吳雪， 黃彩云， 袁佳鈺， 付雅芬， 馬佳雪， 楊潔， 張前,**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712000； 2.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710000)

膠質(zhì)細(xì)胞約占哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總量的90%，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有不可替代的作用。膠質(zhì)細(xì)胞主要包括大膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)和小膠質(zhì)細(xì)胞，其中小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)過(guò)程中尤為關(guān)鍵，二者在炎癥損傷機(jī)制中所扮演的角色正成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前文獻(xiàn)中獲取這兩種細(xì)胞的組織材料主要來(lái)源于動(dòng)物大腦[1-4]，以昆明胎鼠脊髓作為組織材料的文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，一般需要9～14 d才能達(dá)到較高的匯合度?，F(xiàn)有報(bào)道中，獲得高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的方法各異，效率不一，步驟較復(fù)雜。本研究采用孕晚期昆明胎鼠的脊髓作為組織來(lái)源，采用機(jī)械吹打結(jié)合自然沉降獲得混合膠質(zhì)細(xì)胞、搖床振搖結(jié)合傳代進(jìn)行分離純化，可以在較短的時(shí)間內(nèi)(6～9 d)獲得高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，為后期研究與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的脊髓源疾病提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 昆明小鼠(孕晚期)購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑 高糖伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)、0.25% 胰蛋白酶[含0.038% 乙二胺四乙酸(EDTA)]、青霉素(100 000 U/L)、杜式磷酸鹽緩沖液(dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)、Dylight 488二抗、4%多聚甲醛溶液均購(gòu)自博士德公司(中國(guó)，武漢)，多聚賴氨酸(Poly-L-lysine, PLL)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó)，圣路易斯)，Triton X-10購(gòu)自Amresco公司(美國(guó)，華盛頓)，二脒基苯基吲哚(DAPI)購(gòu)自巴傲得公司(中國(guó)，南京)。

1.1.3主要儀器 光學(xué)顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、解剖顯微鏡均購(gòu)自徠卡公司(德國(guó)，維茨拉爾)，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自默賽飛世爾科技有限公司(中國(guó)，上海)，水浴恒溫?fù)u床購(gòu)自一恒科學(xué)儀器有限公司(中國(guó)，上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 孕晚期昆明小鼠麻醉后脫頸處死，浸泡于75%酒精內(nèi)消毒10 min，剖腹剝離胎盤(pán)與羊膜，取出胎鼠。解剖顯微鏡下分離胎鼠脊髓步驟如下：以背部正中位置的紅色血管為標(biāo)記，沿下方5 mm處劃破椎管，暴露脊髓；固定小鼠兩側(cè)臀部，從尾部挑出脊髓末端，分離背根神經(jīng)與脊髓的粘連，快速剝離脊髓(盡量維持組織完整)。移至預(yù)冷的DPBS中，剝?nèi)ケ砻嫜芘c脊膜并漂洗1～2次。取材步驟見(jiàn)圖1,操作均在醫(yī)用冰盒上進(jìn)行。將脊髓組織剪碎至黏稠糊狀，加入0.25%含EDTA的胰蛋白酶，混勻，消化15～20 min，加入1.5～2倍體積的完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素+1%鏈霉素)終止消化,移入離心管，輕柔吹打制成細(xì)胞懸液，靜置5 min，待組織碎片自然沉降，收集上層2/3液體。剩余組織團(tuán)塊中再添加適量完全培養(yǎng)基，輕柔混勻后靜置5 min，收集上層2/3液體。合并2次細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心3 min，棄上清液。細(xì)胞沉淀中加入適量完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶中(25 mg/L PLL提前包被30 min)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d全量換液1次。

注：A為昆明孕鼠，B為胎鼠，C漂洗干凈的脊髓。圖1 胎鼠脊髓取材Fig.1 The procedure of collecting spinal cords of fetal mice

1.2.2星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化 細(xì)胞培養(yǎng)4～5 d后，匯合度約為90%～95%，此時(shí)的細(xì)胞為混合膠質(zhì)細(xì)胞；將混合膠質(zhì)細(xì)胞置于37 ℃、300 r/min軌道搖床中，振搖4～6 h后收集瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基。由于小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁不牢固，收集的培養(yǎng)基中絕大多數(shù)為振搖下來(lái)的小膠質(zhì)細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基重懸均勻，接種于另一培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，該瓶細(xì)胞即為原代(P0)小膠質(zhì)細(xì)胞。原培養(yǎng)瓶中未被振搖下來(lái)的細(xì)胞即為P0星形膠質(zhì)細(xì)胞，由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于小膠質(zhì)細(xì)胞，振搖后瓶底細(xì)胞的匯合度也已達(dá)到75%～85%；對(duì)P0星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行一次傳代，先用PBS清洗1～2次，添加胰蛋白酶2 mL，恒溫消化3 min；細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)回縮變圓、呈片狀脫落時(shí)，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化；細(xì)胞懸液移至離心管1 000 r/min離心3 min，棄去上清液；細(xì)胞沉淀中加入4 mL完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞混懸液，按1 ∶2傳代，傳代后的細(xì)胞即為P1星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.3星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，利用細(xì)胞熒光染色法鑒定P1星形膠質(zhì)細(xì)胞純度或P0小膠質(zhì)細(xì)胞純度，步驟如下：將細(xì)胞接種于玻璃爬片，匯合達(dá)到60%左右時(shí)，4%多聚甲醛室溫固定15 min，再加0.1%的TritonX-100室溫孵育10 min進(jìn)行細(xì)胞穿透；10%山羊血清室溫封閉1 h，兔多抗克隆GFAP抗體(1 ∶200，鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞)或兔多抗克隆CD11b抗體(1 ∶200，鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞)；4 ℃孵育過(guò)夜；Dylight 488羊抗兔二抗(1 ∶200)室溫避光孵育1 h，DAPI室溫避光染核5 min；甘油封片后，于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

