翟亞君，楊涵，陳萬里，劉玥，魏麗萍，劉克強(qiáng)，齊新△

高血壓是危害人類健康的常見疾病，是心腦血管疾病的危險因素，可引起心腦腎等靶器官的嚴(yán)重?fù)p傷［1-2］。研究表明，長期的高血壓刺激可引起左心室壓力負(fù)荷增加，心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生病理性改變，導(dǎo)致左心室肥厚（LVH）、心肌纖維化、左心室重構(gòu)，最終發(fā)展為心力衰竭［3］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活以血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）升高為特征，AngⅡ與其受體AT1結(jié)合可以影響血壓調(diào)節(jié)，同時加速心室肥厚，是高血壓發(fā)生發(fā)展及靶器官損害的重要原因。AngⅡ受體拮抗劑（ARB）為作用于RAAS的降壓藥物，可選擇性抑制AT1，降低AngⅡ表達(dá)，有效地防止高AngⅡ造成的靶器官損害［4］。阿利沙坦酯是我國開發(fā)的治療高血壓的新型ARB類藥物［5］，其活性代謝產(chǎn)物EXP3174［6-7］可與AT1特異性結(jié)合，阻斷AngⅡ所產(chǎn)生的生理作用，從而達(dá)到降低血壓及保護(hù)靶器官的作用。目前對于阿利沙坦酯的研究多集中于其降壓作用，而對其保護(hù)心臟的作用研究較少。本研究通過建立自發(fā)性高血壓大鼠模型，探究阿利沙坦酯對自發(fā)性高血壓大鼠的穩(wěn)定降壓及心臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 阿利沙坦酯（240 mg/片，信立坦，國藥準(zhǔn)字H20138001）購自深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司。HE、Masson染色試劑盒與SDS-PAGE試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒與SYBR Green購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計及合成；兔抗鼠多克隆Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）抗體、兔抗鼠多克隆Ⅲ型膠原蛋白（Col-Ⅲ）抗體與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗聚合物購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠多克隆骨骼肌型肌動蛋白α1（ACTA1）抗體、GAPDH抗體購自愛博泰克生物科技有限公司；兔抗鼠多克隆血小板反應(yīng)蛋白（THBS4）抗體購自英國Abcam公司；大鼠尾動脈血壓測定儀（美國Kent Scientific公司）；超高分辨率小動物超聲掃描儀Vivo 2100（加拿大Visual Sonics公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；PCR擴(kuò)增儀（Roche公司）；Western blot電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗動物 13周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）20只，平均體質(zhì)量（200±20）g，13周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠（WKY）10只，平均體質(zhì)量（200±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養(yǎng)于天津市人民醫(yī)院動物房內(nèi)，室溫維持在（24.0±1.0）℃，濕度維持在（55.0±5.0）%，12 h光照維持，晝夜交替，普通飼料喂養(yǎng)。

1.3 動物分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用抽簽法將20只SHR隨機(jī)分為模型組和阿利沙坦酯組，每組10只；10只WKY為對照組。阿利沙坦酯組連續(xù)灌胃給藥阿利沙坦酯34周，給藥劑量為25.2 mg/（kg·d），模型組和對照組給予等量蒸餾水，48周后處死動物并取材。阿利沙坦酯組喂養(yǎng)過程發(fā)生死亡4只，對照組與模型組無死亡，每組均采用抽簽法取6只結(jié)果。1.4 大鼠血壓監(jiān)測及超聲心動檢測 使用大鼠尾動脈血壓測定儀監(jiān)測各組大鼠的收縮壓與舒張壓。從第16周開始，每4周記錄1次血壓。第48周對大鼠行超聲心動檢測：5%水合氯醛溶液6 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，剔除胸前毛發(fā)，測量室間隔舒張末期厚度（IVSd）、室間隔收縮末期厚度（IVSs）、舒張期左心室后壁厚度（LVPWd）、收縮期左心室后壁厚度（LVPWs）、收縮期左心室內(nèi)徑（LVIDs）、舒張期左心室內(nèi)徑（LVIDd）、射血分?jǐn)?shù)（EF）和左心室質(zhì)量（LVM）。

