韋運(yùn)豪， 張帥， 何偉， 趙許亞， 宋杰， 周石

(貴州醫(yī)科大學(xué) 影像學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

肝癌是消化系統(tǒng)最常見的實(shí)體腫瘤，也是全球常見的惡性腫瘤[1]，在中國(guó)發(fā)病率較高，其總體死亡率僅次于肺癌[2]，且肝癌的進(jìn)展涉及復(fù)雜的病理和生理過程[3]。隨著生物療法的發(fā)展，已經(jīng)表明針對(duì)腫瘤的靶向治療具有高效率、低毒副作用[4]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells, CIK)具有主要組織相容性復(fù)合體不受限制的抗腫瘤活性[5]，并且屬于細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的CD3、CD56子集[6]。CIK細(xì)胞在腫瘤治療中的應(yīng)用有助于對(duì)殘留的微小病變或轉(zhuǎn)移性腫瘤的清除，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，提高了患者的免疫力，成為腫瘤免疫治療的首選方式[7]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是一種特異性的腫瘤殺傷細(xì)胞，它有助于調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的免疫功能。除了誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖外，DC還可以通過直接或間接的方式促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和活化，從而通過調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤中發(fā)揮重要作用[8]。前期的研究顯示CIK細(xì)胞和DC的共培養(yǎng)有利于細(xì)胞增殖并增強(qiáng)免疫功能[9]，但并未應(yīng)用于肝癌的治療研究中，本研究主要探討DC聯(lián)合CIK治療在大鼠肝癌模型中的作用及其對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)，以期為肝癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠45只、2月齡、SPF等級(jí)、體質(zhì)量(250±20)g，由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在室溫(21±1)℃、相對(duì)濕度50%～70%，光照/黑暗周期為12 h/12 h的環(huán)境中飼養(yǎng)，該研究方案通過學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑和耗材 RH-35腫瘤細(xì)胞(ATCC Cell Bank，Manassas，VA，USA)，F(xiàn)icon淋巴細(xì)胞分離緩沖液(Haoyang Bio，廣東省廣州市，中國(guó))，戊巴比妥鈉和利多卡(昭輝藥業(yè)，上海，中國(guó))，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(Pall Life Sciences，Port Washington，NY，USA)，蛋白質(zhì)印跡試劑(Beyotime，北京，中國(guó))， ECL試劑(Amersham Biosciences；Little Chalfont，UK)，兔抗人Bcl-2單克隆抗體，兔抗人單克隆抗體，山羊抗兔辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的IgG二抗(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)。IFN-γ、重組人GM-CSF、IL-4、IL-2、IL-1及抗CD3單克隆抗體(Life Technology，Waltham，MA，USA)，用于IFN-γ、IL-4和TNF-α的ELISA試劑盒(B&D，；San Jose, CA, USA)，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Axygen，Waltham，MA，USA)，酶標(biāo)儀(BD，San Jose，CA，USA)。ABI7500熒光定量PCR(ABI，Waltham，MA，USA)，所有細(xì)胞株均在添加有10%胎牛血清，100 ug/mL鏈霉素和100 000 U/L青霉素(pH 7.2～7.4)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37 ℃、5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物的分組和治療 將大鼠腫瘤細(xì)胞RH-35制備為1×1011/L懸浮液，并原位接種在大鼠肝被膜下方0.04 mL[10]。2周后，將45只肝癌模型大鼠隨機(jī)均分別為對(duì)照組、CIK組(接受自體移植CIK回輸)和DC+CIK組(接受自體移植CIK和DC回輸)。

1.2.2自體CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞的制備及回輸 在無菌條件下從鼠尾靜脈收集1.5 mL血液樣本保存在肝素處理過的試管中，F(xiàn)icon淋巴細(xì)胞分離緩沖液用于分離PBMC。用RMPI-1640洗滌后，將細(xì)胞用自體血清重新分類，以2×109/L計(jì)數(shù)細(xì)胞的濃度接種到6孔板中，依次添加IFN-γ 1 000 U、IL-2 300 U、IL-1 100 U和抗CD3單克隆抗體50 μg/L，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，使細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)濃度達(dá)到2×1011/L。DC細(xì)胞常規(guī)采血制備過程同前，隨后在37 ℃，5%CO2的潮濕箱中孵育2 h， 棄去上清液以獲得附著的細(xì)胞；加入含有1 000 000 U/L重組人GM-CSF和500 000 U/L IL-4的新鮮培養(yǎng)基。 每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，在第7天收集懸浮細(xì)胞作為DC。在CIK組中，通過加入無菌鹽水將CIK細(xì)胞制成2.5 mL懸浮液，并通過尾靜脈回輸給大鼠[10]；在DC+CIK聯(lián)合組中，將自體CIK細(xì)胞和DC以5 ∶1的比例混合，并制備成2.5 mL細(xì)胞懸液，然后通過尾靜脈將其回輸至大鼠[10]。

