劉娜，張曉東，李永濤，金海峰，姜楊，王璐璐，劉丹陽，沈雷△

預(yù)計(jì)2045年全球糖尿病患者將達(dá)到6.93億［1］。糖尿病常并發(fā)神經(jīng)纖維和微血管病變，導(dǎo)致許多并發(fā) 癥［2］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）的重要類型，BMSC對多種疾病均有治療潛力［3］。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）［4］、腦源性神經(jīng)生長因子（brain derived nerve growth factor，BDNF）［5］、P物質(zhì)（substance P，SP）［6］等均具有促進(jìn)血管新生效應(yīng)，SP還能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速糖尿病性傷口愈合［7］。因此，SP成為促血管新生的新靶點(diǎn)［6］。SP聯(lián)合BMSC的雙重促血管新生作用將有利于修復(fù)糖尿病血管神經(jīng)損傷。雖然SP可通過MAPK信號(hào)通路抑制BMSC凋亡，促進(jìn)BMSC增殖和成骨分化［8］，但是高糖環(huán)境下SP對BMSC增殖、遷移或成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用及其分子機(jī)制還不明了。本文擬對該作用及機(jī)制進(jìn)行探討，為糖尿病皮膚潰瘍等并發(fā)癥的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 BMSC購自武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司，本實(shí)驗(yàn)保存使用。青霉素、鏈霉素、α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司；SP購自英國Abcam公司；蛋白激酶B（Akt）抑制劑GSK6906693購自美國Selleck公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所；磷酸鹽緩沖液（PBS）、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司；人CD31蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自美國R&D公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）重組蛋白均購自美國MyBioSource公司；無血清基質(zhì)膠購自美國BD公司；小鼠抗人CD31抗體，小鼠抗人Akt、p-Akt、GAPDH一抗及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自Abcam公司。結(jié)晶紫和多聚甲醛購自生工生物工程（上海）股份有限公司。SpectraMax iD3型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；IX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞高糖模型建立和細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSC，并以含25 mmol/L葡萄糖的α-MEM培養(yǎng)基為細(xì)胞高糖模型培養(yǎng)方法。使用對數(shù)期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為正常對照組（正常環(huán)境培養(yǎng)的BMSC）、高糖對照組（高糖環(huán)境下無任何刺激培養(yǎng)的BMSC）、高糖SP組（高糖環(huán)境下以10μmol/L SP刺激的BMSC）和高糖Akt抑制劑組（高糖環(huán)境下以1 nmol/L GSK690693和10μmol/L SP刺激的BMSC）［9］。

1.2.3 BMSC成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化 以含10%FBS、10μg/L VEGF、50μg/L bFGF的α-MEM培養(yǎng)基為BMSC成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)液。各組BMSC用成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)12 d，誘導(dǎo)BMSC成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 按照細(xì)胞分組情況，接種BMSC于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；每孔添加10μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。SpectraMax iD3酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各組樣品吸光度（A450）值。

1.2.5 Transwell細(xì)胞小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測BMSC遷移數(shù)目 接種BMSC到孔徑0.8μm的Transwell細(xì)胞小室。根據(jù)BMSC實(shí)驗(yàn)分組，向Transwell細(xì)胞小室下層的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入相應(yīng)的培養(yǎng)基或試劑，37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h。擦除Transwell細(xì)胞小室內(nèi)未遷移細(xì)胞后，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，每次1 min。4%多聚甲醛溶液室溫固定60 min，0.5%結(jié)晶紫染色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。IX83型倒置顯微鏡隨機(jī)拍照，計(jì)數(shù)BMSC遷移數(shù)目的平均值［10］。

1.2.6 ELISA檢測CD31蛋白含量 各組BMSC經(jīng)成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)12 d，0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次1 min。裂解液于4℃裂解細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，收集上清液，BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。ELISA試劑盒檢測裂解液中CD31蛋白含量。

1.2.7 基質(zhì)膠網(wǎng)眼形成實(shí)驗(yàn) 各組成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化后的細(xì)胞接種到預(yù)先鋪無血清基質(zhì)膠的8孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h。IX83型倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并隨機(jī)拍照各組細(xì)胞的5個(gè)視野，觀察成血管形成能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。Image J 1.8.0軟件計(jì)數(shù)網(wǎng)眼數(shù)量的平均值。

1.2.8 Western blot檢測Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 各組BMSC經(jīng)37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h，蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉等步驟，分別添加一抗小鼠抗人Akt（1∶1 000）、小鼠抗人p-Akt（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育16 h；再添加HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室溫避光孵育120 min，增強(qiáng)化學(xué)法顯影，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。Gel Image Svstem 4.2軟件分析蛋白條帶灰度的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0.2.263軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP促進(jìn)高糖環(huán)境下BMSC增殖 與正常對照組比較，高糖對照組A450值降低；高糖SP組A450值較高糖對照組升高；與高糖SP組相比，高糖Akt抑制劑組的A450值降低（P＜0.01），見表1。