1.5 心肌組織病理學(xué)檢測 大鼠處死后分離出心臟組織，于4%多聚甲醛溶液中脫水固定，改刀后置于包埋盒中，經(jīng)乙醇與二甲苯的浸泡后加入融化的石蠟，待凝固后切成5μm的組織切片，對大鼠切片行HE及Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.6 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1、THBS4 mRNA表達(dá)水平 將大鼠心肌組織從-80℃醫(yī)用冰箱中取出50 mg剪碎，添加Trizol試劑1 mL提取總RNA。測定RNA濃度與質(zhì)量后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將獲得的cDNA稀釋10倍。PCR反應(yīng)上樣體積20μL：cDNA 1μL，2×SYBR qPCR Mix 10μL，上、下游引物（均為10μmol/L）各0.5μL，ddH2O 8μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；94℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算每組樣品中mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.7 Western blot檢測大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1、THBS4蛋白表達(dá)水平 將大鼠心肌組織從-80℃冰箱中取出50 mg剪碎，加入蛋白裂解液后冰上研磨，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。上樣量70μg，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h；加入相應(yīng)一抗Col-Ⅰ（1∶500），Col-Ⅲ（1∶500），ACTA1（1∶500），THBS4（1∶500），GAPDH（1∶1 000），4℃搖床孵育過夜；TBST清洗3次，二抗（1∶10 000）室溫孵育1.5 h。使用ECL顯影液對條帶避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照及運用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。符合方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；不符合方差齊性檢驗，多組間比較采用Welch檢驗，組間多重比較采用Tamhane’s T2檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

Tab.2 Changes of systolic blood pressure during the experiment in the three groups of rats表2 3組大鼠實驗期間的收縮壓變化 （n=6，mmHg，±s）

Tab.2 Changes of systolic blood pressure during the experiment in the three groups of rats表2 3組大鼠實驗期間的收縮壓變化 （n=6，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

組別對照組模型組阿利沙坦酯組F 16周135.00±5.18 194.67±5.28a 144.83±3.43ab 208.819＊＊20周138.67±8.52 189.17±6.85a 144.00±2.83b 220.034＊＊24周145.33±4.89 197.00±7.21a 143.33±3.98b 301.569＊＊28周145.50±3.08 190.33±6.74a 148.83±6.18b 441.095＊＊32周132.00±4.05 192.83±7.63a 140.50±5.36ab 139.172＊＊36周135.33±4.50 203.33±11.78a 148.00±5.90ab 128.439＊＊40周135.83±5.12 193.67±7.55a 150.83±1.17ab 251.888＊＊44周144.17±7.55 195.17±5.56a 151.67±5.65b 96.592＊＊48周148.67±5.68 192.67±6.62a 149.67±1.63b 188.046＊＊

2 結(jié)果

2.1 阿利沙坦酯對SHR大鼠血壓的作用 與對照組比較，模型組各時間點收縮壓與舒張壓均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿利沙坦酯組各時間點收縮壓與舒張壓均明顯降低（P＜0.05），見表2、3。

2.2 阿利沙坦酯對SHR大鼠心臟重構(gòu)的作用 超聲心動圖結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組IVSd、IVSs、LVPWd、LVM和LVPWs升高，LVIDd與EF降低（P＜0.05），LVIDs差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，阿利沙坦酯組IVSd、IVSs、LVPWd、LVM和LVPWs降低，LVIDd、LVIDs與EF升高（P＜0.05）。見表4。

2.3 阿利沙坦酯對SHR心肌纖維化的作用 HE染色顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌纖維紊亂，心肌細(xì)胞肥大；與模型組比較，阿利沙坦酯組心肌纖維紊亂、心肌細(xì)胞肥大程度有所改善。Masson染色顯示，對照組中藍(lán)色膠原纖維沉積程度較低，與對照組比較，模型組藍(lán)色膠原纖維沉積明顯增加；與模型組比較，阿利沙坦酯組藍(lán)色膠原纖維沉積程度減輕。見圖1、2。

2.4 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4 mRNA水平比較 與對照組比較，模型組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1與THBS4 mRNA水平升高，阿利沙坦酯組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1 mRNA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿利沙坦酯組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4 mRNA水平降低（P＜0.05）。見表5。

Tab.3 Changes of diastolic blood pressure during the experiment in the three groups of rats表3 3組大鼠實驗期間的舒張壓變化 （n=6，mmHg，±s）