1.2.3觀察腫瘤生長(zhǎng)及樣本的收集 腫瘤種植后，分別于治療后1、4、7、10、13 d觀察腫瘤的生長(zhǎng)，測(cè)量大鼠腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑(mm)，并通過長(zhǎng)徑×短徑計(jì)算腫瘤的面積；通過真空管收集腹主動(dòng)脈血樣，在室溫靜置30 min后離心(3 600 r/min、4 ℃、10 min)，收集上清，用于上機(jī)檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST) 、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)和白蛋白(albumin, ALB)指標(biāo)；兩周后處死大鼠收集肝腫瘤組織并儲(chǔ)存在-80 ℃下超低溫冰箱。

1.2.4ELISA法檢測(cè)IFN-γ、IL-4和TNF-α的分泌水平 按照測(cè)試試劑盒的說明書，使用ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血清樣品的IFN-γ、IL-4和TNF-α水平?；跇?biāo)準(zhǔn)濃度和相應(yīng)的OD值計(jì)算線性回歸函數(shù)，利用OD值計(jì)算樣品濃度。

1.2.5實(shí)時(shí)PCR測(cè)量Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá) 用TRIzol試劑提取腫瘤組織總RNA，根據(jù)測(cè)試試劑盒說明書，通過反轉(zhuǎn)錄合成總DNA。使用Primer 6.0軟件根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)引物，并由Sangon(上海，中國(guó))合成，見表1。在以下條件下對(duì)靶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR：55 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含92 ℃ 30 s、58 ℃ 45 s和72 ℃ 35 s，通過ABI 7500熒光定量PCR循環(huán)儀和內(nèi)置軟件收集數(shù)據(jù)。以Gapdh為參考，進(jìn)行熒光定量以計(jì)算所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的CT值。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行半定量分析。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡測(cè)量Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 從各組中獲取的腫瘤組織，添加裂解緩沖液以在冰上使細(xì)胞破裂15～30 min，同時(shí)進(jìn)行超聲處理(5 s，4次)；將混合物在4 ℃下以10 000 g離心15 min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并在-20 ℃下保存。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，然后通過半干法將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉去除非特異性結(jié)合位點(diǎn)2 h；加入兔抗人Bcl-2(1 ∶1 000)或抗人Bax單克隆抗體(1 ∶1 500)，在4 ℃下過夜孵育；磷酸鹽緩沖鹽水和Tween 20(PBST)洗滌后，添加山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)在室溫下孵育30 min；加入ECL試劑使膜顯影，然后進(jìn)行X射線曝光。通過蛋白質(zhì)成像系統(tǒng)和Quantity One軟件(Hercules，CA，USA)獲得用于測(cè)量條帶密度的結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝癌腫瘤生長(zhǎng)

肝癌腫瘤生長(zhǎng)情況見圖1，比較3組腫瘤大小，結(jié)果顯示于治療后的第10和第13天時(shí)CIK治療組和DC+CIK聯(lián)合治療組腫瘤面積均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且DC+CIK聯(lián)合療法組的腫瘤面積低于單純CIK治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2) 與CIK組比較，P<0.05。圖1 DC+CIK聯(lián)合治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of DC+CIK combined treatment on tumor growth

2.2 血清ALT、AST、TBIL和ALB水平

治療2周后，與對(duì)照組比較，CIK組和DC+CIK組大鼠血清肝功能檢查發(fā)現(xiàn)，CIK治療組和DC+CIK聯(lián)合治療組AST、 ALT、TBIL及 ALB水平降低(均P<0.05)；且DC+CIK組比CIK組對(duì)肝功能的恢復(fù)更好(P<0.05)，見表2。結(jié)果表明DC+CIK聯(lián)合療法促進(jìn)了癌癥模型大鼠肝功能的恢復(fù)。

表2 治療2周后各組大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL和ALBTab.2 ALT, AST, TBIL, and ALB in liver function indexes of rats at 2 weeks after the treatment

2.3 血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平

治療2周后，CIK組和DC+CIK組與對(duì)照組比較，血清IFN-γ、IL-4和TNF-α的水平均升高(P<0.05)；而與CIK組比較，DC+CIK組上述指標(biāo)升高則更明顯(P<0.05)。見圖2。 提示CIK+DC聯(lián)合療法可促進(jìn)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，并發(fā)揮抗腫瘤作用。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與CIK組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平Fig.2 The levels of serum IFN-γ, IL-4,and TNF-α of rats in each group

