晚麗，李作孝

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種自身免疫性疾病，以腦和脊髓彌漫性炎性細胞浸潤及脫髓鞘為主要病理特征［1］。MS發(fā)病率逐年上升，主要累及青年人，影響認知、情感、運動、感官或視覺領域的功能，治療困難，是青年人致殘的主要病因之一［2］。MS及其動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是由外周活化的T細胞遷移至中樞神經系統(tǒng)引發(fā)的一系列炎癥反應啟動［3］，但目前中樞神經系統(tǒng)炎癥和免疫的調節(jié)機制尚不清楚。研究表明先天性免疫受體Toll樣受體4（TLR4）與EAE進展有關，刺激TLR4可促進下游核因子-κB（NF-κB）激活，調控多種炎性細胞因子的轉錄，放大炎癥級聯(lián)反應［4］。此外，NF-κB激活也與EAE中少突膠質細胞凋亡、脫髓鞘密切相關［5］。故抑制TLR4/NF-κB信號通路可能是抑制EAE進展的重要途徑。依達拉奉右莰醇是一種新型藥物，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，對腦缺血［6］、急性肺損傷［7］等疾病具有明顯改善作用。但依達拉奉右莰醇對EAE小鼠炎癥反應的影響鮮有報道。本研究用少突膠質細胞糖蛋白35-55（MOG35-55）多肽制備EAE模型，探討依達拉奉右莰醇對EAE小鼠炎癥反應的影響，并初步探究其作用機制是否與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關，以期為MS的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級健康C57BL/6雌性小鼠30只，6～8周齡，體質量（20±2）g，許可證號：SCXK（鄂）2020-0018，購自湖北實驗動物研究中心，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學忠山動物房。室溫（24±2）℃，相對濕度約50%，保持12 h光/暗循環(huán)，自由進食及飲水。實驗及操作符合動物倫理，倫理編號2021-0601-3。依達拉奉右莰醇注射用濃溶液（批準文號：國藥準字H20200007，南京先聲東元制藥有限公司）；MOG35-55多肽（國泰生物）；結核桿菌H37Ra（TB）購自BD公司；完全弗式佐劑（CAF）、百日咳毒素均購自美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自ELK Biotechnology；兔源抗TLR4、NF-κB p65抗體均購自CST公司；兔源性抗GAPDH內參抗體（Abcam公司）；HRP標記的山羊抗兔IgG（Aspen公司）。普通光學顯微鏡（OLYMPUS公司）；酶標儀（Diatek公司）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；實時熒光定量PCR（qPCR）儀（Life technologies）。

1.2 分組、EAE模型制備及處理 采用隨機數(shù)字表法將動物分為空白組、模型組和依達拉奉右莰醇干預組。根據t檢驗的動物用量公式n=2σ2（tα+tβ）2/δ2計算需要近交系小鼠8～10只，故選用每組10只。參照文獻［8］方法造模，將MOG35-55多肽稀釋成5 g/L，與等體積含TB的CFA混合（最終質量濃度為5 g/L），推打形成油包水型乳劑，在后2組小鼠脊椎旁任選4點進行皮下注射（每只0.1 mL），空白組注射等量生理鹽水。在免疫的第0和48 h，模型組和依達拉奉右莰醇干預組腹腔注射0.5 mL百日咳毒素（200 ng/只），空白組注射等量生理鹽水。自造模次日起，依達拉奉右莰醇干預組腹腔注射依達拉奉右莰醇12.5 mg/kg，藥物劑量根據Ⅱ期臨床試驗推薦人體最佳劑量換算［6，9］，空白組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。

1.3 小鼠發(fā)病情況觀察 小鼠免疫后，每日同一時間由2位實驗員分別對各組小鼠進行神經功能障礙評分，根據Weaver’s 15分評分法：尾部無癥狀為0分，尾部張力下降或遠端癱瘓為1分，尾部全癱為2分；四肢正常為0分，步態(tài)不穩(wěn)為1分，肢體輕癱或拖拽為2分，肢體全癱或行走時外翻為3分；相加得總分，死亡計15分。記錄小鼠的進食、飲水、活動、毛發(fā)、體質量等情況。所有動物初始評分均為0分，以評分1～15分判定為小鼠發(fā)病。造模到開始發(fā)病時間記為潛伏期，連續(xù)3 d神經功能障礙評分不增加記為高峰期，發(fā)病小鼠于發(fā)病高峰期處死，未發(fā)病小鼠及空白組小鼠觀察至造模后28 d處死。取脊髓頸膨大、腰膨大組織以及腦室周圍組織。一部分脊髓組織浸泡在4%多聚甲醛中充分固定24 h，并制成4μm和6μm厚度石蠟切片，腦組織和另一部分脊髓組織放在-80℃冰箱中備用，分別用于qPCR和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測。

