程冉，魏楓，張苑，劉美嵐，賀佳

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤，75%的患者為女性［1］，但近些年發(fā)病率和病死率的性別差異正在逐漸縮?。?］。多項(xiàng)研究證明，表觀遺傳變化在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，表觀遺傳變化并不涉及DNA的序列變化，更易受到年齡、環(huán)境、生活方式和飲食習(xí)慣的影響［3-5］。在表觀遺傳中，DNA甲基化是變化方式之一，主要依賴于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs），DNMTs包含多種亞型，共同參與維持DNA復(fù)制中的甲基化［6］。死亡相關(guān)蛋白激酶（deathassociated protein kinase，DAPK）是一種由鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在不同種類的細(xì)胞凋亡系統(tǒng)中均有表達(dá)，負(fù)責(zé)啟動細(xì)胞的凋亡程序，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，是凋亡的正性調(diào)節(jié)因子。在甲狀腺癌中，DAPK基因以高度甲基化的形式存在［7］。5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）是一種DNMT抑制劑，在DNA復(fù)制過程中，其一方面直接與DNA單鏈結(jié)合，另一方面可催化蛋白酶體依賴的DNMT1的降解，發(fā)揮去甲基化的生物活性［8］。目前，5-Aza-CdR已廣泛應(yīng)用于血液腫瘤的治療［9］，但其在甲狀腺癌中的應(yīng)用尚少，作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，在動物水平觀察5-Aza-CdR的抑瘤作用及對DAPK與DNMTs的影響，了解其體內(nèi)抗癌效果并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料（1）細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物。TPC-1細(xì)胞株購自上海分子與細(xì)胞生物學(xué)研究中心。4周齡BALB/c雌性裸鼠16只，體質(zhì)量（14.6±0.4）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。（2）主要試劑。DMEM培養(yǎng)基購自Corning公司；5-Aza-CdR購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自Invitrogen公司；青-鏈霉素（100×）購自Gibco公司；TIANamp Genomic DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；EZ-96 DNA Methylation-LightningTMKit購自ZYMO RESEARCH公司；兔抗人DAPK抗體購自美國CST公司；鼠抗人單克隆抗體DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔/鼠預(yù)吸附IgG H&L二抗購自英國Abcam公司；βtubulin抗體購自Gene Tex公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立人甲狀腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型 于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)TPC-1細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶壁80%～90%后傳代，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。TPC-1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整密度為1×107/mL。隨后吸取1 mL細(xì)胞懸液接種于裸鼠右前肢腋下，200μL/只。接種后，將裸鼠置于裸鼠屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，17 d左右腋下出現(xiàn)3～5 mm結(jié)節(jié)，移植瘤模型建立成功。

1.2.2 分組及藥物處理 成瘤后用隨機(jī)數(shù)字表法將荷瘤裸鼠分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組按照1μg/g腹腔注射5-Aza-CdR（200μL），每2 d給藥1次，周期4周，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。給藥前用游標(biāo)卡尺分別測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），利用公式V=a×b2/2計算出腫瘤體積。藥物干預(yù)4周后，頸椎脫臼法處死荷瘤裸鼠，分離移植瘤。計算2組腫瘤的平均質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)組抑瘤率。抑瘤率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。每個瘤體取小部分做石蠟包埋，其余瘤體去除周圍結(jié)締組織、凝血塊，保存于無RNA酶EP管中，在液氮中速凍后放入-80℃冰箱保存。

1.2.3 HE染色 將實(shí)驗(yàn)組與對照組裸鼠移植瘤組織標(biāo)本浸泡在4%多聚甲醛固定液中，隨后進(jìn)行組織脫水、透明、浸蠟、組織包埋、切片，再進(jìn)行復(fù)水、染色、脫水、封閉步驟，最后通過顯微鏡下觀察2組腫瘤組織染色結(jié)果，同時進(jìn)行圖像采集。

1.2.4 甲基化特異性PCR檢測移植瘤組織中DAPK甲基化情況 取腫瘤組織30 mg，根據(jù)組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。Nanodrop 2000微量分光光度計檢測總DNA的純度和含量。DAPK甲基化上游引物5′-ACCCTGCATGAGGTCTATGA-3′，下游引物5′-CAGGTCAAAGTGAGCGATCTG-3′；DAPK非甲基化上游引物5′-CACGCACATGAGACCTACAG-3′，下游引物5′-ACCAGGATCTCAGCGTAGAAC-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。隨后瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠自動成像系統(tǒng)觀察電泳條帶并拍照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測移植瘤組織中DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達(dá) 石蠟包埋的甲狀腺癌裸鼠移植瘤組織切成5μm厚的切片。切片脫蠟后，用檸檬酸鹽-EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)，切片在3%H2O2中室溫孵育5 min抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性?？乖迯?fù)后，用5%BSA封閉液在室溫下封閉切片15 min。分別加入DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B一抗（均為1∶100稀釋）于4℃過夜。次日加入二抗（1∶1 000），置37℃孵箱30 min；DAB試劑盒顯影，顯微鏡下觀察，蒸餾水終止反應(yīng)，切片在室溫下蘇木精染色3 min，梯度乙醇脫水后，切片用二甲苯透明，用中性樹脂密封，光學(xué)顯微鏡下觀察。所有玻片在同一光源背景強(qiáng)度，同一放大倍數(shù)下拍照完成。采用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，計算積分光密度（integrated optical density，IOD）值。

