趙妍，趙晶晶，康莉，李真玉，劉雙慶，陳兵△

抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，耐藥菌株的變異不僅顯著降低了傳統(tǒng)抗生素的藥效，還導(dǎo)致感染患者病死率大幅提高［1-2］。目前耐藥菌感染的臨床治療已經(jīng)陷入了極大的困境，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的治療難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)［3］。近年來，光熱治療（PTT）的出現(xiàn)和快速發(fā)展為耐藥菌感染的治療提供了新的途徑。光熱治療是一種通過光熱轉(zhuǎn)化試劑將吸收的近紅外光的光能轉(zhuǎn)換為熱能，進(jìn)而在特定的病灶處產(chǎn)生較高的溫度，并將產(chǎn)生的熱能用來直接殺滅細(xì)菌病原體的新型光物理技術(shù)［4-6］。其中，光熱試劑吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）由于具有優(yōu)良的生物相容性和光熱性能引起了研究者的關(guān)注。目前，ICG作為光熱試劑在腫瘤診治方面研究廣泛，如用于口腔癌及乳腺癌前哨淋巴結(jié)標(biāo)測［7-8］、對中央型肺癌進(jìn)行近紅外可視化［9］、腦膜瘤的熒光引導(dǎo)手術(shù)［10］、肝癌的診治［11］、降低直腸癌手術(shù)吻合口瘺率［12］等，但在治療耐藥菌感染方面的研究鮮有報道。因此，本研究通過光熱轉(zhuǎn)化和光熱殺菌實(shí)驗(yàn)探討基于ICG的光熱治療對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的殺滅作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ICG（純度為99%）、MTT法細(xì)胞活性檢測試劑盒、胰酶購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；DMSO（天津市康科德公司）；超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、MH培養(yǎng)基（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院）；小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞（ATCC細(xì)胞庫）。紫外-可見-近紅外光譜儀（Ultraviolet-visible-near-infrared，UV-Vis-NIR，島 津UV-2700i）；熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀（Fluoroskan Ascent FL，日立F-7100）；酶標(biāo)儀（博科BK-EL10C）；808 nm近紅外激光器（北京VA-I-DC-808）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ICG光物理性質(zhì)的表征（1）紫外-可見-近紅外吸收光譜。將不同質(zhì)量濃度的ICG溶液（0.5、2、4、6、8和10 mg/L）放入紫外-可見-近紅外光譜儀中，測定其在不同波長的吸收值，并確定最大吸收波長與濃度的關(guān)系。（2）熒光發(fā)射光譜。將等梯度稀釋的不同質(zhì)量濃度的ICG溶液（0.5、1、2、4 mg/L）放入熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀器中，測定其在激發(fā)波長下的發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長。

1.2.2 光熱轉(zhuǎn)化性能測定 將等梯度稀釋的不同質(zhì)量濃度的ICG溶液（0、12.5、25、50、100和200 mg/L）用808 nm的近紅外激光（功率為1.5 W/cm2）照射10 min，使用熱電偶記錄溶液溫度變化，并使用熱值相機(jī)拍攝對應(yīng)圖片。

