金紫陽，袁思棋，劉 君，2

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000；2.宜賓五糧液集團有限公司，四川宜賓 644000）

乳酸脫氫酶（ldh）是一種廣泛分布于植物、微生物和動物細胞內(nèi)的重要功能酶，是糖酵解的關(guān)鍵酶之一，性質(zhì)存在較大差異，能催化氧化還原反應(yīng)，于生物體內(nèi)氧化產(chǎn)能以及解毒等途徑發(fā)揮關(guān)鍵作用。在哺乳動物中l(wèi)dh-a、ldh-b 和ldh-c 3 個基因編碼廣泛分布于不同組織中的6 種結(jié)構(gòu)相似的ldh蛋白，其中包括5 種由ldh-a 和ldh-b 基因編碼的同工酶，以及一種由ldh-c基因編碼并在睪丸和精子中表達的酶。在生物體內(nèi)，ldh 在輔酶NAD/NADH 的作用下能催化丙酮酸與乳酸之間的可逆轉(zhuǎn)化。在可逆轉(zhuǎn)化時ldh每個亞基可以與單個輔酶分子以及單個底物分子相連結(jié)，以便獨立發(fā)生轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化有NAD的參與時，使乳酸被ldh 可逆地催化氧化去質(zhì)子化，轉(zhuǎn)化成H以及去質(zhì)子化的丙酮酸，同時，NAD和來源于底物的H結(jié)合生成NADH。

在醫(yī)學檢測方面，ldh 是一種常用的臨床診斷酶，是檢測其他酶和生物制品的一種通用輔助酶，如檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌激酶和丙酮酸激酶等酶活性。ldh 可檢測人體血清中的丙酮酸含量，可用ldh 試劑盒對NK 細胞的活性進行檢測?；趌dh 的廣泛底物譜，ldh 可用于生產(chǎn)乳酸、蘋果酸、苯乳酸和扁桃酸等高附加值有機酸。例如，乳酸和蘋果酸均是安全的食品添加劑，已用于發(fā)酵奶制品、腌漬食品和飲料的生產(chǎn)。這些有機酸在食品、醫(yī)藥和材料等行業(yè)均有重要的應(yīng)用價值。

課題組保存的1 株瘤胃菌R1 具有利用乳酸合成己酸的功能，在這個過程中，乳酸在乳酸脫氫酶和NADH 的催化下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，以丙酮酸作為中間體將羧酸鏈延長，降三碳的乳酸合成六碳的己酸。本研究從R1 中克隆獲取乳酸脫氫酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGX-6p-1-，并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)進行異源表達，研究重組的酶學性質(zhì)，為隨后的菌種分子改造與己酸發(fā)酵提供更加精確的理論基礎(chǔ)，為工業(yè)應(yīng)用提供指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

克隆表達菌株DH5α 和BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司；瘤胃菌R1和質(zhì)粒PEGX 6P-1 由實驗室保藏。

1.1.2 試劑及耗材

培養(yǎng)基成分購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；IPTG、氨芐青霉素購自生工生物工程股份（上海）有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA 快速回收純化試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；Ex Taq DNA 聚合酶及限制性內(nèi)切酶BamH I 和Xho I均購自TaKaRa 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中已報道的瘤胃菌CPB6基因組中的ldh 基因（GenBank：CP020705.1）序列為模板，設(shè)計引物，對R1 提取DNA 后進行PCR 擴 增。ldh-F：5'-CGCGGATCCATGAAAACAAGAAAAATCGGCG-3'，下劃線序列為BamHⅠ酶切位點；ldh-R：5'-CCGCTCGAGGTCGACGCAAAGGTCTTTTAGC-3'，下劃線序列為Xho I 酶切位點。引物由成都擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒

經(jīng)過PCR 擴增得到ldh 基因片段。將擴增后的目的片段和pEGX 6p-1 載體使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后，用T4 DNA 連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α，挑取單菌落經(jīng)菌落PCR 及提取質(zhì)粒雙酶切后送至成都擎科生物技術(shù)有限公司進行測序鑒定。