1.2.6 Western blot法檢測移植瘤組織中DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的蛋白表達(dá)水平 -80℃冰箱中取出移植瘤組織，加入RIPA裂解液，在冰上使用玻璃勻漿器勻漿，提取總蛋白，BCA蛋白定量法測蛋白濃度，加入溴酚藍(lán)后煮沸。每孔上樣量為20μg蛋白，濃縮膠80 V，20 min，分離膠120 V電泳，待溴酚藍(lán)染料電泳至凝膠底部時停止電泳。采用半干法轉(zhuǎn)膜，20 V，60 min，轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜3次，每次10 min，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入DAPK（1∶1 000）、DNMT1（1∶1 000）、DNMT3A（1∶2 000）、DNMT3B（1∶1 000）和βtubulin（1∶500）一抗4℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光液顯色。Image J圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌裸鼠移植瘤的生長情況與實(shí)驗(yàn)組抑瘤率 實(shí)驗(yàn)過程中，2組荷瘤裸鼠的飲食與大小便均正常，精神狀態(tài)良好。剝離腫瘤組織后發(fā)現(xiàn)，移植瘤呈結(jié)節(jié)狀，與周圍組織分界明顯，包膜完整，與皮膚及皮下結(jié)締組織輕微粘連，表面肉紅色，剖面呈魚肉狀，質(zhì)地中等，偶見白色豆渣狀壞死組織，見圖1。給藥4周后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積減?。▓D2），質(zhì)量（單位：g）減輕（0.41±0.11vs.1.30±0.39，t=5.195，P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組抑瘤率為45.38%。

Fig.1 Changes of subcutaneous transplanted tumor bodies in nude mice of the two groups圖1 2組裸鼠皮下移植瘤瘤體變化

Fig.2 The growth curves of transplanted tumor in nude mice of the two groups圖2 2組裸鼠移植瘤生長曲線

2.2 移植瘤HE染色結(jié)果 對照組移植瘤內(nèi)細(xì)胞呈彌漫性生長，排列密集紊亂，未見組織結(jié)構(gòu)，癌細(xì)胞胞漿較豐富，細(xì)胞核相互重疊，異型性明顯，可見典型的病理性核分裂象，符合甲狀腺乳頭狀癌特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組移植瘤內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，胞漿淡染，細(xì)胞核淡染，核仁體積小，核分裂象減少，核漿比例減少，部分出現(xiàn)核固縮、核溶解，細(xì)胞崩解，結(jié)構(gòu)消失，見圖3。

Fig.3 Pathological results of transplanted tumor in the two groups(HE staining,×200)圖3 2組移植瘤病理結(jié)果（HE染色，×200）

2.3 2組移植瘤組織中DAPK甲基化情況 實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織DAPK基因甲基化程度較對照組明顯下降，見圖4。

Fig.4 Comparison of DAPK gene methylation between the two groups圖4 2組移植瘤DAPK基因甲基化結(jié)果比較

2.4 免疫組化染色結(jié)果 人甲狀腺乳頭狀癌裸鼠移植瘤組織細(xì)胞的DAPK蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，DNMTs主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，少數(shù)在細(xì)胞核中表達(dá)，陽性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色顆粒，細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)組可見大部分細(xì)胞DAPK表達(dá)陽性，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B陽性細(xì)胞少見。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織DAPK蛋白表達(dá)升高，DNMT1、DNMT3A蛋白表達(dá)降低，DNMT3B表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1、圖5。

Tab.1 Semi-quantitative analysis results of protein expressions of DAPK,DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in transplanted tumor tissues of the two groups表1 2組移植瘤組織DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達(dá)的半定量分析結(jié)果（n=8，IOD，±s）

Tab.1 Semi-quantitative analysis results of protein expressions of DAPK,DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in transplanted tumor tissues of the two groups表1 2組移植瘤組織DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達(dá)的半定量分析結(jié)果（n=8，IOD，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組實(shí)驗(yàn)組t DAPK 2 472 654±1 040 509 61 503 117±43 738 815 3.816＊＊DNMT1 9 807 901±5 643 785 2 929 843±502 930 3.433＊＊DNMT3A 5 211 760±1 884 872 23 191±7 827 6.155＊＊DNMT3B 35 286±11 266 36 197±11 715 0.125

Fig.5 Protein expressions of DAPK,DNMT1,DNMT3A and DNMT3B in transplanted tumor tissues in nude mice of the two groups(immunohistochemical staining,×400)圖5 2組裸鼠移植瘤組織中DAPK、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

2.5 Western blot結(jié)果 與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組DAPK蛋白表達(dá)升高，DNMT1、DNMT3A蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；2組DNMT3B蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