2.4 肝癌組織Bcl-2、Bax表達(dá)

治療2周后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)各組大鼠肝癌組織中Bcl-2、Bax的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CIK組和DC+CIK組較對(duì)照組顯著抑制腫瘤組織中Bcl-2的水平，并增強(qiáng)Bax的表達(dá)(P<0.05)。與CIK組比較，DC+CIK聯(lián)合治療對(duì)Bcl-2水平的抑制作用和對(duì)Bax表達(dá)的增強(qiáng)作用更明顯(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與CIK組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠肝癌組織中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)Fig.3 Expression of Bcl-2 and Bax mRNA in liver cancer tissues of rats in each group

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與CIK組比較，P<0.05。圖4 各組大鼠肝癌組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of Bcl-2 and Bax protein in liver cancer tissues of rats in each group

3 討論

目前肝癌的治療手段包括外科手術(shù)、放化療和介入療法[11]。然而，所有這些療法的療效均令人不甚滿意，例如高頻率的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移頻率導(dǎo)致其預(yù)后較差，因此，抗肝癌試劑的研發(fā)對(duì)于提高治療效果至關(guān)重要[12]。免疫療法是一種新興的腫瘤治療方法，IL-2、IFN-γ和CD3單克隆抗體誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞，除了其主要組織相容性復(fù)合體不受限制的溶瘤作用外，它還具有集中在腫瘤部位發(fā)揮特異性抗腫瘤的作用[13]。目前的研究表明，與其他免疫治療細(xì)胞(例如LAK或CD3AK)相比，CIK細(xì)胞在體內(nèi)能有效增殖，以及能夠大量分泌具有腫瘤殺傷作用特性的細(xì)胞因子，而這與外源性IL-2細(xì)胞因子的刺激和抑制無關(guān)，且沒有毒性作用[14]。單獨(dú)使用CIK細(xì)胞療法或與化學(xué)療法聯(lián)合使用時(shí)，CIK細(xì)胞療法在乳腺癌、肺癌或結(jié)腸癌中已顯示出令人滿意的療效[15]。故本研究以CIK治療為切入點(diǎn)，探討其在大鼠肝癌模型中的作用。

DC是最有效的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)，并且是激活初級(jí)T細(xì)胞的唯一APC亞型，它可以通過直接或間接途徑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化。研究人員發(fā)現(xiàn)，DC可以顯著增強(qiáng)CIK細(xì)胞的增殖并加速其成熟[16]。因此，DC與CIK細(xì)胞的結(jié)合可進(jìn)行有效的細(xì)胞毒性作用，并對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)發(fā)揮協(xié)同作用[17]。然而，DC+CIK治療在大鼠肝癌模型中的功能和免疫調(diào)節(jié)作用尚未闡明。因此，本研究首先通過體內(nèi)腫瘤細(xì)胞移植，建立了大鼠肝癌模型，然后回輸自體DC、CIK細(xì)胞。本研究的數(shù)據(jù)顯示，DC+CIK聯(lián)合療法可顯著縮小腫瘤大小并改善肝功能指標(biāo)，這表明自體CIK和DC聯(lián)合療法除了能協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤的作用，而且還可以讓肝功能得到一定程度的恢復(fù)。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，DC+CIK聯(lián)合療法可提高肝癌大鼠血清中的IFN-γ、IL-4和TNF-α的表達(dá)水平。作為細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要調(diào)控因子，IFN-γ可以促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，而IL-4可以誘導(dǎo)Th0細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞。 Th1和Th2細(xì)胞分別參與細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[18]。因此，本研究的結(jié)果表明，DC+CIK聯(lián)合療法可在腫瘤抑制過程中上調(diào)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。Bcl-2的過表達(dá)和Bax的抑制與肝癌細(xì)胞的抗凋亡/凋亡失衡密切相關(guān)，因?yàn)檫@種平衡的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性異常[19]。本實(shí)驗(yàn)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的研究表明，DC+CIK聯(lián)合療法在肝癌組織中降低了Bcl-2的表達(dá)的同時(shí)，也增強(qiáng)了Bax的表達(dá)，表明通過促凋亡功能產(chǎn)生的抗腫瘤作用，這與先前一些學(xué)者的報(bào)道一致[20]。

綜上所述，DC+CIK聯(lián)合療法可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和抗凋亡的平衡，同時(shí)能夠改善人體免疫功能并發(fā)揮抗腫瘤的作用，這比單獨(dú)使用CIK具有更好的療效，其可能為將來肝癌提供一種新型生物療法的治療策略。