1.2.3 重組ldh的表達和純化

挑取攜帶pGEX 6p-1-質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落，至含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。以2%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)直至OD達到0.7 左右，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，18 ℃過夜誘導。8000 r/min離心3 min 收集菌體細胞，PBS 重懸后超聲破碎細胞，以10000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液。用谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B 掛柱，PP 酶切除GST標簽。SDS-PAGE 凝膠電泳檢測目的條帶，純化后的蛋白于4 ℃冰箱保藏。

1.2.4 ldh生物信息學分析

根據(jù)測序結(jié)果使用ExPASy 網(wǎng)站提供的Prot-Param 工具對ldh 的氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析；親疏水性特征使用ExPASy 網(wǎng)站的ProtScale 工具進行分析；使用在線工具NPSA server 中的SOPMA 進行l(wèi)dh 的氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測；使用CDD 和SMART 對ldh 保守結(jié)構(gòu)的分析；ldh 信號肽的分析和預(yù)測采用工具SignalP 5.0 server；運用TMHMM 2.0 Server 進行l(wèi)dh 的跨膜結(jié)構(gòu)域的分析 和 預(yù) 測；使 用SWISS-MODEL 和I-TASSER 對ldh 進行3D 建模，以及使用SAVES 對模型進行評價。

1.2.5 ldh酶活測定

用0.1 mol/L pH7.5 的PBS 緩沖液配制80 mM的丙酮酸鈉溶液和4 mM 的NADH 溶液，測定酶活前將溶液25 ℃水浴預(yù)熱。取2 支光徑為1 cm 的石英比色皿，1 支中加入3 mL 丙酮酸鈉溶液，放在紫外分光光度計中，340 nm處調(diào)A值為0；另取1支比色皿依次加入2.9 mL 丙酮酸鈉溶液和0.1 mL NADH 溶液，加蓋搖勻后立即測定A，然后加入純化后的酶液10 μL，立即計時，每隔30 s 測1 次A，連續(xù)測定3 min，計算ΔA。

1.2.6 ldh最適反應(yīng)溫度與溫度穩(wěn)定性

用0.1 mol/L pH7.5 的磷酸鹽緩沖液配制底物丙酮酸鈉溶液和輔酶NADH 溶液，在20～60 ℃條件下測定A并計算比活力，以最高反應(yīng)速度作為100%反應(yīng)活力，得到其他相對活力，100%反應(yīng)活力對應(yīng)的溫度即為ldh的最適溫度。

將酶液在15～75 ℃下分別放置4 h，每隔1 h測定一次A并計算比活力，將0 h 的酶活力作為100 %反應(yīng)活力，記錄不同溫度下ldh 酶活力的變化情況。

1.2.7 ldh最適反應(yīng)pH值及其穩(wěn)定性

用pH5～8 的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液分別配制底物丙酮酸鈉溶液和輔酶NADH 溶液，在37 ℃反應(yīng)并測定A并計算比活力，以最高反應(yīng)速度作為100%反應(yīng)活力，得到其他相對活力，100%反應(yīng)活力對應(yīng)的pH值即為ldh的最適pH值。

將酶液在pH5～8 的環(huán)境下放置4 h，每隔1 h測定一次A并計算比活力，將0 h 的酶活力作為100%反應(yīng)活力，記錄不同pH 值下ldh 酶活力的變化情況。

1.2.8 金屬離子和EDTA對ldh酶活的影響

Mn、Ca等是某些酶的激活劑,在最適反應(yīng)條件下,反應(yīng)體系中添加3 mM 的NaCl、ZnCl、CaCl、MnSO、FeCl、CuCl、CoCl、MgCl和EDTA，研究不同金屬離子對ldh酶活性的影響。將不加任何金屬離子只加入等量緩沖液的對照組的酶活力作為100%反應(yīng)活力，計算不同金屬離子條件下的相對活力并分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 ldh外源表達與蛋白質(zhì)純化

利用PCR 技術(shù)擴增出ldh 基因。PCR 產(chǎn)物用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1 所示，在1000 bp 左右出現(xiàn)單一條帶，與預(yù)測的ldh基因長度964 bp一致，判定條帶是目標產(chǎn)物。