Fig.6 Protein expressions of transplanted tumor tissues in the two groups圖6 2組移植瘤組織DAPK及DNMT1、DNMT3A、DNMT3B蛋白表達(dá)情況

3 討論

DNA啟動子甲基化通過細(xì)胞內(nèi)DNMTs催化介導(dǎo)，以共價鍵的形式連接胞嘧啶環(huán)的5位碳原子和S2腺苷蛋氨酸提供的甲基，最終生成5-甲基胞嘧啶，此反應(yīng)過程并未涉及改變DNA的序列結(jié)構(gòu)，但可有效抑制相關(guān)基因的表達(dá)［10］。其中，DNMT1負(fù)責(zé)維持現(xiàn)有的甲基化，其為催化復(fù)制后的半甲基化，傳遞表觀遺傳學(xué)信息，維持重新甲基化后的甲基化穩(wěn)定狀態(tài)。而DNMT3A和DNMT3B參與DNA的從頭甲基化，將非甲基化的CpG轉(zhuǎn)化為甲基化的CpG，建立動態(tài)甲基化模式［11］。這兩種酶在成人體內(nèi)細(xì)胞中表達(dá)量較少，主要在胚胎發(fā)育階段發(fā)揮作用，其表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致異常的甲基化［12］。

目前發(fā)現(xiàn)的激酶中，絲氨酸/蘇氨酸激酶（STKs）占大多數(shù)，DAPK是STKs家族中的重要成員之一，在人類細(xì)胞中調(diào)控多種生物學(xué)功能。DAPK結(jié)構(gòu)域包括DAPK1、DAPK2、DAPK3以及死亡相關(guān)蛋白酶誘導(dǎo)凋亡激酶（DRAK）1和DRAK2。DAPK1是一個160 ku的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白激酶，由1 430個殘基組成，屬于鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)控的STKs超家族。已有研究證明，DAPK1具有抑制腫瘤發(fā)展、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用［13］。但在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病機(jī)制中，關(guān)于DAPK基因的研究不多。

Rodríguez-Rodero等［14］評估了不同腫瘤抑制基因的甲基化模式，在原發(fā)性甲狀腺腫瘤中，腫瘤抑制基因經(jīng)常受到高甲基化的調(diào)控。DNA異常高甲基化與DAPK表達(dá)的相關(guān)性研究表明，DAPK基因啟動子的甲基化可導(dǎo)致甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，DAPK啟動子甲基化程度越高，DAPK的表達(dá)量越低，呈負(fù)相關(guān)，其中啟動子區(qū)域的CpG島甲基化可導(dǎo)致DAPK基因失活［6］。另有研究證實(shí)，高甲基化導(dǎo)致的DAPK基因表達(dá)沉默與淋巴瘤［15］、乳腺癌［16］、小細(xì)胞肺癌［17］等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及患者的預(yù)后密切相關(guān)。

5-Aza-CdR是一種有效的DNA甲基化抑制劑，通過與DNMT共價結(jié)合，可特異性抑制其甲基轉(zhuǎn)移活性，實(shí)現(xiàn)去甲基化功能，重新激活抑制惡性腫瘤的基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR可抑制白血病和結(jié)腸癌細(xì)胞的生長［18-19］。Lemaire等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠EMT6乳腺腫瘤模型中，小劑量5-Aza-CdR可有效減少腫瘤細(xì)胞的克隆數(shù)量，當(dāng)總劑量達(dá)到40 mg/kg時，腫瘤細(xì)胞的克隆能力完全喪失，5-Aza-CdR的抗腫瘤活性隨治療劑量和時間的增加而增加。而對血液系統(tǒng)惡性腫瘤和食管癌、肺癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤患者的初步臨床試驗(yàn)顯示，5-Aza-CdR的抗腫瘤活性較好，可有效改善腫瘤患者預(yù)后，延長部分晚期腫瘤患者的生存期［21-22］。

本研究發(fā)現(xiàn)，對照組移植瘤組織中DAPK由于異常甲基化導(dǎo)致基因沉默，致使DAPK蛋白表達(dá)下降，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)5-Aza-CdR處理后DAPK表達(dá)明顯升高，DNMT1、DNMT3A蛋白表達(dá)下降。與此同時，本研究還觀察到人甲狀腺癌移植瘤的生長在5-Aza-CdR作用下受到明顯抑制，移植瘤體積明顯縮小，腫瘤組織局部出現(xiàn)壞死。上述研究結(jié)果提示，5-Aza-CdR可使表達(dá)沉默的DAPK基因再表達(dá)，恢復(fù)其抑癌功能，從而抑制人甲狀腺癌移植瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是甲狀腺乳頭狀癌患者使用DNA甲基化抑制劑進(jìn)行治療的靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)為去甲基化制劑干預(yù)甲基化位點(diǎn)預(yù)防和治療甲狀腺乳頭狀癌提供了一定的依據(jù)，但有關(guān)DAPK與DNMTs基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)調(diào)節(jié)、甲基化的具體機(jī)制以及甲基化與腫瘤和基因轉(zhuǎn)錄失活的關(guān)系等，還需要進(jìn)一步的探索研究。