2.1.1星形膠質(zhì)細(xì)胞 經(jīng)恒溫?fù)u床(300 r/min，4～6 h)純化、尚未傳代的星形膠質(zhì)細(xì)胞為P0星形膠質(zhì)細(xì)胞，其胞體延伸出的突起短而粗大，呈單層扁平星狀，細(xì)胞核大，呈卵圓形或圓形，核仁不明顯。傳代后，P1星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體逐漸變大，生長(zhǎng)速度加快，12 h后匯合度即可達(dá)到60%，1～2 d細(xì)胞即可鋪滿瓶底。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度不斷增加，但從第5代開(kāi)始細(xì)胞活力逐漸下降。因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選擇4代內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

注：A為未經(jīng)純化的混合膠質(zhì)細(xì)胞，B為P0星形膠質(zhì)細(xì)胞，C為接種12 h后的P1星形膠質(zhì)細(xì)胞。圖2 純化過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化(10×)Fig.2 The morphological changes of astrocytes in different cell passages during purification process(10×)

2.1.2P0小膠質(zhì)細(xì)胞 P0小膠質(zhì)細(xì)胞是混合膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)振搖后從上清液中收集得到的，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于星形膠質(zhì)細(xì)胞，生長(zhǎng)速度也較慢。接種第3天，鏡下可見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)多為圓形、桿狀、阿米巴狀(均為激活態(tài))或細(xì)長(zhǎng)分支狀(靜息態(tài))。接種第8天，其突觸延長(zhǎng)，匯合度到達(dá)60%～70%。約在10～12 d，細(xì)胞呈多分枝狀，細(xì)胞間相互交織，匯合度達(dá)到90%。見(jiàn)圖3。

注：A為接種后第3天，B為接種后第8天，C為接種第12天。圖3 純化后的P0小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化(10×)Fig.3 The morphological changes of P0 microglia at different time points after purification(10×)

2.2 細(xì)胞純度鑒定

2.2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞 經(jīng)過(guò)軌道搖床和傳代后，采用免疫熒光法對(duì)P1星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。如圖4所示，綠色熒光為陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性率可達(dá)97%以上。

2.2.2P0小膠質(zhì)細(xì)胞 經(jīng)過(guò)軌道搖床純化后，采用免疫熒光法對(duì)P0小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。如圖4所示，綠色熒光為陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。結(jié)果顯示純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性率可達(dá)97% 以上。

圖4 免疫熒光法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞純度(20×)Fig.4 The purity of astrocytes and microglias were identified by immunofluorescent staining(20×)

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的膠質(zhì)細(xì)胞，協(xié)同維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定。近年來(lái)，它們被廣泛作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森(parkinson,s disease, PD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, AST)、阿爾茨海默癥(alzheimer disease, AD)等的體外研究對(duì)象[5]。因此，快速、便捷獲得高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的重要前提。

目前，大部分文獻(xiàn)以大腦皮質(zhì)作為提取原代膠質(zhì)細(xì)胞的組織來(lái)源[1, 6-9]，采用脊髓進(jìn)行膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道較少，而以昆明胎鼠作為組織來(lái)源更是未見(jiàn)報(bào)道。本研究從昆明胎鼠(孕晚期)的脊髓組織中提取混合膠質(zhì)細(xì)胞，并在較短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)獲得數(shù)量多、純度高的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞?？紤]到孕晚期昆明胎鼠的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元已經(jīng)基本發(fā)育完全，而膠質(zhì)細(xì)胞正處于旺盛增殖階段。此時(shí)取材有利于得到的狀態(tài)好、污染少的膠質(zhì)細(xì)胞。