圖1 ldh的PCR擴增產(chǎn)物

圖2 重組蛋白SDS-PAGE電泳圖

對重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達結(jié)果進行SDS-PAGE凝膠電泳驗證檢測。SDS-PAGE 結(jié)果顯示經(jīng)過12 h 誘導后，BL21(DE3)/ pGEX-6p-1-全 細 胞 在60 kDa附近出現(xiàn)一條明顯的條帶，與目的基因表達后的大小一致（含GST 標簽），且在上清中表達，而未誘導的重組的菌株無該條帶存在，初步表明添加IPTG 后，重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-在BL21(DE3)中得到了正確的可溶性表達。按照瓊脂糖凝膠4B 親和層析純化方法，對重組蛋白進行純化。通過粗酶液與beads 結(jié)合、雜蛋白漂洗、pp 酶切掉GST 標簽、目的蛋白的純化，得到純度較高的目的蛋白。純化后的目的蛋白在約37 kDa 處有一條明顯條帶。

2.2 ldh理化性質(zhì)和親水性/疏水性分析

使用ProtParam 工具分析ldh 酶氨基酸序列理化性質(zhì)，在線預(yù)測結(jié)果見表1。使用ProtScale對ldh氨基酸序列進行親水性/疏水性預(yù)測，結(jié)果見圖3。

圖3 ldh的親水性/疏水性分析

表1 ldh氨基酸序列理化性質(zhì)分析

通過ProtParam 的預(yù)測結(jié)果可知，CPB6-ldh 的氨基酸數(shù)為320 aa，分子量約為34.79 kDa，不穩(wěn)定系數(shù)為27.28，小于40，表明ldh蛋白是較穩(wěn)定蛋白，且脂肪系數(shù)較高，為92.06，推測ldh 是熱穩(wěn)定性蛋白。根據(jù)ProtScale 預(yù)測結(jié)果，Hphob./Kyte &Doolittle 量表規(guī)定疏水性越強的氨基酸標度值越高，當?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸標度值大于0 時為疏水，小于0 時為親水。平均親水系數(shù)為0.004 表明ldh 疏水性較高，這可能是由于ldh中丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）等疏水性氨基所占比例較高，在親水性/疏水性分析中，ldh 氨基酸序列的第273 位纈氨酸（Val）的值為2.344，疏水性最強；第201 位賴氨酸（Lys）的值為-2.778，親水性最強。

2.3 ldh的信號肽和跨膜區(qū)域預(yù)測

利用SignalP 5.0 server 對ldh 的氨基酸序列進行信號肽分析，分析結(jié)果見圖4，表示氨基酸序列存在信號肽，可能性達到0.8645，且裂解位點在氨基酸序列29位和30位之間。

圖4 ldh信號肽預(yù)測

利用在線工具TMHMM 2.0 Server 對ldh 的跨膜區(qū)進行分析和預(yù)測，結(jié)果見圖5。在預(yù)測結(jié)果中，Inside 表示胞內(nèi)區(qū)，Outside 表示胞外區(qū)，Transmembrane 表示跨膜區(qū)，數(shù)值越大表示可能性越大。因此可以看出ldh 為胞外酶，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖5 ldh跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.4 ldh二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域分析

通過SOPMA 在線工具對ldh 的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果見圖6。蛋白的二級結(jié)構(gòu)一般由α-螺旋、β-鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)原件組成。由圖6 可以看出，ldh 的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其中α-螺旋占43.12 %，無規(guī)則卷曲占27.5 %，此外，延伸鏈占21.56 %，β-轉(zhuǎn)角占7.81 %。蛋白質(zhì)的功能作用主要取決于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋主要是穩(wěn)定其骨架，可起到跨膜傳遞的作用；蛋白酶的功能部位通常在無規(guī)則卷曲的構(gòu)象區(qū)域。無規(guī)則卷曲可以使空間結(jié)構(gòu)中的自由能達到最大，從而促進蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，預(yù)測結(jié)果中的無規(guī)則卷曲占比較多，說明ldh 可能具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖6 ldh二級結(jié)構(gòu)（a）與結(jié)構(gòu)域（b）分析