Tab.3 Changes of diastolic blood pressure during the experiment in the three groups of rats表3 3組大鼠實驗期間的舒張壓變化 （n=6，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組阿利沙坦酯組F 16周112.17±7.19 149.67±9.54a 128.00±5.93ab 35.057＊＊20周117.83±7.39 139.67±9.61a 120.33±6.06b 18.181＊＊24周119.33±7.12 148.33±4.93a 122.50±7.64b 50.745＊＊28周120.67±3.88 149.67±9.27a 124.33±3.20b 37.323＊＊32周113.33±9.18 145.00±10.41a 123.00±3.29ab 27.456＊＊36周112.83±4.31 158.83±10.91a 132.83±4.26ab 63.925＊＊40周118.17±5.98 151.00±12.12a 129.50±4.04ab 23.159＊＊44周120.17±6.85 151.17±5.71a 123.17±6.34b 35.796＊＊48周117.17±6.11 158.33±7.81a 123.83±4.22b 89.889＊＊

Tab.4 Comparison of cardiac ultrasound related indexes between the three groups表4 3組大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of cardiac ultrasound related indexes between the three groups表4 3組大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組阿利沙坦酯組F或H IVSd（mm）2.02±0.07 2.62±0.24a 2.18±0.10b 24.196＊＊IVSs（mm）3.08±0.29 3.91±0.09a 3.31±0.13b 29.225＊＊LVIDd（mm）5.98±0.53 4.98±0.47a 5.70±043b 7.028＊＊LVPWd（mm）3.11±0.43 3.96±0.26a 3.26±0.22b 12.092＊＊LVM（mg）739.98±130.15 1263.79±162.58a 963.03±236.95b 12.498＊＊EF 0.71±0.05 0.52±0.01a 0.64±0.02b 104.018＊＊LVIDs（mm）2.69（2.47，3.15）2.13（2.08，2.38）2.93（2.80，3.01）b 6.744＊LVPWs（mm）2.83（2.68，2.86）2.98（2.94，3.14）a 2.82（2.77，2.87）b 8.982＊

Fig.1 HE staining of heart histomorphology of rats in each group(×200)圖1 各組大鼠心臟組織HE染色（×200）

Fig.2 Masson staining of heart histomorphology of rats in each group(×200)圖2 各組大鼠心臟組織Masson染色（×200）

Tab.5 Comparison of mRNA levels of Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,ACTA1 and THBS4 in myocardium between the three groups of rats表5 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4的mRNA水平比較 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of mRNA levels of Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,ACTA1 and THBS4 in myocardium between the three groups of rats表5 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4的mRNA水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組阿利沙坦酯組F或H Col-Ⅰ0.98±0.18 31.86±6.85a 9.47±2.35ab 87.266＊＊Col-Ⅲ1.14（0.91，1.23）168.70（131.38，173.24）a 35.58（33.05，50.42）ab 15.205＊＊ACTA1 1.01±0.15 17.73±2.05a 3.93±0.59ab 313.272＊＊THBS4 1.02±0.24 20.47±1.99a 0.96±0.35b 551.824＊＊

2.5 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1、THBS4蛋白表達(dá)水平升高，阿利沙坦酯組ACTA1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿利沙坦酯組中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1與THBS4蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖3、表6。

Fig.3 Protein expression levels of Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,ACTA1 and THBS4 in myocardium of rats in each group圖3 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4蛋白表達(dá)水平

Tab.6 Comparison of protein expression levels of Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,ACTA1 and THBS4 in myocardium of rats between the three groups of rats表6 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4的蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.6 Comparison of protein expression levels of Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,ACTA1 and THBS4 in myocardium of rats between the three groups of rats表6 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、ACTA1和THBS4的蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組阿利沙坦酯組F Col-Ⅰ0.75±0.06 1.03±0.14a 0.66±0.11b 9.389＊Col-Ⅲ0.59±0.07 0.81±0.05a 0.52±0.02b 30.006＊＊ACTA1 0.86±0.14 1.63±0.11a 1.32±0.02ab 41.506＊＊THBS4 0.46±0.05 0.82±0.03a 0.48±0.04b 82.875＊＊