混合膠質(zhì)細(xì)胞若未經(jīng)分離、純化，通常摻雜神經(jīng)元和成纖維細(xì)胞。神經(jīng)元適合于無(wú)血清培養(yǎng)，而本研究采用的是含血清的膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，神經(jīng)元中會(huì)逐漸自然死亡。成纖維細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)條件相似，兩者會(huì)長(zhǎng)期共存，因此需要人為將其除去?，F(xiàn)有研究多采用差速貼壁法以去除成纖維細(xì)胞[9-10]，然而在實(shí)際操作中，需要精準(zhǔn)控制成纖維細(xì)胞貼壁的時(shí)間。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則部分膠質(zhì)細(xì)胞也會(huì)隨之貼壁，致使目的細(xì)胞流失；時(shí)間過(guò)短則不能有效剔除成纖維細(xì)胞，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。由于成纖維細(xì)胞來(lái)源于脊膜等粘膜結(jié)締組織，可以從源頭減少其來(lái)源。因此在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)反復(fù)摸索，調(diào)整剝離脊髓組織的方法可有效減少了成纖維細(xì)胞的來(lái)源。

在星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方面，文獻(xiàn)報(bào)道未純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞需要9～14 d才能達(dá)到90%的匯合度[11-14]，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。在本研究中，采用胰酶消化法與機(jī)械吹打提取混合膠質(zhì)細(xì)胞，采用恒溫定軌搖床結(jié)合傳代進(jìn)行除雜，無(wú)需濾網(wǎng)，手法簡(jiǎn)單，操作容易，細(xì)胞流失少，污染風(fēng)險(xiǎn)小。能在6～8 d獲得數(shù)量多、純度高的目的細(xì)胞，顯著提高了工作效率。

在小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方面，文獻(xiàn)報(bào)道的分離純化方法主要有：(1)胰酶消化法。即采用0.062 5%的胰酶作用于混合膠質(zhì)細(xì)胞，邊消化邊搖晃，減少小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)底部膠質(zhì)細(xì)胞黏附性[15]。此方法確實(shí)可去除部分雜細(xì)胞，但黏附在瓶底的星形膠質(zhì)細(xì)胞需再次經(jīng)歷胰酶消化、吹打后進(jìn)行傳代，增加了對(duì)細(xì)胞的二次損傷；(2)十字手搖法[12]，即按“十”字軌道搖動(dòng)培養(yǎng)瓶獲得小膠質(zhì)細(xì)胞；但實(shí)際操作中，操作人員不同，力度無(wú)法統(tǒng)一；力度太小，目的細(xì)胞無(wú)法脫落，力度過(guò)大，容易形成氣泡，破碎的氣泡張力又會(huì)影響細(xì)胞活力;(3)拍打法[16]，即通過(guò)拍打培養(yǎng)瓶底，促使小膠質(zhì)細(xì)胞脫落，此方法與十字手搖法一樣，難以統(tǒng)一拍打力度。在本研究采用的恒溫?fù)u床振蕩法(300 r/min，37℃，4～6 h)，條件穩(wěn)定，獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞純度高，10～12 d即可達(dá)到90%以上的匯合度。

此外，本文建立的方法簡(jiǎn)便易行，但操作時(shí)應(yīng)注意以下幾方面：(1)消化時(shí)間要適宜，時(shí)間過(guò)短獲得的細(xì)胞數(shù)量少，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易致細(xì)胞破碎死亡[17]；脊髓組織消化時(shí)間應(yīng)控制在15～20 min，星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞傳代的消化時(shí)間控制在3～5 min與1～2 min比較適宜；(2)細(xì)胞接種密度要適宜，膠質(zhì)細(xì)胞偏好聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞間彼此接觸、相互影響，促進(jìn)成熟和增殖[18]，密度過(guò)低不利于形成細(xì)胞群落，一般11～15條完整的脊髓或者接種密度大于1×108個(gè)/L能滿足要求；(3)吹打細(xì)胞要輕柔，P0代膠質(zhì)細(xì)胞非常敏感，吹打力度盡量輕柔，次數(shù)控制在10～15次；另外，吹打時(shí)吸管應(yīng)貼壁置于離心管底部，力度均勻，可減少氣泡產(chǎn)生，防止氣泡破碎產(chǎn)生的張力影響細(xì)胞活性；(4)PLL包被條件要適宜，預(yù)先用PLL包被培養(yǎng)瓶可以促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞貼壁，加快其生長(zhǎng)速度[19]；濃度過(guò)高會(huì)有游離的PLL對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害，濃度過(guò)低則起不到幫助貼壁的作用。通過(guò)摸索，本研究確定25 mg/L PLL處理T25培養(yǎng)瓶30 min效果最佳。接種15～20 min，即可見(jiàn)90%的細(xì)胞貼壁。不管是原代混合膠質(zhì)細(xì)胞，還是分離純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞，生長(zhǎng)速度均提高。

綜上，本方法可同時(shí)獲得數(shù)量多、純度高的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞，可降低實(shí)驗(yàn)成本，顯著提高實(shí)驗(yàn)效率，非常適合于膠質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)研究。期望本研究所提供的原代脊髓源星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化方法，能為相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究提供支持。