通過CDD和SMART工具對ldh的保守結(jié)構(gòu)域分析。分析可知，ldh 具有高度保守的功能位點和結(jié)構(gòu)域，ldh 特定匹配在L-2-羥基異丙酸脫氫酶（HicDH）亞家族，屬于NADB-Rossmann超級家族，含有l(wèi)dh-1-N 結(jié)構(gòu)域（氨基酸序列第4～145 位）和ldh-1-C 結(jié)構(gòu)域（氨基酸序列第148～315 位）。這兩個結(jié)構(gòu)域存在于代謝途徑的許多脫氫酶中，如糖酵解過程和許多其他氧化還原酶。結(jié)構(gòu)域中存在NAD結(jié)合位點的典型高度保守基序GXGXXG，使酶蛋白在輔酶NAD/NADH 的存在下才能催化乳酸和丙酮酸的可逆轉(zhuǎn)化。

2.5 ldh蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及評價

使用SWISS-MODEL 工具對ldh 氨基酸序列進行同源建模，預(yù)測結(jié)果如圖7（左）所示。根據(jù)結(jié)果顯示，ldh 與3wsw.1（SMTL：ID）模板覆蓋率為98%，同源性為30.57%。在預(yù)測到的三維結(jié)構(gòu)中，紅色表示α-螺旋，黃色表示β-折疊，綠色為無規(guī)則卷曲區(qū)域，總體來看，ldh 的三維結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)象區(qū)域為主，預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符合。

使用在線軟件SAVES 中的Verify_3D 以及拉氏構(gòu)象圖對模型進行評價。結(jié)果顯示，ldh 的Verify_3D 評分為82.86 %。拉氏構(gòu)象圖簡稱拉氏圖(Ramachandran Plot)，它的作用是體現(xiàn)氨基酸殘基在拉氏圖中的區(qū)域分布。拉氏構(gòu)象圖分為四個區(qū)，紅色區(qū)域是最合適區(qū)域，其中的氨基酸數(shù)目越多表示該蛋白模型的骨架結(jié)構(gòu)越合理；黃色區(qū)域是允許區(qū)域；淺黃色區(qū)域是最大允許區(qū)；白色區(qū)域是不允許區(qū)，該區(qū)域氨基酸的構(gòu)象是不合理的。根據(jù)圖7（右）可知，處于最合適區(qū)域的氨基酸殘基占92.3%，不允許區(qū)占0.2%。

圖7 ldh三維結(jié)構(gòu)模型（左）與拉氏構(gòu)象圖（右）

2.6 重組ldh酶活測定

重組ldh 表達后經(jīng)細胞破碎得到粗酶液，粗酶液經(jīng)過瓊脂糖凝膠4B 親和純化得到電泳級ldh。ldh 的分離純化結(jié)果如表2 所示，最終重組ldh 的純化倍數(shù)為14.29，比活力為29.365 U/mg。

表2 重組ldh比活力

2.7 重組ldh最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

在20～60 ℃條件下測定了ldh 的酶活，由圖8（a）可以看出，在20～60 ℃條件下ldh 均有酶活。在20～40 ℃低溫范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶活力不斷增加，當溫度達到40 ℃時，酶活性達到最高值；當溫度大于40 ℃時，酶活呈不斷下降的趨勢，在60 ℃時，ldh酶活降到最低。

在15～75 ℃條件下測定了ldh 的溫度熱穩(wěn)定性能力。結(jié)果如圖8（b）所示，不同溫度處理4 h后，只有15 ℃條件下ldh 相對酶活還能保持80 %以上，25 ℃和35 ℃條件下處理4 h 后還能保持在45%以上。從45 ℃水浴開始，隨著時間延長，酶活大幅度下降，65 ℃和75 ℃處理影響最明顯，在處理1 h 后相對活性就開始急劇下降，2 h 后完全失活。綜合上述最適溫度結(jié)果可知，ldh 耐高溫能力較弱，即使高溫下有酶活，但經(jīng)過長時間處理后，也會導致酶失活。

圖8 ldh的最適溫度（a）和溫度穩(wěn)定性（b）

2.8 重組ldh最適反應(yīng)pH值及其穩(wěn)定性

在pH 5.0～8.0 條件下測定了ldh 的酶活。結(jié)果如圖9（a）所示，在pH 值為6.0 和6.5 時，ldh 表現(xiàn)較大活性，且pH6.5時酶活性最高；在pH值低于5.5時酶活較低，pH 值高于7.0 時酶活性急劇下降，pH8.0時相對活性僅有21%左右。