3 討論

心臟是高血壓損傷的主要靶器官，長期高血壓可造成外周小動脈硬化，血管彈性降低及順應(yīng)性下降，管腔內(nèi)徑變小，外周血管阻力增加，而增高的血管阻力使心臟的壓力負(fù)荷升高，心臟射血能力下降，排血量降低，心室內(nèi)壓力不斷增加，引起心室壁增厚［8］。SHR是研究人類原發(fā)性高血壓常用的動物模型［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠相較于對照組血壓持續(xù)在較高的水平，心臟超聲結(jié)果提示高血壓引發(fā)心臟室間隔與左心室后壁肥厚增加，LVM增加，心腔內(nèi)徑縮小，心室射血能力下降，表現(xiàn)為高血壓引發(fā)的靶器官損害特征。在阿利沙坦酯治療后，SHR在早期收縮壓與舒張壓就得到良好的控制，LVM、心臟室壁和室間隔增厚程度減輕，心腔內(nèi)徑增加，射血能力提高，心功能得到改善，提示阿利沙坦酯可起到穩(wěn)定降壓及心臟保護(hù)作用。

當(dāng)心臟排血量降低時可以激活體內(nèi)神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中RAAS起重要作用，AngⅡ是RAAS主要的效應(yīng)因子，在心肌組織與循環(huán)系統(tǒng)中AngⅡ表達(dá)明顯增高［10］。AngⅡ作用于AT1可促進(jìn)動脈血管的收縮及血管平滑肌增殖，使血管張力增加，血壓增高。有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ與心肌細(xì)胞AT1結(jié)合可促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長，進(jìn)而加重心室肥厚［11］。研究表明阿利沙坦酯降低血壓，保護(hù)靶器官的作用與其抑制RAAS有關(guān)［4，12］。本研究中SHR隨著血壓升高，RAAS激活，在阿利沙坦酯的作用下，心臟結(jié)構(gòu)和功能有所改善，表明阿利沙坦酯可能通過抑制RAAS，降低血壓，從而對高血壓引起的心臟結(jié)構(gòu)與功能改變起保護(hù)作用。

心肌纖維化是許多晚期心血管疾病常見的病理改變［13］，當(dāng)長期高血壓引發(fā)AngⅡ升高時，AngⅡ作用于細(xì)胞外基質(zhì)中成纖維細(xì)胞的AT1，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，Col-Ⅰ與Col-Ⅲ等膠原蛋白表達(dá)增加，沉積在細(xì)胞外基質(zhì)中，心肌發(fā)生纖維化。本研究中Masson染色結(jié)果顯示SHR心肌間質(zhì)膠原纖維沉積區(qū)域明顯擴(kuò)大，出現(xiàn)明顯的纖維化改變，且Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的mRNA與蛋白表達(dá)水平升高，而經(jīng)阿利沙坦酯藥物干預(yù)的大鼠心肌纖維化程度明顯降低，考慮阿利沙坦酯能阻礙AngⅡ與AT1結(jié)合，抑制AngⅡ，從而減輕膠原纖維的沉積。

ACTA1是心肌細(xì)胞肥大的標(biāo)志物［14］。本研究中模型組心室肌中ACTA1 mRNA與蛋白表達(dá)水平與對照組相比均顯著升高，當(dāng)壓力負(fù)荷增加時，模型組大鼠的心肌細(xì)胞骨骼肌化明顯，心肌組織收縮力下降而影響心功能。阿利沙坦酯組ACTA1 mRNA與蛋白表達(dá)水平下降，心肌收縮力增強(qiáng)，心功能改善。THBS4（也稱TSP-4）是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是血小板反應(yīng)家族TSP-1～5的一員［15］。THBS4可減少纖維化和膠原生成，而TSP-1和TSP-2可促進(jìn)器官纖維化［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生肥厚和衰竭的心臟中THBS4表達(dá)升高，可以通過減少纖維化減緩心臟病理重塑，同時增強(qiáng)心肌收縮力以應(yīng)對壓力過載［17］。在其他組織，如皮膚、肝臟、神經(jīng)組織損傷及組織修復(fù)和再生后，THBS4的表達(dá)也顯著升高［18］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組心肌纖維化明顯，THBS4的mRNA與蛋白表達(dá)水平升高，經(jīng)阿利沙坦酯治療后，THBS4的mRNA與蛋白表達(dá)水平下降，提示阿利沙坦酯在改善心肌肥大及心肌纖維化方面起重要作用。

綜上，本研究證實阿利沙坦酯可有效降低SHR血壓，減輕高血壓所致的心肌纖維化，改善心室重構(gòu)與心功能，但目前阿利沙坦酯對心臟保護(hù)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制還未可知，后期將對此進(jìn)行深入探究。