Teff占CD4+T細(xì)胞比例下降，Treg比例上升，IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α等促炎因子水平下降，抑炎因子TGF-β、IL-10水平上升，提示犀角地黃湯合方可有效恢復(fù)ITP Teff/Treg比例失衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。

PI3K/Akt/mTOR信號通路可在多種免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。PI3K參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，其下調(diào)可導(dǎo)致下游的Akt和mTOR表達(dá)減少，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg方向轉(zhuǎn)化，并使Treg穩(wěn)定表達(dá)FoxP3，維持Treg的功能，同時可以減少炎癥因子的分泌，進(jìn)一步抑制Teff的分化。因此，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可抑制體外和體內(nèi)Th1、Th2、Th17的分化，同時促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化［19］。為研究犀角地黃湯合方發(fā)揮作用的機(jī)制，本研究檢測了各組PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白水平明顯上調(diào)，p-Akt蛋白水平下調(diào)，Akt差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)含藥血清干預(yù)后，實驗組PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白水平顯著下調(diào)，Akt、p-Akt蛋白水平無明顯變化，證明犀角地黃湯合方含藥血清可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路上的PI3K、mTOR蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的調(diào)節(jié)ITP患者Teff/Treg免疫平衡。

綜上所述，ITP存在Teff/Treg失衡，犀角地黃湯合方可能通過修復(fù)Teff/Treg失衡，降低促炎因子水平，增加抑炎因子釋放，在ITP病程中發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的作用，從而起到治療效果。且其發(fā)揮作用可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路PI3K、mTOR蛋白的表達(dá)有關(guān)。