在pH5.0～8.0 條件下測定了ldh 的耐酸堿穩(wěn)定性，從圖9（b）可以看出，在pH 6.5～7.5 的條件下處理4h 后ldh 相對活性仍然能保持在50 %以上；在pH 值為6.0 和8.0 條件下處理2 h 后相對活性也能保持在60 %左右，但隨著時間延長相對活性也急劇下降；在pH5.0 條件下，4 h 后ldh 完全失活。由此可見，ldh在中性環(huán)境中有更好的pH值穩(wěn)定性。

圖9 ldh的最適pH（a）和pH穩(wěn)定性（b）

2.9 金屬離子和EDTA對ldh酶活的影響

金屬離子能夠?qū)Φ鞍酌富町a(chǎn)生一定的影響，以不添加任何金屬離子的底物溶液作為空白對照，3 mM 不同金屬離子的反應(yīng)體系作為實驗組。結(jié)果如圖10 所示，添加Na對ldh 酶活有輕微促進作用；添加Mn和Co有較明顯的促進作用；酶活提高了20%左右；添加Ca、Zn、Fe、Cu對ldh 酶活有較大的抑制作用，其中Fe的抑制作用最大，Mg的抑制作用相對較小，處理后的酶活能維持在85 %左右。汪勛清等研究發(fā)現(xiàn)，添加Ca和Zn后ldh 無明顯變化，添加Mn后明顯抑制了ldh 酶活，與本研究結(jié)果有差異，可能與ldh來源和結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，并且實驗所添加的金屬離子的濃度和ldh的純度不同也會對結(jié)果產(chǎn)生影響。值得注意的是，本研究中Co對ldh 的活性促進作用最大，而重金屬Co對大多數(shù)酶的活性都有抑制作用，猜測可能是Co與ldh 氨基酸殘基結(jié)合而影響了ldh 活性中心，或類似堿性羧肽酶中Co代替Zn作為酶的輔助因子而促進了ldh活性。

圖10 金屬離子和EDTA對酶活的影響

添加金屬螯合劑EDTA 對ldh 酶活的抑制作用很明顯，EDTA 可以和一些金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，酶的活性中心通常會有金屬離子，與EDTA絡(luò)合后酶的活性受到了抑制，因此金屬離子對ldh酶活有重要影響。

3 結(jié)論

己酸可作為食用香料、動物飼料添加劑、天然抗菌劑和液體燃料的前體。隨著對己酸需求的增加，微生物發(fā)酵產(chǎn)己酸的研究越來越受到重視。實驗室保藏的瘤胃菌R1 具有將乳酸轉(zhuǎn)化為己酸的功能，在其轉(zhuǎn)化乳酸的過程中，乳酸脫氫酶開啟了第一步反應(yīng)。雖然各界學者對乳酸脫氫酶的研究已經(jīng)非常透徹，但是關(guān)于瘤胃菌中乳酸脫氫酶的性質(zhì)研究報道非常少。為了研究ldh在微生物利用乳酸產(chǎn)己酸的過程中的作用，通過分子層面提高乳酸轉(zhuǎn)化的效率，本研究通過異源表達技術(shù)和酶學性質(zhì)研究對ldh 進行了初步探索。以R1 基因組為模板，利用PCR 技術(shù)擴增出ldh 基因，經(jīng)測序后用NCBI 數(shù)據(jù)庫的BLAST 工具比對分析，與GenBank公布的瘤胃菌CPB6 的ldh 基因序列的同源性為99%，氨基酸序列的同源性為100%，說明ldh 基因在瘤胃菌中是非常保守的。本研究構(gòu)建了pEGX 6p-1-ldh 重組質(zhì)粒，并將其導入BL21(DE3)中實現(xiàn)了異源表達。經(jīng)純化后的重組ldh酶活達到29.365 U/mg，酶學性質(zhì)測定結(jié)果顯示，最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最適反應(yīng)pH 值為6.5，Na、Mn和Co對ldh酶活有促進作用，這對后續(xù)研究使ldh酶活達到最大化提供了理論依據(jù)。