1.2.3 細(xì)胞毒性測定 通過MTT實(shí)驗(yàn)評估ICG對4T1細(xì)胞的毒性。首先，4T1細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下在RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。然后將細(xì)胞接種到96孔板（每孔1×104個細(xì)胞）中，在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。加入不同質(zhì)量濃度的ICG溶液（0、50、100、200和500 mg/L）混合培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL MTT溶液，繼續(xù)共培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，棄去上層培養(yǎng)基，再加入120μL DMSO，振蕩10 min，充分融解結(jié)晶后，酶標(biāo)儀下測定各孔在570 nm波長處的光密度（OD）值，進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值）/（未處理孔OD值-空白孔OD值）×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時，將培養(yǎng)的4T1細(xì)胞經(jīng)不同功率密度（0、0.33、0.66、1和1.5 W/cm2）的808 nm的激光照射10 min后，通過酶標(biāo)儀測定其在570 nm波長處的OD值，并通過上述公式計(jì)算細(xì)胞生存率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 光熱抗菌評價 將1×1010CFU/mL的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌加入96孔板，實(shí)驗(yàn)分為7組：PBS組、ICG組（500 mg/L）、激光照射組（1.5 W/cm2的808 nm激光照射10 min）、ICG+0.33 W/cm2激光照射組、ICG+0.66 W/cm2激光照射組、ICG+1 W/cm2激光照射組、ICG+1.5 W/cm2激光照射組。隨后取部分菌株涂布于MH培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，最后通過觀察菌株存活菌落來評價基于ICG的PTT的光熱殺菌療效，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICG的紫外和熒光光譜表征 ICG是外觀為綠色粉末的有機(jī)化學(xué)染料，化學(xué)式為C43H47N2NaO6S2，相對分子質(zhì)量為774.96，常溫常壓下性質(zhì)穩(wěn)定，見圖1。根據(jù)紫外吸收曲線結(jié)果顯示，ICG在808 nm處具有強(qiáng)烈的近紅外光吸收能力，見圖2。且隨著ICG質(zhì)量濃度的升高，其吸收峰值也逐漸升高，吸收峰值和ICG質(zhì)量濃度間具有良好的線性關(guān)系（R2=0.972），見圖3。通過熒光光譜結(jié)果所示，在760 nm激發(fā)下，ICG的最大發(fā)射波長為818.6 nm，證明ICG具有較強(qiáng)的組織穿透深度以及體內(nèi)熒光成像性能，見圖4。

Fig.1 The chemical structure of ICG圖1 ICG的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

Fig.2 The UV-vis-NIR absorption spectra of ICG圖2 ICG的紫外-可見-近紅外吸收光譜圖

Fig.3 The standard curve of absorbance at 808 nm versus ICG concentration圖3 ICG在808 nm近紅外光吸收強(qiáng)度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4 The fluorescent spectra of ICG圖4 ICG的熒光發(fā)射光譜圖

2.2 ICG的光熱轉(zhuǎn)化性能 ICG溶液（200 mg/L）經(jīng)功率密度為1.5 W/cm2的808 nm近紅外激光照射10 min后溫度可升高23.3℃，而純水的溫度僅升高了4.8℃。同時拍攝的熱值圖亦顯示了相同的結(jié)果，見圖5、6。證實(shí)ICG染料可以顯著地將所吸收的近紅外光能轉(zhuǎn)化為熱能，具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能。

Fig.5 Photothermal heating curves of ICG with different concentrations under irradiation圖5 不同濃度的ICG的光熱升溫曲線圖

Fig.6 Thermal contour map of photothermal heating of ICG with different concentrations圖6 不同質(zhì)量濃度的ICG的光熱升溫?zé)嶂祱D

2.3 ICG的細(xì)胞毒性 ICG不同質(zhì)量濃度組即0、50、100、200、500 mg/L組的細(xì)胞生存率分別為98.18%±1.31%、81.87%±2.69%、81.47%±2.94%、82.92%±2.61%、80.44%±2.98%，50～500 mg/L組間細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.402，P＞0.05）。不同功率密度的激光照射組即0、0.33、0.66、1、1.5 W/cm2組的細(xì)胞生存率分別為98.31%±1.42%、97.21%±1.59%、94.92%±1.98%、93.89%±1.38%、93.03%±2.31%，0.33～1.5 W/cm2組間細(xì)胞生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.864，P＞0.05）。證實(shí)ICG具有較低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性。

2.4 基于ICG的光熱殺菌實(shí)驗(yàn) 與PBS組比較，ICG+激光照射組隨著激光功率密度的升高，細(xì)菌存活數(shù)量逐漸下降，當(dāng)功率密度達(dá)到0.66 W/cm2時，有近一半的細(xì)菌被殺傷；當(dāng)功率密度達(dá)到1.5 W/cm2時，耐藥菌被光熱法完全殺滅，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=133.800，P＜0.01），見圖7、8。

Fig.7 The spread plate photographs of drug-resistant Staphylococcus Aureus after different photothermal treatments圖7 不同光熱處理后耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的存活菌落圖