2.2 SP促進(jìn)高糖環(huán)境下BMSC遷移 Transwell細(xì)胞小室遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，高糖對照組BMSC遷移數(shù)目減少；高糖SP組BMSC遷移數(shù)目較高糖對照組增多；與高糖SP組相比，高糖Akt抑制劑組的BMSC遷移數(shù)目減少（P＜0.01），見圖1，表1。

Tab.1 Comparison of BMSC results and Akt pathway-related protein levels between the four groups表1 各組BMSC實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 （±s）

Tab.1 Comparison of BMSC results and Akt pathway-related protein levels between the four groups表1 各組BMSC實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與高糖對照組比較，c與高糖SP組比較，P＜0.05。

組別正常對照組高糖對照組高糖SP組高糖Akt抑制劑組F A450（n=5）0.258±0.006 0.208±0.004a 0.322±0.008b 0.218±0.003c 346.000＊遷移數(shù)目（×103，n=10）253.94±9.33 166.66±7.63a 278.53±9.49b 176.47±8.14c 370.700＊＊CD31蛋白含量（ng/L，n=10）627.11±43.32 312.20±12.53a 529.28±12.74b 317.76±10.85c 384.200＊＊基質(zhì)膠網(wǎng)眼數(shù)目（個(gè)，n=4）32.23±0.71 23.33±0.71a 29.10±0.70b 15.43±0.54c 364.200＊＊Akt蛋白相對表達(dá)量（n=5）1.179±0.090 0.851±0.044a 1.314±0.055b 0.832±0.067c 52.900＊＊p-Akt蛋白相對表達(dá)量（n=5）0.827±0.022 0.751±0.038a 1.134±0.098b 0.490±0.027c 90.850＊＊

Fig.1 The migration of BMSC in each group detected by Transwell cell migration assay(crystal violet staining，×200，Scale bar=50μm)圖1 Transwell細(xì)胞小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測各組BMSC遷移情況（結(jié)晶紫染色，×200，標(biāo)尺=50μm）

2.3 SP能促進(jìn)高糖環(huán)境下BMSC成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化

2.3.1 SP能促進(jìn)高糖環(huán)境下BMSC表達(dá)CD31蛋白 ELISA檢測各組成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化后細(xì)胞的CD31蛋白含量發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，高糖對照組CD31蛋白含量明顯降低；高糖SP組CD31蛋白含量較高糖對照組顯著升高；與高糖SP組相比，高糖Akt抑制劑組CD31蛋白含量降低（P＜0.01），見表1。2.3.2 SP能促進(jìn)高糖環(huán)境下BMSC形成基質(zhì)膠網(wǎng)眼 基質(zhì)膠管網(wǎng)眼形成實(shí)驗(yàn)評估各組BMSC成血管分化后的細(xì)胞功能。相對于高糖對照組，正常對照組BMSC具有典型的網(wǎng)眼形態(tài)，排列整齊；與高糖對照組比較，高糖SP組BMSC表現(xiàn)比較完整的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)，排列比較有序；高糖Akt抑制劑組BMSC形成網(wǎng)眼的細(xì)胞比較分散。與正常對照組比較，高糖對照組網(wǎng)眼數(shù)目減少；高糖SP組網(wǎng)眼數(shù)目較高糖對照組增多；與高糖SP組相比，高糖Akt抑制劑組的網(wǎng)眼數(shù)目減少，見圖2，表1。

2.4 SP能促進(jìn)高糖環(huán)境下BMSC表達(dá)Akt和p-Akt蛋白 與正常對照組比較，高糖對照組Akt和p-Akt蛋白相對表達(dá)量均降低；高糖SP組Akt和p-Akt蛋白相對表達(dá)量較高糖對照組明顯升高；與高糖SP組相比，高糖Akt抑制劑組的Akt和p-Akt蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.01），見圖3，表1。

Fig.2 The mesh formation of BMSC in each group detected by matrix mesh formation assay(×100，Scale bar=100μm)圖2 基質(zhì)膠網(wǎng)眼形成實(shí)驗(yàn)檢測各組BMSC形成的網(wǎng)眼（×100，標(biāo)尺=100μm）

Fig.3 The protein expression levels of Akt and p-Akt in each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組細(xì)胞Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

3 討論

糖尿病易并發(fā)微血管及神經(jīng)纖維病變，繼而導(dǎo)致微循環(huán)障礙及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)。改善微循環(huán)將有利于局部組織血液供應(yīng)，逆轉(zhuǎn)高糖缺氧性血管或神經(jīng)組織損傷，對臨床改善糖尿病及其并發(fā)癥具有積極意義。BMSC能分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）及VEGF等因子，修復(fù)血管或神經(jīng)組織的損傷［11-12］。因此，BMSC可應(yīng)用于肝臟疾?。?3］、心臟疾?。?4］等治療。