1.4 脊髓組織病理學檢查 每組隨機取3張4μm厚度的石蠟切片，依次進行脫蠟、蘇木精染色、伊紅染色、脫水封片、鏡下觀察并拍照，檢測炎性細胞浸潤情況。另外選取3張6μm厚度的石蠟切片依次進行脫蠟、醇化、LFB染液中染色、分化、鏡檢、風干、封片、鏡下觀察并拍照，檢測脫髓鞘情況。

1.5 qPCR檢測炎性因子中白細胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）mRNA表達水平 取各組動物凍存腦組織20 mg，采用Trizol法提取腦組織總RNA。微量分光光度計及瓊脂糖電泳鑒定RNA濃度，根據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。取2μL cDNA作為模板DNA，以GAPDH為內參，GAPDH引物：上游：5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，下游：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′，根據武漢金開瑞生物工程有限公司合成的引物在規(guī)定的擴增條件下進行PCR擴增。IL-1β引物：上游5′-GGGCCTCAAAGGAAAGAATCT-3′，下游5′-GAGGTGCTGATGTACCAGTTGG-3′；IL-6引物：上 游5′-GAGCATACCACTCCCAACAGACC-3′，下 游5′-AAGTTCATCATCGTTGTTCATACA-3′；TNF-α引物：上游5′-TCCCCAAAGGGATGAGAAGTT-3′，下 游5′-GAGGAGGTTGACTTTCTCCTGG-3′。PCR反應條件：95℃3 min；95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，循環(huán)40次。測得Ct值后，以2-ΔΔCt計算Fold change值作為目的基因的相對表達量。

1.6 Western blot檢測TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平 取小鼠凍存脊髓組織，反復清洗，剪碎后提取蛋白，使用BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白濃度。按照樣品濃度計算上樣體積，每孔40μg蛋白，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。使用甲醇活化聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后進行常規(guī)轉膜操作。轉好的膜使用封閉液在常溫下處理1 h，然后加入稀釋好的一抗［兔源抗TLR4、NF-κBp65（1∶2 000）多克隆抗體、兔源抗GAPDH內參抗體（1∶10 000）］4℃過夜，回收一抗，沖洗，加入稀釋二抗（HRP標記的山羊抗兔抗體，1∶10 000），室溫孵育30 min，ECL反應，暗室曝光。最后用AlphaEaseFC軟件分析，以GAPDH為內參，得出蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據分析，計量資料均以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法進行檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 依達拉奉右莰醇對EAE小鼠行為學的影響 空白組小鼠均無異常表現(xiàn)，模型組10只均發(fā)病，依達拉奉右莰醇干預組9只發(fā)病，發(fā)病小鼠出現(xiàn)精神不振、食欲降低、體質量下降等情況，神經系統(tǒng)障礙依次出現(xiàn)尾部張力下降、后肢癱瘓伴或不伴有前肢癱瘓、大小便失禁等表現(xiàn)。依達拉奉右莰醇干預組小鼠與模型組相比，發(fā)病潛伏期、高峰期延遲，高峰期神經功能障礙評分降低（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of latent period，peak period and peak neuro-functional deficiency scores between the two groups of mice表1 2組小鼠潛伏期、高峰期、高峰期神經功能障礙評分比較 （±s）

Tab.1 Comparison of latent period，peak period and peak neuro-functional deficiency scores between the two groups of mice表1 2組小鼠潛伏期、高峰期、高峰期神經功能障礙評分比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

組別模型組依達拉奉右莰醇干預組t發(fā)病（只）10 9潛伏期（d）9.20±1.55 14.11±2.20 5.667＊＊高峰期（d）14.80±1.75 17.11±1.54 3.042＊＊神經功能障礙評分（分）8.00±2.67 3.78±1.99 3.876＊＊

2.2 依達拉奉右莰醇對EAE小鼠脊髓組織病理學的影響 空白組小鼠脊髓組織未見異常；模型組發(fā)病高峰期脊髓組織大量炎性細胞浸潤，以單核細胞為主，脊髓白質可見大片白色脫髓鞘區(qū)域，脊髓組織明顯腫脹及空泡形成；依達拉奉右莰醇干預組較模型組脊髓組織炎性細胞浸潤減少，髓鞘組織腫脹減輕，空泡形成減少，見圖1。

2.3 依達拉奉右莰醇對EAE小鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平的影響 與空白組相比，其余2組小鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，依達拉奉右莰醇干預組小鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

Fig.1 Pathological changes of spinal cord tissue of mice in the three groups圖1 各組小鼠脊髓組織病理變化

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6,TNF-αmRNA expression levels in brain tissue homogenate between the three groups of mice表2 各組小鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6,TNF-αmRNA expression levels in brain tissue homogenate between the three groups of mice表2 各組小鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表3同。

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2.4 依達拉奉右莰醇對EAE小鼠脊髓組織中TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平的影響 與空白組相比，其余2組小鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，依達拉奉右莰醇干預組小鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），見表3、圖2。