Fig.8 The numbers of surviving drug-resistant Staphylococcus Aureus after different photothermal treatments圖8 不同光熱處理后耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的存活數(shù)量

3 討論

基于全球耐藥菌的高感染率及高致死率，2017年世界衛(wèi)生組織提出亟需研發(fā)針對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多發(fā)耐藥菌的新方案［13］。光熱療法的快速發(fā)展為抗耐藥菌感染的治療提供了全新的策略［14］。光熱治療是通過光熱試劑在近紅外激光照射下，將吸收的光能轉(zhuǎn)換成熱能進(jìn)而直接殺傷病原體的新型殺菌方法。選用具有良好生物相容性和光熱性能的光熱試劑是光熱殺菌的關(guān)鍵。盡管前期研發(fā)的多種光熱試劑具有較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)化性能，但復(fù)雜的合成過程和較低的生物安全性限制了其臨床應(yīng)用［15］。目前，相比于無機(jī)材料，新型的有機(jī)分子具有更好的生物相容性和更高的光熱轉(zhuǎn)化性能。ICG是被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的可直接應(yīng)用于臨床的有機(jī)熒光檢測及成像試劑［16］，可用于評估甲狀旁腺功能［17］、神經(jīng)外科血管造影［18］、腹腔鏡膽囊切除術(shù)中膽管造影［19］等。研究發(fā)現(xiàn)，ICG除了具有成像功能外［20-21］，還具有良好的光熱轉(zhuǎn)化性能，并適用于光熱治療［22］。

本研究通過ICG的紫外吸收光譜證實(shí)其在808 nm處具有良好的光吸收能力，且在低功率激光的照射下就能發(fā)揮較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)化性能，由此證實(shí)ICG是一種高效的光熱轉(zhuǎn)化試劑。光熱試劑的生物相容性一直是其實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。因此，在評估ICG光熱殺菌效果之前，本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)對ICG的細(xì)胞毒性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，即使ICG質(zhì)量濃度達(dá)到500 mg/L，4T1細(xì)胞仍具有較高的細(xì)胞生存率；并在功率密度為1.5 W/cm2時，4T1細(xì)胞的生存率仍較高，證實(shí)ICG具有良好的生物相容性，且單獨(dú)激光照射未對細(xì)胞帶來顯著的損傷。殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在無激光照射的情況下，加入或不加入ICG均不會對耐藥菌株的生存產(chǎn)生明顯的影響，表明僅用ICG不能達(dá)到任何殺菌效果。同樣，在不加入ICG的條件下，即使有激光的照射，耐藥菌株的存活率仍然極高，表明僅激光照射同樣也不能發(fā)揮顯著的殺菌作用。但當(dāng)加入ICG后再用激光照射，對于不同的激光光照梯度，0.33 W/cm2的功率密度較弱，激發(fā)ICG后產(chǎn)生的熱量難以實(shí)現(xiàn)光熱殺菌的效果；當(dāng)功率密度達(dá)到0.66 W/cm2時，ICG被激發(fā)后轉(zhuǎn)化生成并積累的熱量對耐藥菌株起到了一定的抑制作用；當(dāng)功率密度達(dá)到1 W/cm2時，絕大部分耐藥菌被有效抑制；當(dāng)功率密度達(dá)到1.5 W/cm2時，耐藥菌被有效殺傷，肉眼見不到任何菌落存活。以上結(jié)果證實(shí)ICG溶液吸收近紅外激光的能量后將光能轉(zhuǎn)化為熱能，升高的溶液溫度無差別殺死了耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，殺滅效果顯著，效果持續(xù)時間較長，實(shí)現(xiàn)了基于ICG的光熱殺菌療法。

綜上所述，ICG應(yīng)用方法簡便、生物相容性好、具有高效的光熱轉(zhuǎn)化性能，經(jīng)激光照射后具有較強(qiáng)的光熱殺菌效果?；贗CG的光熱治療對于耐藥菌殺菌方面的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢，這為耐藥性細(xì)菌感染的高效治療提供了新的途徑，具有臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用價值。