研究發(fā)現(xiàn)，若局部組織形成高水平的CXCL8、SDF-1α、CXCL13等因子，可以有效促進(jìn)外源性BMSC歸巢，增強(qiáng)BMSC的再生修復(fù)作用［15］。目前，BMSC主要經(jīng)血管進(jìn)行移植，提高局部組織細(xì)胞因子水平將有利于動(dòng)員外源的BMSC歸巢，這是通過移植BMSC治療疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。人體神經(jīng)纖維與血管相伴而行，神經(jīng)生長因子、血管活性因子共同促進(jìn)神經(jīng)或血管的生長發(fā)育［16］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）除促進(jìn)神經(jīng)纖維生長和神經(jīng)遞質(zhì)釋放外，還可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管新生［17］。BMSC可表達(dá)NGF的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體激酶A（neurotrophin receptor kinase，TrkA）［18］，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）重塑細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管新生［19］。SP是速激肽（Tachykinins，TKs）家族成員，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)［20］。SP除了誘導(dǎo)BMSC增殖，還介導(dǎo)BMSC遷移，促進(jìn)傷口愈合［7］，上調(diào)BMSC表達(dá)SDF-1α和N-鈣黏蛋白，促進(jìn)BMSC成骨分化［21］。因此，SP具有較好的招募干細(xì)胞歸巢及再生修復(fù)作用。雖然SP是新的促血管新生靶點(diǎn)，但SP能否有效招募移植的BMSC歸巢至局部組織，促進(jìn)BMSC成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，發(fā)揮雙重促血管新生作用還需要深入研究。如能充分利用SP促進(jìn)BMSC遷移或成血管活性，將提高移植BMSC的再生作用。

本實(shí)驗(yàn)以25 mmol/L葡萄糖建立的細(xì)胞高糖模型能較好模擬糖尿病高血糖狀態(tài)。CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了與高糖對照組相比，SP能夠促進(jìn)高糖環(huán)境下BMSC增殖過程。田麗等［22］采用1、10、1×103、1×104、1×105和1×106nmol/L等6個(gè)濃度的SP干預(yù)人牙周膜細(xì)胞（hPDLC），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著SP濃度的增高，SP通過激活組蛋白去乙?；福℉DAC），導(dǎo)致H3組蛋白去乙?；龠M(jìn)hPDLC增殖，修復(fù)牙周組織。一項(xiàng)對食管癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，SP可通過與EC109食管癌細(xì)胞的神經(jīng)激肽1受體（neurokinin 1 receptor，NK1R）結(jié)合，上調(diào)發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy and enhancer of split 1，HES-1）蛋白表達(dá)而提高EC109食管癌細(xì)胞的增殖能力［23］。許多實(shí)驗(yàn)表明，SP能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，廣泛參與頭頸癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生過程［24-25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)論基本一致。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑能夠阻滯SP對BMSC增殖的促進(jìn)作用，提示Akt通路在SP對BMSC增殖的促進(jìn)作用中起到一定作用。

角膜等組織的感覺神經(jīng)末梢分泌的SP對神經(jīng)纖維生長具有較好促進(jìn)作用［26］。SP介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的遷移，促進(jìn)傷口愈合［27］。本實(shí)驗(yàn)通過Transwell細(xì)胞小室遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)SP在高糖環(huán)境下也能夠促進(jìn)BMSC遷移，這提示糖尿病狀態(tài)下，SP能啟動(dòng)BMSC歸巢，對提高糖尿病患者體內(nèi)BMSC的利用率，修復(fù)糖尿病組織損傷具有重要意義。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Akt抑制劑組BMSC遷移數(shù)目降低，這可能是由于GSK690693干擾Akt磷酸化，阻滯SP-Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞遷移的過程所致。因此，筆者認(rèn)為SP誘導(dǎo)高糖環(huán)境下BMSC增殖和遷移，減少BMSC凋亡的作用可能與Akt信號(hào)通路相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，阿瑞匹坦（Aprepitant）能夠阻斷SP與NK1R結(jié)合，下調(diào)PI3K-Akt-NF-κB通路蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，抑制人食管鱗癌細(xì)胞KYSE-30的生長［28］。也有研究揭示了SP可活化膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ERK信號(hào)通路，介導(dǎo)小鼠口腔頜面部疼痛的傳導(dǎo)［29］，由此可見SP的作用機(jī)制比較復(fù)雜，還需要今后利用多組學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，SP不僅促進(jìn)神經(jīng)生長，還能夠促使血管新生，調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張過程［30］。SP可上調(diào)VEGF和SDF-1α表達(dá)，改善糖尿病皮膚潰瘍等微循環(huán)障礙，促進(jìn)糖尿病傷口愈合［7］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下，SP能促進(jìn)BMSC成血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，再次豐富了血管與神經(jīng)纖維相互作用，神經(jīng)因子能夠促進(jìn)血管生長的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。利用SP等神經(jīng)因子募集或保護(hù)移植的BMSC治療糖尿病皮膚潰瘍、糖尿病心臟病等糖尿病并發(fā)癥具有較好的應(yīng)用前景。后續(xù)將著重探討高糖條件下SP等神經(jīng)因子對BMSC基因表達(dá)的影響，篩選與BMSC相互作用的神經(jīng)因子，為深入探索神經(jīng)因子和干細(xì)胞的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。