Tab.3 Comparison of TLR4 and NF-κB p65 protein expression levels in spinal cord tissue between the three groups of mice表3 各組小鼠脊髓組織中TLR4、NF-κBp65蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of TLR4 and NF-κB p65 protein expression levels in spinal cord tissue between the three groups of mice表3 各組小鼠脊髓組織中TLR4、NF-κBp65蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

組別空白組模型組依達拉奉右莰醇干預組F TLR4 0.24±0.04 0.72±0.04a 0.34±0.50ab 100.192＊＊NF-κB p65 0.06±0.02 0.53±0.04a 0.18±0.05ab 116.365＊＊

Fig.2 The expression levels of TLR4 and NF-κBp65 proteins detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測TLR4、NF-κBp65蛋白表達水平

3 討論

MS是一種神經系統(tǒng)退行性疾病，致殘率高，給患者及其家庭帶來了極大的負擔［1］。目前MS的多種治療藥物費用昂貴，不良反應較多，且沒有任何藥物可完全預防或逆轉疾病進展［10］，故尋找安全有效的藥物是目前亟待解決的問題。依達拉奉右莰醇是依達拉奉與天然冰片的復方制劑，具有藥效穩(wěn)定、不良反應少等優(yōu)勢［6］。EAE是研究MS常用動物模型，本研究在構建EAE模型后發(fā)現(xiàn)小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、體質量下降以及不同程度身體癱瘓，同時病理檢測發(fā)現(xiàn)脊髓組織大量炎性細胞浸潤及大片髓鞘脫失，與人類MS臨床及病理表現(xiàn)相似，提示造模成功。經依達拉奉右莰醇干預可使EAE小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期延遲，高峰期神經功能障礙評分降低，脊髓組織炎癥細胞浸潤及髓鞘脫失減輕。該研究結果與預期結果一致，表明依達拉奉右莰醇對EAE小鼠有一定防治作用。

MS是一種中樞神經系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，在遺傳、環(huán)境等多種因素作用下，外周反應性T細胞遷移至中樞并激活中樞免疫細胞，啟動炎癥反應［11］。EAE發(fā)病過程中免疫細胞釋放的多種炎性因子參與病理進展。Liu等［12］研究發(fā)現(xiàn)炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α在EAE高峰期升高，并可激活炎癥轉錄因子NF-κB，形成正反饋回路，放大炎癥反應，最終導致脫髓鞘、軸突損傷，推動EAE進展。阻斷IL-1β信號傳導對自身免疫性炎癥有益［13］，IL-6基因敲除或阻斷TNF-α信號傳導后的EAE小鼠臨床癥狀減輕［14-15］。Zhang等［7］研究表明依達拉奉右莰醇可通過抑制多種炎癥因子表達從而對炎癥相關疾病具有明顯改善作用。本研究顯示模型組小鼠發(fā)病高峰期腦組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平顯著高于空白組，進一步表明EAE高峰期存在炎癥損害。經依達拉奉右莰醇干預可降低小鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平，表明依達拉奉右莰醇可通過抑制炎性細胞因子表達減輕EAE小鼠炎癥反應。

TLR4/NF-κB信號通路是調節(jié)細胞因子及趨化因子的關鍵通路，在EAE中，TLR4/NF-κB信號通路被激活，并與EAE進展相關［16］。TLR4是一種模式識別受體，可與相應配體結合成二聚體，并通過適配器蛋白髓樣分化因子88（MyD88）傳導信號，激活下游轉錄因子NF-κB［17］。NF-κB是炎癥因子基因轉錄的樞紐，靜息狀態(tài)下在細胞質中與抑制蛋白結合，激活后轉入細胞核中，調控多種炎癥因子轉錄，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，參與炎癥反應，推動EAE進展［18］。一些研究表明，苦參堿［4］、氟喹諾酮類抗生素［19］等抗炎藥物均可下調TLR4表達，緩解EAE癥狀。Zhang等［7］研究顯示，依達拉奉右莰醇可通過抑制NF-κB轉錄，降低炎性因子表達水平，從而發(fā)揮對急性肺損傷的抗炎作用。但依達拉奉右莰醇抑制NF-κB轉錄是否與TLR4有關暫不明確。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠發(fā)病高峰期脊髓組織中TLR4、NF-κB蛋白高表達，與相關研究一致[16]。經依達拉奉右莰醇干預后小鼠脊髓組織中TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著降低，表明依達拉奉右莰醇可抑制EAE小鼠TLR4/NF-κB信號通路活化，并且其可能通過抑制該通路活化減輕炎癥反應，從而對EAE小鼠發(fā)揮防治作用。

綜上所述，依達拉奉右莰醇可顯著減輕EAE小鼠炎癥反應，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路激活有關。本研究初步探討了依達拉奉右莰醇防治EAE的相關通路，但依達拉奉右莰醇如何抑制TLR4/NF-κB信號通路活化以及其防治作用是否與調控其他通路有關還需進一步研究。